生物被膜在白念珠菌病的研究進展

唐詩琴，李小靜

長期以來，以白念珠菌（Candida albicans）為主的真菌感染威脅著人類的健康，特別是免疫缺陷的群體。隨著越來越多抗真菌藥物及免疫抑制劑的使用，白念珠菌的耐藥也成為了一個嚴重的問題，而導致這種情況最重要的一個因素就是生物被膜（Biofilm）的形成。生物被膜存在于包括植物和哺乳動物組織在內的天然基質上，并易在人造聚合物上形成，如在導管、假體和植入的心臟瓣膜中被發現［1］。正因為白念珠菌生物被膜的存在，所以白念珠菌相關感染疾病對臨床抗真菌藥物有很大的耐藥性，增加了白念珠菌感染的復發率，使臨床治療也變得困難。因此，需要尋找新的治療靶點去降低白念珠菌病的發病率和復發率。

1 生物被膜的形成

生物被膜是一群附著在生物或非生物基質上的微生物，嵌入細胞外聚合物基質中，是許多微生物的主要生長狀態。白念珠菌生物被膜的形成主要由酵母細胞、假菌絲和菌絲通過表面接觸粘附而形成的一種復雜網狀混合物的三維結構［2］。白念珠菌生物被膜的發育是漸進的，生物被膜的形成常分為4 個階段（圖1）：白念珠菌酵母細胞在底物上的吸附，形成基底層（基底層起錨定作用）、微菌落的形成和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的產生，成熟階段，細胞從成熟生物被膜中的分散［3］。生物被膜內的假菌絲與菌絲細胞形成一個復雜的網絡，不斷向周圍延伸擴散。

1.1 生物被膜與粘附 粘附是生物被膜初步形成的第一步，而生物被膜完整性是整個生物被膜形成重要的第一步。在粘附過程中，單個酵母細胞一般會粘附在物體表面，啟動生物被膜形成的階段。此時的酵母細胞還可以重新回到浮游狀態，所以在這個階段，生物被膜的形成是相對可逆的。在粘附過程中有兩個重要物質：轉錄因子與黏附素。白念珠菌中研究最多的黏附素家族是Als（Agglutinin-like sequence，凝集素樣序列）蛋白家族，Als 蛋白家族是白念珠菌生物被膜形成和發展的基礎，Als1、Als3 和Als5 在白念珠菌與宿主細胞相互粘附過程中發揮著重要作用；Als1除了在粘附中的作用外，還對真菌細胞大小有一定影響［4］。Hwp1、Rbt1、Eap1 和Ywp1 都是糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl phosphatidyll inositol，GPI）錨定細胞壁蛋白，其中Hwp1 是重要的粘附因子，它是菌絲特異性細胞壁蛋白，能調控生物被膜中的菌絲形成，并且促進白念珠菌與宿主細胞的粘附［5］。研究發現，當Als3 或Hwp1 基因缺失的時候，生物被膜形成的能力受到抑制，可導致毒力減弱［6，7］。通過與浮游細胞狀態進行比較后，確定了3 個新的生物被膜形成的調節因子：Flo8、Gal4 和Rfx2［8］。在生物被膜形成全程中都需要Flo8 因子的參與，而在中期發育中需要Gal4 和Rfx2 因子的參與才能形成較完善的生物被膜，靶向白念珠菌中的Flo8 因子會引起針對多種微生物感染的保護性免疫反應。在將來，生物被膜調節因子與黏附素家族的進一步研究有希望成為治療白念珠菌感染的一種方法。

