乳酸保鮮即食濕面致腐微生物及生長特性分析

張巧真,丁雅楠,顧豐穎,郭芹,屈陽,李甜,王鋒,王強

(中國農業科學院 農產品加工研究所,農業農村部農產品加工重點實驗室,北京,100193)

面條是我國的傳統主食,每年大約有40%的小麥粉用于制作面條[1],面條種類繁多,根據不同的生產工藝可以分為生面條和熟面條兩大類,熟面條中的即食濕面,也稱為LL面(long life noodles)、方便濕面、保鮮濕面、濕法方便面等,是一種經真空和面、熟化、壓延、切條、蒸煮、水洗、酸浸、包裝、巴氏殺菌等工藝制備而成開袋即食的熟濕面。即食濕面因水分含量高于60%,會造成微生物快速繁殖,導致產品腐敗,因此工業化生產中主要采用乳酸或其他有機酸浸泡提高面條的酸度,從而達到抑制微生物的生長和延長貨架期的目的[2]。即食濕面因其含水量高、非油炸、口感爽滑筋道、攜帶和食用方便、保質期長等特點逐漸受到消費者的青睞,但生產加工中高濃度有機酸保鮮處理后的面條往往有明顯的酸味,部分消費者難以接受,影響乳酸保鮮即食濕面的市場推廣。降低面條酸度、提升口感,是酸性乳酸保鮮即食濕面的產業化需求。

目前,乳酸等有機酸保鮮即食濕面的相關研究主要集中在其對即食濕面品質和保質期的影響上,對于乳酸保鮮即食濕面致腐微生物的研究較少,乳酸處理后即食濕面的保質期明顯延長,但對其感官屬性存在一定的負面影響[3-4]。有研究發現導致熟面腐敗的細菌菌群主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[5],通過對分離菌株的形態學和生化鑒定獲得了多株自制即食濕面中的主要致腐微生物(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌)[6],但目前研究未對傳統工業化生產乳酸保鮮即食濕面中腐敗菌鑒定到種水平,其生長特性尚不清楚。

本研究對工業化生產乳酸保鮮即食濕面中的致腐微生物進行多樣性分析,結合傳統分離培養方法,通過形態學和分子生物學鑒定獲得乳酸保鮮即食濕面中的降酸致腐優勢菌種,同時研究其生長特性。旨在明確降低酸性乳酸保鮮即食濕面中的優勢致腐微生物及其生長特性,為后續工業化生產中針對目標菌株對酸性乳酸保鮮即食濕面采取降酸處理,避免酸度較大影響面條口感,同時也為開發新的防腐保鮮技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳酸保鮮即食濕面樣品

從企業生產線采取在常溫條件下貯藏7 d后的低酸性(pH 5.0～5.5)和酸性(pH 3.6～4.0)乳酸保鮮即食濕面各5袋。降酸后腐敗的低酸性乳酸保鮮即食濕面分為未液化區域(jgs-1,菌落總數2.1×104CFU/g)和液化區域(jgs-2,菌落總數1.1×107CFU/g),酸性乳酸保鮮即食濕面未腐敗,不作區分(jgs-3,菌落總數<10 CFU/g)。

a-低酸性;b-酸性圖1 乳酸保鮮即食濕面Fig.1 Lactic acid preservative instant wet noodles

1.1.2 試劑

瓊脂粉,北京奧博星生物技術有限責任公司;NaCl、鹽酸,國藥集團化學試劑有限公司;革蘭氏染色液,常德比克曼生物科技有限公司;脫纖維綿羊血,上海源葉生物科技有限公司;PCR擴增試劑與合成擴增引物,上海生工生物工程股份有限公司。

葡萄糖胰蛋白胨瓊脂培養基(dextrose tryptophan agar, DTA)(g/L):胰酪蛋白胨10.0,葡萄糖5.0,瓊脂15.0,溴甲酚紫0.04,pH 6.7±0.1;平板計數培養基(plate count agar, PCA)(g/L):胰蛋白胨5.0,酵母浸粉2.5,葡萄糖1.0,瓊脂15.0,pH 7.0±0.2;胰蛋白胨大豆肉湯培養基(trypticase soy broth, TSB)(g/L):胰蛋白胨17.0,大豆蛋白胨3.0,NaCl 5.0,磷酸氫二鉀2.5,葡萄糖2.5,pH 7.3±0.2;胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(tryptic soy agar, TSA)(g/L):TSB培養基中加入瓊脂15.0,pH 7.3±0.2。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-1N醫用型潔凈工作臺,北京東聯哈爾儀器制造有限公司;SHP-300生化培養箱,常州普天儀器制造有限公司;LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌器,江陰濱江醫療設備有限公司;Leica DM500顯微鏡,徠卡顯微系統上海貿易有限公司;SHZ-28A水浴恒溫振蕩器,太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司;ME104E/02電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;PB-10型pH計,賽多利斯科學儀器北京有限公司;3-30 K臺式高速冷凍離心機,德國SIGMA離心機有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸保鮮即食濕面工業化生產工藝流程

