速凍水餃中金黃色葡萄球菌分離株的生物被膜形成能力

林儀,賴嘉琦,徐慧青,高志恒,林靖榆,李云

(韓山師范學院 生命科學與食品工程學院,廣東 潮州,521041)

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是一種革蘭氏陽性、兼性厭氧、凝固酶陽性的葡萄球菌,常見于人類的生活環境。金葡菌能適應較寬的溫度和pH范圍,以及具有耐鹽的特性,使其能耐受食品加工過程中的選擇性壓力,在各種食品中生長和存活[1]。金葡菌污染食品后可產生多種毒素,特別是耐熱性腸毒素,在食品熱加工的溫度下依然能保持毒性,殘留于食品中引起人食物中毒。當食品中金葡菌濃度超過105CFU/g時,產生的腸毒可導致人食物中毒[2]。金葡菌及其產生的腸毒素污染已成為影響相關食品安全的關鍵因素之一,控制和預防食品原料和加工過程中金葡菌的殘留,對降低微生物安全風險,確保食品中微生物安全有重要的意義。

生物被膜是細菌附著于表面或界面的一種生存模式。生物被膜是細菌附著后形成的一種復雜的細胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)結構,為包裹于其中的菌體形成微菌落,免受不利環境條件影響,以及后期膜內菌體擴散的重新定居提供了一個安全和保護性的環境[3]。金葡菌具有很強的生物被膜形成能力,在食品加工環境中,金葡菌生物被膜保護菌體定殖于與食品物料接觸的設備表面或管道中,形成生物被膜群落。從目前不同食品中金葡菌分離株被膜形成的研究來看,蛋白質含量高的動物原料食品中報道的較多,如乳品[4]、水產品[5]、肉品[6]等。金葡菌在食品接觸面上形成的生物被膜會污染產品,導致產品貨架期降低和食源性疾病,對食品安全構成了巨大的風險。

速凍水餃是速凍面米制品中主要的產品類型,其產量和消費量在相關食品中位居前列[7]。速凍水餃營養成分豐富,且水分活度較高,容易受到微生物污染而帶來食品安全問題。金葡菌是速凍水餃產品中常檢出的污染菌,由于其較強的耐低溫存活的特性,在-18 ℃的冷鏈溫度下,仍能存活很長時間[8]。此外,速凍產品在實際運輸、貯藏、銷售和消費者購買過程中,很容易出現溫度波動,如反復凍融,從而導致金葡菌數量增加[9]。因此,在食品加工過程中盡量減少金葡菌的污染,控制出廠產品中菌體濃度在較低的水平,即遠低于其產腸毒素的條件濃度,最大限度地降低中毒風險,是保障速凍水餃食品安全的關鍵。

生物被膜的形成和發展與菌株攜帶的被膜相關基因和材料的表面性質有關,同時也受加工過程環境條件的影響。此外,被膜形成后增加膜內細菌的抗性,如何有效消殺設備等表面的金葡菌,對降低產品中金葡菌食品安全風險有重要的意義。目前關于速凍食品中金葡菌生物被膜的研究較少,較缺乏上述相關方面的信息。本研究以從速凍水餃產品中分離的金葡菌菌株為研究對象,評估其在聚苯乙烯和不銹鋼表面形成生物被膜的能力,研究編碼被膜形成的相關基因在分離株中的分布特性,并考察溫度、pH和NaCl濃度等環境因素對菌株形成被膜的影響,最后研究成熟生物被膜對常用消毒劑的抗性作用,以期為了解速凍水餃中金葡菌形成生物被膜的特性、明確環境條件對被膜形成的影響、在實際生產中防治生物被膜、降低食品安全風險提供基礎數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

24孔和96孔細胞培養板(聚苯乙烯材質),美國康寧Corning公司;不銹鋼片(304不銹鋼2B板,尺寸10 mm×10 mm,厚度1 mm);HiPure Bacterial DNA抽提試劑盒,廣州美基生物科技有限公司;ExTaq酶,日本Takara公司;其余試劑為均為分析純。