1.2 生物被膜與菌絲 白念珠菌和其它真菌不同之處在于它可以在各種條件下形成酵母細胞和菌絲，菌絲是生物被膜形成的重要成分［9］。在生物被膜形成過程中，一些核心調節因子比如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1 均參與了浮游細胞的生長［10］，但是懸浮培養中的菌絲，容易形成有缺陷的菌株，不利于生物被膜形成，這些調節因子有促進菌絲形成的作用，若將它們在浮游條件下培養，其中一個基因缺失，都會抑制或降低白念珠菌的菌絲形成，進一步影響生物被膜［11］。在菌絲調控中有2 個重要的信號途徑，包括MAPK（Mitogen-activated protein kinase，絲裂原激活蛋白激酶）信號途徑、cAMP-PKA 信號途徑。Cek1是一種胞外信號調節激酶，是MAPK家族的重要成員，它能參與調控細胞表面接觸反應，在菌絲侵入性生長以及生物被膜形成中發揮一定的作用；cAMP-PKA 通路在真核細胞中比較保守，并能調節白念珠菌毒力，所以它們可能是抗真菌藥物開發的有希望靶點［12-14］。生物被膜中的菌絲對整個生物被膜結構起著重要的穩定性作用，是酵母細胞和其它菌絲支撐起來的框架。β-葡聚糖（β-glucan）的合成會影響白念珠菌生物被膜形成能力，研究發現當生物被膜成熟以后，它頂層的菌絲細胞更具有掩蓋β-葡聚糖的能力，侵入性生長過程中穿透上皮細胞層，并通過物理刺穿吞噬細胞，避免免疫系統識別，引起免疫逃逸［10］。雖然菌絲細胞本身就有β-葡聚糖，但如果是未成熟的或是量不夠的菌絲細胞，就不能達到遮蓋引起逃逸的作用。因此，形成菌絲、菌絲與酵母粘附的能力對生物被膜的發育和維持至關重要，可以利用以上特性進一步破壞生物被膜形成的條件。

1.3 生物被膜與細胞外基質 細胞外基質的研究一直以來是了解白念珠菌耐藥的一個重要方向，但它基質成分比較復雜。細胞外基質由生物被膜內細胞分泌的胞外聚合物組成，是糖蛋白（55%）、碳水化合物（25%）、脂質（15%）和核酸（5%）構成的復雜混合物質，其中碳水化合物主要是α-甘露聚糖（α-Mannan）和β-1，6-葡聚糖多糖（β-1，6-glucan polysaccharide），其次是β-1，3-葡聚糖（β-1，3-glucan）［15］。生物被膜一般比浮游細胞要厚，并且抗耐藥性強。將生物被膜基質視為白念珠菌生物被膜的一種胞外酶活性成分，一種既能分解分子來作為保護性反應又能獲得營養來源的成分。細胞外基質在生物被膜中處于保護白念珠菌生物被膜完整性不受損的角色，這是外來干預措施攻破生物被膜的關鍵一步。β-1，3-葡聚糖是白念珠菌細胞外基質中的一種重要多糖，它利用自身的特殊性能在唑類藥物恢復力中起主要作用［16］，而β-1，3-葡聚糖酶具有抗生物被膜活性，它可以降解白念珠菌生物被膜的中β-1，3-葡聚糖，因此β-1，3-葡聚糖酶可能是一種有用的抗生物被膜劑［17，18］。

1.4 生物被膜群體效應 群體效應（Quorumsensing，QS）是一種微生物通訊機制，其信號分子的積累使細胞能夠感知細胞密度，是生物被膜形成的基礎。白念珠菌中發現的真菌群體效應信號分子包括法尼醇（Farnesol））和酪醇（Tyrosol）［19，20］。法尼醇是白念珠菌中甾醇生物合成的前體，是目前研究最多的群體效應信號分子，它能抑制白念珠菌從酵母向菌絲形式轉化，還能影響生物被膜細胞粘附、成熟發育以及內部的結構［21］。之前研究通過XTT 細胞活性測定法檢測法尼醇對生物被膜的作用，發現在37.5—600μm 濃度范圍內，法尼醇對白念珠菌生物被膜具有濃度、時間及種類依賴性的抑制作用［22-24］。作用僅次于法尼醇的群體效應信號分子是酪醇，它不僅促進菌管的形成，還促成白念珠菌從酵母形式向菌絲形式的轉化［25］，酪醇在生物被膜形成早期和中期階段的作用最顯著。如果利用酪醇和法尼醇的各自特性結合，可能針對抗白念珠菌的治療有一定幫助。因法尼醇是甾醇生物合成的前體，所以白念珠菌生物被膜中的法尼醇暴露后，會導致麥角甾醇（Ergosterol）生物合成基因的下調，因此法尼醇可通過影響麥角甾醇生物合成中的部分基因表達來抑制生物被膜介導的耐藥性［26］。在未來的研究中，可以嘗試用法尼醇作為減少白念珠菌生物被膜的替代劑。