乳酸保鮮即食濕面工業化生產工藝流程如下:

原輔料(小麥粉、醋酸酯淀粉、谷朊粉、食用鹽等)→真空和面→熟化→復合逐級壓延→切條→蒸面→切面→煮面→水洗→乳酸浸泡→瀝水→包裝→巴氏殺菌→冷卻→成品

1.3.2 微生物多樣性分析

DNA的提取:采用OMEGA土壤DNA試劑盒(M5635-02)提取樣品中生物的總基因組DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳測定提取DNA的濃度和純度。

PCR擴增及測序:細菌采用16S rDNA基因V3～V4區引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),真菌采用ITS序列V1區引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)分別進行PCR擴增,PCR產物使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。采用QIIME2(2019.4)軟件的DADA2方法對序列進行去引物、降噪等,并采用NCBI數據庫比對結果對序列進行物種分類學注釋。通過對物種的序列數量(絕對豐度值)進行百分比統計獲得各分類學水平上不同物種基因的相對豐度。

1.3.3 優勢菌的分離純化

取樣品25 g充分碾磨,加入225 mL無菌水,取0.1 mL逐級稀釋不同濃度梯度的稀釋液,涂布于DTA培養基上,37 ℃倒置培養24 h。挑取不同菌落形態的單一菌落,以平板劃線法分離純化獲得分離菌株[7]。

1.3.4 分離菌的形態學觀察

將分離菌株劃線接種到PCA培養基上于37 ℃培養觀察單菌落的形態特征,并進行革蘭氏染色,通過光學顯微鏡觀察菌體及芽孢形態[8]。

1.3.5 分離菌的分子生物學鑒定

采用改良CTAB法提取DNA,采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rRNA基因序列進行PCR擴增,PCR反應條件和體系見參考文獻[7]。PCR產物經試劑盒回收純化,使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序。測序結果提交NCBI GenBank用BLAST進行相似性檢索和同源性比對。利用MEGA-X軟件,采用基于Kimura 2-parameter模型的鄰接法構建系統發育樹,進化樹分支穩定性用Bootstrap分析,重復1 000次。

1.3.6 分離菌的生長特性研究

1.3.6.1 溶血特性

將分離菌株劃線接種于TSA血瓊脂平板上,在37 ℃培養48～60 h,觀察細菌的溶血能力[9]。

1.3.6.2 需氧特性

將分離菌株劃線接種于TSA培養基上,分別采用厭氧袋厭氧培養和普通需氧培養,37 ℃培養48 h觀察平板上微生物的生長狀況。

1.3.6.3 耐酸特性

用鹽酸調節TSB培養基使pH值分別為2.40、3.03、3.50、4.03、4.54、5.04、5.71、6.82、7.33,加入1%不同分離菌的菌懸液(約為107CFU/mL)于10 mL TSB的玻璃試管中,在37 ℃培養48～60 h,記錄微生物的生長狀況[10]。

1.3.6.4 耐鹽特性

將分離菌株劃線接種于含有0.5%、2%、5%、10%、12%、14%、20%(質量分數)NaCl的TSA培養基上,在37 ℃培養48～60 h,記錄微生物的生長狀況[11]。

1.3.6.5 耐熱特性

將分離菌株接種于TSB培養基中,37 ℃下培養48～60 h,經8 000×g、4 ℃離心10 min,收獲菌體。產芽孢菌在80 ℃水浴25 min,殺滅營養體細胞,其他菌不經水浴。將菌體(芽孢)重新懸浮在無菌水中,濃度約為107CFU/mL,將收集的菌在100 ℃下加熱5 min,測定熱處理后的菌落總數,以水浴后菌落存活率作為衡量各菌株耐熱力的指標[12]。

1.3.7 數據統計分析

利用IBM SPSS Statistics 23、MEGA-X軟件對實驗數據進行分析處理,利用Origin 2018軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 微生物多樣性組成譜分析