1.2 菌種和培養基

1.2.1 菌種

金黃色葡萄球菌ATCC43300和ATCC25923,作為標準菌株用于生物被膜形成能力實驗。金葡菌待測分離株,采用GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》的方法分離自市售速凍水餃樣品,實驗鑒定為凝固酶陽性的葡萄球菌菌株,并經16S rDNA基因擴增測序[10]鑒定為金黃色葡萄球菌。

1.2.2 培養基

胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)培養基(g/L):胰蛋白胨17,大豆蛋白胨3,葡萄糖2.5,NaCl 5,K2HPO42.5,pH值7.3±0.2,121 ℃滅菌15 min。TSB用于菌株的活化、培養及被膜形成實驗。TSB中加入無菌甘油至體積分數為20%,用于菌株的甘油管保藏。D/E中和肉湯作為消毒劑實驗中的中和劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 結晶紫染色法測定生物被膜形成能力

生物被膜形成能力測定參考DI CICCIO等[11]描述的結晶紫染色法,并做適當修改。24孔聚苯乙烯培養板(底面積為2 cm2)和304不銹鋼片(面積為1 cm2)分別用作在聚苯乙烯和不銹鋼表面被膜形成能力試驗。菌液稀釋液的準備:甘油管保藏菌株按1%接種量接種至5 mL TSB培養基,37 ℃、150 r/min培養16～24 h,用TSB稀釋,得濃度約為106CFU/mL的菌液稀釋液。將500 μL菌液稀釋液分別加入到24孔板和預先放入滅菌不銹鋼片的24孔板中,于37 ℃培養24 h以形成生物被膜。每個菌株做4個重復,以不加菌的500 μL TSB培養基作為空白對照。培養后參考文獻[11]中的方法進行被膜固定、結晶紫染色和冰乙酸脫色,最后取200 μL的冰乙酸脫色液轉移到新的96孔板中,于570 nm下測定吸光度值。以生物被膜形成指數(biofilm production indices,BPI)表示菌株形成生物被膜的能力,BPI定義為單位面積(1 cm2)上去除空白對照后的吸光度值,如公式(1)所示:

(1)

式中:AS表示菌株測定吸光度的平均值;A0表示空白測定吸光度的平均值;S表示被膜形成表面的面積,cm2。

1.3.2 生物被膜形成相關基因的檢測

DNA的提取:甘油管保藏的各待測菌株按1%的接種量接種于TSB培養基,于37 ℃、150 r/min搖床條件下培養16 h,取1 mL培養后的菌液,采用HiPure Bacterial DNA抽提試劑盒提取DNA。

參照TANG等[12]描述的方法,采用特異性引物擴增各生物被膜相關基因,引物序列及退火溫度如表1所示。PCR反應體系50 μL,其中:10×buffer 5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL,正向和反向引物(10 μmol/L)各1 μL,模版DNA(>50 ng/μL) 1 μL,ExTaq(5 U/μL) 0.25 μL。PCR反應條件包括,95 ℃預變性5 min,然后進行35個循環的如下擴增:95 ℃變性30 s、各引物的退火溫度下退火50 s、72 ℃延伸60 s,最后72 ℃終延伸6 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離,GelRed染色后,在紫外下拍照,對照DNA分子質量標準判定擴增產物的大小。隨機選擇各待測基因陽性結果的PCR產物,測序后進行確認。

表1 生物被膜相關基因PCR檢測所用的引物與反應條件Table 1 Primers and reaction conditions for PCR detection of biofilm-related genes

1.3.3 環境因素對生物被膜形成的影響

采用結晶紫染色法測定不同環境條件(溫度、pH、NaCl濃度)對不銹鋼表面生物被膜形成的影響。溫度的影響分別在15、25、37 ℃培養24 h后測定。分別配制不同pH和NaCl濃度的TSB培養基,用于不銹鋼表面生物被膜形成試驗,考查pH和NaCl濃度的影響。

1.3.4 消毒劑對生物被膜的清除作用

參考CAMPANA等[13]方法測定最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC)和最小生物被膜清除濃度(minimal biofilm eradication concentration,MBEC)。MBEC測定以不銹鋼片上形成的48 h成熟生物被膜作為被處理樣品,測定消毒劑對生物被膜中菌體的清除效果。