2 生物被膜耐藥機制

白念珠菌耐藥因素很多，生物被膜耐藥是主要原因之一。白念珠菌生物被膜比浮游細胞更具抗性，對抗真菌藥物不敏感，從而產生臨床耐藥性。生物被膜耐藥性形成機制復雜，其中主要機制包括：藥物外排泵的表達增加、細胞外基質保護作用及生物被膜中存在“持久性”細胞［10］。外排泵是存在細胞質膜中的轉運蛋白，一般在生物被膜中就有表達，主要對唑類藥物分子進行排泄，當使用氟康唑后，外排泵表達更明顯，不斷將藥物分子從細胞內部輸送到細胞外，這樣就降低了作用部位的藥物濃度。持留細胞（Persister cells）是代謝活性降低的非分裂細胞，它們不僅對抗菌藥物具有高度耐藥性，也可能在藥物治療后播種新的生物被膜感染。生物被膜在成熟階段會釋放出大量的細胞外基質，它就像一層保護膜，可以作為物理屏障阻擋抗真菌藥物的滲入，并保護和維持生物被膜的完整性。

3 抗白念珠菌生物被膜藥物研究進展

目前有4類藥物被廣泛用于抗真菌：唑類衍生物、多烯、棘白菌素和核苷類似物。氟康唑具有抗真菌譜廣、毒性低、生物利用度高等特點，被廣泛用于白念珠菌感染的臨床治療。麥角甾醇作為白念珠菌生物被膜的組成成分，是發揮毒力的重要結構，使用氟康唑能抑制麥角甾醇合成。因為氟康唑是抑菌劑，且對于細胞膜的滲透性比較差，不僅影響藥物濃度，還易引起耐藥，所以現在非抗真菌藥物與抗真菌藥物的協同治療逐漸引起大家的關注，這里主要描述氟康唑耐藥時的協同治療。

布洛芬是常見的非甾體抗炎藥（NSAID），多用于緩解急性疼痛和發熱［27］。非甾體抗炎藥可以通過花生四烯酸途徑，減少前列腺素E2 的產生，限制致病真菌的毒力，并減少生物被膜形成［28］。研究發現，布洛芬能在體內增強氟康唑的抗真菌活性并降低白念珠菌的毒力，破壞真菌生物被膜［29］。不僅如此，布洛芬還是生物被膜外排泵阻滯劑，能夠防止唑類藥物從細胞內排出。布洛芬與唑類藥物的協同作用使抗真菌敏感性增加的原因可能是細胞內真菌藥物濃度增加，逆轉了生物被膜的耐藥［30］。氯尼達明（Lonidamine，LND）是一種非常規的抗腫瘤藥物，可通過抑制糖酵解途徑干擾癌細胞的能量代謝。Chen等人［31］通過使用氯尼達明與氟康唑聯合作用對耐藥性浮游白念珠菌和預形成的生物被膜進行抑菌試驗，發現氯尼達明和氟康唑協同作用下對早期（4h 與8h內）新形成的生物被膜有較強的抑制作用；當12h 后，對生物被膜幾乎無協同作用。這就提示氯尼達明和氟康唑的協同作用可以對生物被膜的產生有一定的抑制作用，但這僅適用于早期未成熟的生物被膜，對晚期已成熟生物被膜作用有限或幾乎無作用。

4 結論與展望

白念珠菌的致病性主要取決于生物被膜，形成生物被膜的能力是一個極其復雜的過程，因此使白念珠菌相關感染的治療變得復雜。生物被膜形成、抗真菌藥物特性和多種微生物內的相互作用一直是白念珠菌生物被膜持續研究的熱點，目前仍有許多機制等待著我們繼續探索。今后我們應在注重真菌共生與感染之間平衡的同時，利用現有的知識去發現更多對抗白念珠菌感染的方法及研究生物被膜形成機制。