基于高通量測序技術分別分析樣品中真菌和細菌群落的組成,結果顯示,乳酸保鮮即食濕面3種樣品的真菌群落均以子囊菌門(Ascomycota)為主(>70%),屬間物種多樣性豐富,但占比較小,樣品間真菌群落組成差異不大,不是主要腐敗微生物(圖2)。圖3顯示,3種樣品中細菌群落組成存在較大差異,jgs-1與jgs-3中的細菌群落均以變形菌門(Proteobacteria)為主(>90%),而在腐敗液化即食濕面jgs-2中占絕對優勢的為厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌(Bacillus),相對豐度達90.93%。說明芽孢桿菌為低酸性乳酸保鮮即食濕面腐敗的主要致腐微生物。真菌和細菌微生物主要來源于小麥粉等生產原料和加工過程[13],即食濕面生產采用的蒸煮、巴氏殺菌等熱處理工藝容易使不耐熱的真菌及變形菌門細菌失活,耐熱性較強的厚壁菌門細菌可能逃脫系列熱處理存活下來,需要進一步乳酸處理抑制其生長。這與張婉[5]的研究結果類似,芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等厚壁菌門細菌被認為是經熱處理熟面條的主要腐敗菌。

a-門水平;b-屬水平圖2 乳酸保鮮即食濕面中真菌群落結構分布Fig.2 Distribution of fungal community structure of lactic acid preservative instant wet noodles

a-門水平;b-屬水平圖3 乳酸保鮮即食濕面中細菌群落結構分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure of lactic acid preservative instant wet noodles

2.2 分離菌的形態學觀察和分子生物學鑒定

2.2.1 分離菌的形態學觀察

采用傳統分離純化法從3個樣品中共分離獲得6株菌。其菌落形態特征如圖4和表1所示。從低酸性腐敗即食濕面jgs-1和jgs-2中分離出的5株菌中有4株均為菌落形態相近的產芽孢菌,1株為無芽孢革蘭氏陽性菌。從酸性即食濕面jgs-3中分離出1株不產芽孢的革蘭氏陰性菌。

表1 六株細菌菌落形態特征描述Table 1 The morphological characterizations of 6 strains of bacteria

圖4 六株細菌在PCA培養基上菌落形態特征Fig.4 Colony morphology of 6 strains of bacteria on PCA culture medium注:A1～A3分離自jgs-2,B1、B2分離自jgs-1,C1分離自jgs-3(下同)

2.2.2 分離菌的分子生物學鑒定

序列比對結果(表2)顯示,A1、A2、A3和B1與Bacillusamyloliquefaciensstrain BCRC 11601的同源性為99.79%～100.00%,結合菌落特征鑒定為解淀粉芽孢桿菌;B2與Peribacillusfrigoritoleransstrain DSM 8801的同源性達99.93%,被鑒定為耐寒短桿菌?；诨蚪M學,因與芽孢桿菌屬菌株具有較高的同源性,2020年耐寒短桿菌被劃分為芽孢桿菌屬,之前曾隸屬于短桿菌屬(Brevibacterium)[14-15],為不生孢的革蘭氏陽性菌;C1與Pantoeasp.strain Glg 21具有99.93%的同源性,結合菌落特征初步鑒定為泛菌屬細菌。

表2 NCBI Blast結果Table 2 Result of NCBI Blast

本研究采用高通量測序分析微生物多樣性結合傳統分離培養的方法[16]鑒定出導致降酸處理的低酸性乳酸保鮮即食濕面腐敗液化的優勢致腐微生物為芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(圖5),作為枯草芽孢桿菌近緣種群,可產生多種淀粉酶和蛋白酶[17-18],分解面條中的淀粉和蛋白質,從而導致面條的液化現象。酸性乳酸保鮮即食濕面中的活菌數量極少,經多次分離培養只分離出1株與變形菌門中泛菌屬同源性相近的菌株C1,這表明高酸度能夠很好地抑制腐敗菌的生長繁殖并具有一定的殺滅作用,嚴格控制生產原料和環境條件中芽孢桿菌、變形菌群等微生物的混入和污染有利于保障產品質量安全。

圖5 基于16S rDNA序列基因構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequence genes

2.3 分離菌的生長特性

2.3.1 溶血特性

具有溶血特性的細菌具有致病性的可能性較高。溶血試驗結果顯示,6株分離菌菌落周圍均未見溶血環(圖6),說明它們均不具有溶血能力。該產品在加工過程中受溶血性致病菌污染的可能性較小,具有溶血能力的細菌在生產過程中可能易被酸和(或)熱處理殺滅。