1.3.5 數據處理與統計分析

數據結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22軟件(IBM公司)對實驗結果進行統計分析,統計顯著性采用單因素方差分析(ANOVA),通過事后最小顯著性差異(least significant difference,LSD)檢驗方差的同質性。采用皮爾遜相關性分析(Pearson’s correlation)評價黏附基因與被膜形成能力的相關性。

2 結果與分析

2.1 不同材料表面生物被膜形成能力

本研究選擇了不銹鋼和聚苯乙烯兩種表面材料。不銹鋼是加工設備表面最常用的材料,屬于親水性。聚苯乙烯(PS塑料)是食品加工中常用的代表性聚合物材料之一,常用于食品包裝或物料盛裝容器的制造材料,屬于疏水性。通過對兩種材料的結果進行歸一化處理,以BPI值代表被膜的形成能力,使得在不同材料上的實驗結果可比較,以便于考察菌株在兩種材料上形成被膜能力的差異。如圖1所示,所有測試的分離株都可以形成生物被膜,但各菌株形成生物被膜的能力呈現差異。在聚苯乙烯表面上,除HQ3、SG23、HR33、XP8外,其余分離株形成被膜能力較弱,它們在24 h和48 h的BPI值均小于0.2,低于參考菌株ATCC43300形成被膜的量;其中分離株SN12和JZM7形成被膜的量最少,BPI值在0.05以下。在形成被膜能力較強的4個分離株中,HQ3和HR33形成能力最強,在24 h 和48 h都顯著高于參考菌株ATCC25923(P<0.05),SG23和XP8的被膜形成能力顯著高于參考菌株ATCC43300(P<0.05)。在不銹鋼表面上,所有菌株都形成了較強的生物被膜,BPI值均大于0.2;各菌株之間形成被膜能力有較大的差異,其中HQ3、SG23和HR33的形成能力最強,并且顯著高于參考菌株ATCC25923(P<0.05);分離株SN31和SN12能力最弱,在24 h和48 h時間形成被膜量與參考菌株ATCC43300相比無顯著性差異(P>0.05)。

a-聚苯乙烯;b-不銹鋼圖1 金黃色葡萄球菌分離株在聚苯乙烯和不銹鋼表面形成生物被膜的能力Fig.1 Biofilm formation ability of Staphylococcus aureus isolates on the surface of polystyrene and stainless steel注:圖中小寫字母和大寫字母分別表示24 h和48 h時菌株形成生物被膜的顯著性差異,菌株的不同字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

從不同材料表面的結果來看,金葡菌分離株在兩種表面材料上的生物被膜形成特性不同,所有測試的分離株在聚苯乙烯表面形成被膜的BPI值均顯著低于其在不銹鋼表面的值(P<0.05),表明它們在不銹鋼表面更容易形成生物量高的被膜。而參考菌株ATCC43300和ATCC25923在兩種材料表面形成被膜量的差異較小,特別是菌株ATCC43300在兩種材料表面形成被膜無顯著性差異(P>0.05)。速凍水餃中金葡菌分離株在不銹鋼表面上的強生物被膜形成能力,有助于菌體在加工設備表面持久性存活,表明設備不銹鋼表面上形成的被膜很可能是金葡菌在加工過程中重要的貯存宿主。從不同菌株間比較來看,在聚苯乙烯表面形成較強生物被膜的菌株,如HQ3、HR33、SG23和XP8,相較于其他菌株,在不銹鋼上也能形成較高生物量的被膜。從不同時間的影響來看,在聚苯乙烯表面,除SG23外,其余分離株在24 h和48 h形成的生物被膜無顯著性差異(P>0.05),而在不銹鋼上,所有分離株在24 h和48 h形成的生物被膜無顯著性差異(P>0.05),表明24 h內各分離株已完成了被膜形成的主要過程,形成了較成熟的生物被膜。

2.2 生物被膜形成相關基因的檢測

生物被膜形成相關基因檢測結果見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033356)。各分離株中至少能檢出4種以上的被膜形成相關基因,其中eno和clfB基因是分離株中最普遍存在的基因,檢出率100%,而bap基因在所有菌株都未被檢測到。其他被膜形成相關基因的檢出率:fnbA為50%,fnbB為70%,sasG為65%,fib為35%,clfA為25%,ebps為15%,can為15%,bbp為25%,icaAD和icaBC均為15%。從各基因的檢出率與生物被膜形成能力的相關性來看,在不銹鋼表面,sasG與生物被膜形成呈極顯著的正相關(P<0.01),clfA和fnbA呈顯著正相關(P<0.05),而icaAD、icaBC和fib呈極顯著的負相關(P<0.01);在聚苯乙烯表面,sasG呈顯著正相關(P<0.05),fib呈顯著負相關(P<0.05)。根據分離株被膜相關基因的檢測結果,可將分離株分為6種類型(附表1),選取SN12、JM3、QH6、HQ3、HR33和XP8作為各類型的代表菌株,進行實驗考察環境條件對生物被膜形成的影響。

2.3 溫度對生物被膜形成的影響

6種生物被膜黏附基因類型的代表菌株SN12、JM3、QH6、HQ3、HR33和XP8,在不同溫度下形成生物被膜的結果如圖2所示。從總體上看,在金葡菌生長的最佳溫度為37 ℃時,各分離株都呈現出最高的BPI均值,表明生長最佳溫度有利于形成更多的生物被膜。在室溫25 ℃條件下,菌株HR33和XP8形成的被膜生物量與它們在37 ℃下相比無顯著性差異(P>0.05),而其余的4個菌株25 ℃形成的被膜比37 ℃時有所降低,但依然能保持65%～88%的生物量。在15 ℃時,所有6個菌株均能檢測到生物被膜的形成,除SN12形成被膜量較小外,其余5個菌株形成被膜的生物量可達到37 ℃時的29%～36%。

圖2 溫度對生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of temperature on biofilm formation

2.4 pH對生物被膜形成的影響

如圖3所示,環境pH值對生物被膜的形成有明顯影響。所有測試的6個菌株在pH 7時達到了最高的BPI值,從而表明中性pH環境最有利于附著在不銹鋼上形成生物被膜。當pH值為6和8時,生物被膜形成較pH 7時有所降低,菌株JM3、HQ3、HR33在pH 6和pH 8時所形成的被膜生物量與在pH 7時無顯著性差異(P>0.05),但仍然保持了較高的生物量,表明弱酸性和弱堿性條件下,菌株受到的影響較小,仍能形成較多的生物被膜。當pH值為5時,各菌株被膜生物量呈現出大幅度的降低,pH 5時的被膜量均為pH 7時的50%左右或更低。當pH值為4,所有菌株都未觀察到被膜形成,表明酸度的增加能顯著抑制被膜的形成。在pH 9時,可觀察到和pH 5時類似的趨勢,但各菌株依然能形成一定的被膜,pH 9時形成的被膜量為pH 7時的46.9%～65.1%。

圖3 pH對生物被膜形成的影響Fig.3 Effect of pH on biofilm formation

2.5 NaCl濃度對生物被膜形成的影響

圖4顯示了不同NaCl濃度對生物被膜形成的影響。當NaCl質量分數從0增加到1%時,可觀察到菌株SN12、HQ3、HR33和XP8的生物被膜增加,而對菌株JM3和QH6沒有顯著影響(P>0.05)。當NaCl質量分數從1%進一步增加時,除菌株HQ3外,其余5個菌株的被膜生物量都增加。當質量分數達到4%時,菌株SN12、HR33、XP8、QH6被膜生物量達到最大。當質量分數為5%時,所有菌株被膜生物量出現降低的趨勢,但依然高于不加NaCl的對照。當質量分數>6%時,所有菌株被膜的量與不加NaCl的對照相比,未觀察到顯著增加;有些菌株的被膜生物量在質量分數為8%時還出現了降低,表明過高的質量分數有抑制作用。以上的結果表明,在低濃度(質量分數<5%)的NaCl條件下,可以增強分離株在不銹鋼表面形成生物被膜,對被膜的形成有一定的刺激作用。