圖6 六株細菌的溶血性測定Fig.6 Hemolytic assay of 6 strains of bacteria

2.3.2 需氧特性

表3結果顯示,耐寒短桿菌B2在厭氧條件下生長受到明顯抑制,為需氧菌;其他菌株在厭氧條件下可生長但生長速度較慢,均為兼性好氧菌。4株解淀粉芽孢桿菌A1、A2、A3、B1在厭氧環境中仍可產生芽孢和黏液。乳酸保鮮即食濕面工業化生產中主要采用有氧包裝,為微生物的生長繁殖提供了有利條件,若采取無氧或充氮包裝將有利于減緩多數微生物的生長繁殖,但無法阻止解淀粉芽孢桿菌腐敗產生的面條液化現象。

表3 六株細菌的需氧特性Table 3 Aerobic characteristics of 6 strains of bacteria

2.3.3 耐酸特性

表4結果顯示,A1、A2、A3和B1解淀粉芽孢桿菌在pH<4.70時生長均受到明顯抑制,與YING等[19]分離出的解淀粉芽孢桿菌最小耐受pH 4.0接近;耐寒短桿菌B2在pH<6.75時生長受到抑制,耐酸性較弱;泛菌屬菌株C1是從未腐敗酸性乳酸保鮮即食濕面中分離出的菌株,耐酸性較強。未腐敗酸性乳酸保鮮即食濕面pH值為3.6～4.0,此時乳酸對芽孢桿菌、耐寒短桿菌等腐敗菌具有較好的抑制作用;當降酸乳酸保鮮即食濕面獲得較適宜的口感酸度時,pH值為5.0～5.5,酸抑制對部分腐敗菌有效,但由于解淀粉芽孢桿菌的適宜生長pH值為5.0～9.0[18],無法完全抑制這些優勢致腐菌的生長繁殖,需增加其他針對性保鮮手段加以控制。

表4 六株細菌的耐酸特性Table 4 Acid tolerance of 6 strains of bacteria

2.3.4 耐鹽特性

表5結果顯示,從乳酸保鮮即食濕面中分離出的4株解淀粉芽孢桿菌抗鹽能力較強,可耐受鹽質量分數為12%,比其他樣品中分離出的解淀粉芽孢桿菌[19-20]具有更高的耐鹽能力。耐寒短桿菌和泛菌屬細菌的耐鹽能力較弱,僅耐受5%(質量分數)。乳酸保鮮即食濕面生產加工中添加食鹽質量分數不超過5%,對分離菌的生長并無抑制作用。

表5 六株細菌的耐鹽特性Table 5 Salt tolerance of 6 strains of bacteria

2.3.5 耐熱特性

表6結果顯示,本研究中分離菌解淀粉芽孢桿菌芽孢的抗逆性較強,在100 ℃下加熱處理5 min時存活率為84.99%～92.71%,乳酸保鮮即食濕面加工生產中的蒸煮工藝不能使其徹底失活。LARSEN等[12]在對解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等10個分離物種的芽孢耐熱性研究中發現,100 ℃處理5～10 min解淀粉芽孢桿菌芽孢的耐熱性最強,與本研究的結果一致。耐寒短桿菌呈桿狀不易產芽孢[21],因此在培養基中培養48～60 h,100 ℃加熱處理5 min已完全失活。泛菌屬菌株為非芽孢桿菌,耐熱性較差。優勢分離菌解淀粉芽孢桿菌芽孢的耐熱性較強,工業化生產中蒸煮工藝和巴氏殺菌不能使其徹底失活。若要降低生產加工中酸味劑的使用以及在不升高殺菌溫度的前提下,減少對產品品質的影響,針對抗逆性較強的優勢致腐菌解淀粉芽孢桿菌開發新的防腐保鮮技術十分必要。

表6 六株細菌的耐熱特性Table 6 Heat tolerance of 6 strains of bacteria

3 結論

本研究對工業化生產乳酸保鮮即食濕面中的致腐微生物進行了多樣性分析,結合傳統分離培養方法,通過形態學和分子生物學鑒定獲得了乳酸保鮮即食濕面中的降酸致腐優勢菌種,同時研究了其生長特性。結果表明降酸處理導致乳酸保鮮即食濕面腐敗液化的優勢微生物是芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌。4株分離菌株解淀粉芽孢桿菌均為非溶血性的兼性好氧菌,抗逆性較強,最大耐受pH值為4.70,最大耐鹽質量分數為12%,100 ℃熱處理5 min芽孢存活率為84.99%～92.71%。本研究為乳酸保鮮即食濕面關鍵致腐微生物的控制及低酸性乳酸保鮮即食濕面新產品的開發提供了理論基礎。