圖4 NaCl對生物被膜形成的影響Fig.4 Effect of the concentration of NaCl on biofilm formation

2.6 消毒劑對生物被膜的清除作用

圖5比較了常用工業消毒劑次氯酸鈉、過氧乙酸和苯扎溴銨對6種被膜基因型代表株的浮游菌體和生物被膜細胞的殺滅作用。雖然不同菌株對消毒劑的耐受程度有所不同,但從總體來看,生物被膜的形成在很大程度上提高了膜內菌體對消毒劑的耐受性,3種消毒劑處理被膜菌體的MBEC相比處理浮游細胞的MBC,分別提高了15～20倍(次氯酸鈉)、6～10倍(過氧乙酸)和5～12倍(苯扎溴銨)。從3種消毒劑對被膜細胞殺滅效果來看,過氧乙酸的效果最好,能在較低的質量濃度下(2 000～4 000 mg/L)有效殺滅膜內細胞。6個測試菌株與標準菌株ATCC25923相比,MBC值較接近,而MBEC值呈現出不同程度的增加,表明分離株形成的生物被膜更能保護其中的菌體耐受消毒劑的殺滅作用。

3 討論

3.1 生物被膜相關基因

本研究中對13個被膜相關基因進行了檢測,結果表明eno和clfB基因在全部分離株中均被檢出,該結果與下列文獻報道的較為一致。SHARMA等[14]研究了來源于生牛奶的金葡菌分離株被膜基因,發現eno在所有菌株中均為陽性,clfB的檢出率為93%。TANG等[12]檢測了不同食品來源的金葡菌分離株被膜基因,clfB和sasG的檢出率為100%,eno為93.75%。金黃色葡萄球菌表面結合蛋白(Staphylococcusaureussurface binding protein,sasG)是一種促進細胞間相互作用的表面蛋白,與非生物表面附著有關[15-16]。本研究中sasG的檢出率為65%,并且與不銹鋼表面被膜形成呈極顯著的正相關(P<0.01),與聚苯乙烯表面被膜形成呈顯著正相關(P<0.05),表明其在非生物表面的強生物被膜形成中有重要的作用。根據EPS的組成,金葡菌生物被膜可分為兩大類:由多糖基質組成的生物被膜和含有蛋白質基質的生物被膜[17-18]。多糖基質組成的生物被膜中,多糖的主體成分由多糖細胞間黏附素(polysaccharide intercellular adhesins,PIA)組成,PIA的合成依賴于細胞內黏附(ica)操縱子調控[19]。本研究中icaAD和icaBC的檢出率為15%,并且ica攜帶菌株只能形成較弱的被膜,表明分離株被膜主要由蛋白質基質構成,即不依賴PIA的生物被膜。除了在初始黏附中起到作用外,纖維連接蛋白結合蛋白A(fnbA)和B(fnbB)被認為能在蛋白基質生物被膜中起到促進細胞間相互作用、增加被膜形成的作用[20]。本研究結果從側面證實了這種觀點,在基因檢測結果中,fnbA和fnbB基因檢出率分別為50%和70%,而且在ica陽性的菌株中均未檢出這兩個基因,表明fnbA和fnbB基因在能形成蛋白基質被膜的菌株中較普遍存在。

3.2 環境因素對被膜形成的影響

本研究溫度影響的結果表明,37 ℃時BPI均值最高,25 ℃時仍能保持較高的被膜生物量,特別是高產被膜菌株HR33和XP8,在兩個溫度下被膜生物量無顯著性差異。而15 ℃時所有測試菌株的被膜生物量顯著減少。類似的結果出現在PAGEDAR等[21]對乳品來源的金葡菌分離株的研究中,該研究報道在25 ℃時不銹鋼上形成被膜的細胞數高于37 ℃時,而在12.5 ℃時,被膜形成顯著減少。25 ℃常溫是食品加工環境常見的溫度條件,金葡菌分離株在該溫度下具有良好的在不銹鋼表面形成被膜的能力,可能是由于加工過程環境溫度長期的選擇壓力,有助于菌體持久存活于加工設備表面等環境中,從而增加了最終產品中的污染。本研究中pH的影響結果表明,金葡菌分離株在弱酸性和弱堿性條件下,菌株受到的影響較小,仍能形成較多的生物被膜。ARCE MIRANDA等[22]研究臨床金葡菌分離株在96孔板上形成被膜中pH的影響,報道弱酸性條件比堿性條件更能促進生物被膜的形成。與本研究中結果不同原因可能是由于實驗所使用的黏附材料不同,pH的變化導致細胞表面帶電荷的變化,從而在不同的材料表面反映出不同的結果。本研究觀察到在低質量分數(<5%)的NaCl條件下,可顯著增強金葡菌分離株形成生物被膜。KIM等[23]研究了不同來源的金葡菌株形成被膜時NaCl的影響,報道了當在5%(質量分數)NaCl的條件下,生物被膜形成活性大于任何其他NaCl濃度和不加NaCl的對照組,與本研究中觀察到結果相類似。食鹽是水餃餡料中主要的調味成分,使得加工過程中與物料接觸面處于低濃度NaCl的環境中,為金葡菌在表面形成生物被膜提供了條件。

3.3 消毒劑的抗性

食品加工過程中對設備表面進行消毒清洗是常用的保持加工過程衛生和降低微生物殘留的方法。本研究試驗了3種常用消毒劑對分離株成熟生物被膜中菌體的殺滅效果,結果表明分離株一旦形成成熟的生物被膜后,對消毒劑的抗性有很大程度的增加,與浮游細胞相比,成熟被膜內細胞對3種消毒劑最小殺滅濃度分別提高了15～20倍(次氯酸鈉)、6～10倍(過氧乙酸)和5～12倍(苯扎溴銨)。這就意味著要保持良好的消毒效果,需使用更高濃度的消毒劑,然而高濃度消毒劑的使用可能會帶來設備表面腐蝕、終端產品中消毒劑殘留等問題。從3種消毒劑對被膜中細胞的殺滅效果來看,過氧乙酸在較低的濃度下能起到較好的殺滅作用。過氧乙酸作為強氧化性消毒劑,除對鋁和銅表面外,對食品工業中常用的材料表面如不銹鋼、玻璃、聚氯乙烯等兼容性較好,腐蝕性小[24]。此外,其分解產物為乙酸、氧氣和水,殘留物安全無毒,是處理有生物被膜材料表面較理想的消毒劑。本研究的結果還觀察到,與參考菌株ATCC25923相比,分離株形成的生物被膜對消毒劑的耐受性更高。這種現象可能的原因是,在實際生產中使用低于MBEC的消毒劑對菌株產生的選擇作用,增加了菌株形成生物被膜對消毒劑的耐藥性。因此在實際應用中,每次應采用足量的劑量,或者輪換使用和組合使用不同消毒劑,可減少菌株產生耐藥性的風險。

4 結論

本文研究了速凍水餃金葡菌分離株生物被膜形成能力,發現分離株能在不銹鋼表面形成更強的生物被膜,表明設備不銹鋼表面上形成的被膜很可能是金葡菌在加工過程中重要的貯存宿主,導致了金葡菌的污染。黏附基因檢測研究中發現ica檢出率較低,且與不銹鋼表面被膜形成呈顯著負相關,表明分離株在不銹鋼上主要形成不依賴PIA的生物被膜。環境條件影響方面,常溫25 ℃時仍形成較多生物量的被膜,低質量分數(<5%)的NaCl對被膜形成有一定的刺激作用。被膜的形成能在很大程度上提高膜內細胞對消毒劑的抗性,過氧乙酸對生物被膜內菌體殺滅效果最好。本文在速凍水餃中金葡菌生物被膜研究上作了有意義的嘗試,為更好地了解生物被膜的形成特性、環境的影響、對消毒劑的抗性作用提供了基礎數據,后續研究有待于進一步解析金葡菌在模擬食品加工廠的條件下如何完成初始附著和形成生物被膜,有針對性地篩選消毒和清除被膜的方法,為控制和降低金葡菌生物被膜危害提供基礎。