青蒿素和槲皮素抑制新冠病毒刺突蛋白介導的細胞因子風暴

吳 偉，吳俊汐，紀旭旭，劉 戟，劉 彬，耿福昌

(1.涼山州中西醫結合醫院彝族醫藥研究所＆消化內科，四川 西昌 615000；2.好醫生藥業集團，四川 成都 610000；3.成都中醫藥大學醫學與生命科學學院，四川 成都 610000；4.四川大學華西基礎醫學與法醫學院分子生物學實驗室，四川 成都 610041；5.睿美贊科技有限公司，四川 成都 610044)

根據世界衛生組織2023年2月17日提交的最新數據提示，由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease-2019，COVID-19）流行已造成全球范圍確診病例感染7.56億，死亡684多萬[1]。當前，SARS-CoV-2已衍生出多種變體，如奧密克戎的系列變體，嚴重變異，具高度感染風險[2]。目前疫苗能否有效預防這些新變體仍在研究中[3]?；诖?，一些國家針對預防和抗擊新型冠狀病毒感染也將替代療法納入了健康指南[4]。天然化合物具廣泛生物活性和治療特性，對新型冠狀病毒感染具潛在預防及治療作用[5]。故而，尋求有效且容易獲得的天然化合物作為新型冠狀病毒感染的替代和補充藥物，可能有助于預防和治療新型冠狀病毒感染。

SARS-CoV-2感染始于病毒S蛋白與細胞表面血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的結合，這導致病毒顆粒的內吞（細胞進入）和病毒內容物的釋放，以允許病毒復制[6]。分子對接研究表明，SARS-CoV-2的天然S蛋白還可以直接結合并激活 Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）[TLR1、TLR4和TLR6]，這將導致核因子（NF）-κB[nuclear factor（NF）-κB，NFKB]通路的激活，從而上調抗病毒和促炎介質的轉錄[7]。當免疫反應不受控制時，會引發細胞因子風暴，并導致多器官衰竭[8]。這種激烈的炎性程度與新冠肺炎和肺損傷的嚴重程度以及高死亡率密切相關[9-11]。因此，阻斷S蛋白介導的SARSCoV-2細胞進入對預防SARS-CoV-2感染至關重要，改善S蛋白介介導的細胞因子風暴被認為是預防新冠肺炎發展到更嚴重階段的關鍵治療方法。

據古籍記載，中國有一種古老的彝族醫藥防疫藥方。該方是彝族醫藥采用熏蒸法防治流行性傳染病的有效措施，至今仍經常使用。青蒿和側柏葉是這一古老方劑的主要兩種藥材。體外研究表明，青蒿熱水提取物在體外對SARS-Cov-2變體顯示出強大的活性[12]。網絡、GO和KEGG分析表明，青蒿通過調節炎癥反應、增殖、分化和凋亡來應對新冠肺炎[13]?；诰W絡的數據庫分析表明，側柏葉通過增強個人免疫力來管理和緩解呼吸道病毒感染，包括新冠肺炎[14]。

青蒿素和槲皮素是分別存在于青蒿和側柏中的主要生物活性化合物[15-16]。青蒿素在VeroE6細胞中測定的預處理或后處理抗SARS-CoV-2測定中顯示出優異的效果（選擇性指數分別為35或54）[17]。槲皮素在VeroE6細胞中測定的抗SARS-CoV-2測定中也顯示出良好的效果（選擇性指數=39.81）[18]。因此，青蒿素和槲皮素作為彝族醫藥古代防疫方劑中的主要生物活性成分，單獨或聯合使用這兩種化合物都可能有效預防和治療新冠肺炎。

基于上述背景，我們的研究旨在調查：青蒿素和槲皮素單用或聯合使用是否可以通過抑制S新冠病毒刺突蛋白介導的細胞因子風暴來改善新冠肺炎。

1 材料和方法

1.1 Venn分析和富集分析 首先，將COVID-19、青蒿素和槲皮素分別輸入CTD數據庫，下載基因集。分別在這些基因組之間進行Venn分析。其次，交叉部分的基因集被上傳到DAVID生物信息數據庫、PANTHER數據庫、GO（基因本體）數據庫、KEGG數據庫、Reactome數據庫和字符串數據庫。然后，對這些交叉基因進行富集分析，以評估這些基因對生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）和信號通路的影響。

1.2 細胞、藥品和試劑 Vero細胞來自四川大學生物化學和分子生物學實驗室。將細胞保存在補充有10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）中，并在 37℃下用5% CO2孵育。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、Dulbecco's改良 Eagle（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）培養基和磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）購自 Gibco（Grand Island，NY，USA）。 吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC）、青蒿素和檞皮素從Solarbio獲得。Ebselen是從Beyotime購買的。

1.3 細胞培養 將含有1 mL Vero E6細胞懸液凍存管在37℃水浴中快速搖晃解凍，加4 mL含10% FBS的DMEM培養基混合均勻；在1 000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，加1～2 mL培養基后用槍輕輕吹打混勻；將Vero E6細胞接種至細胞培養板，在37℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養過夜；Vero E6細胞密度達80%～90%，即可進行傳代培養。

1.4 細胞活力測定 將細胞以適宜密度接種到96孔板內培養至細胞密度達到約70%～90%；吸出96孔板孔內的培養基，加入適量PBS清洗細胞；而后使用無血清DMEM培養基和CCK8溶液配置反應液（比例為10∶1），混合均勻后，每孔加入100 μL反應液，并設置空白未鋪細胞對照孔加入100 μL反應液，放置于37℃和5% CO2恒溫箱內孵育1 h；在450 nm處測量吸光度。

1.5 NFKB p65轉錄活性測定 HEK293T-hACE2細胞用青蒿素、檞皮素、青蒿素+檞皮素或NFKB抑制劑PDTC預處理6 h，然后與SARS-CoV-2 S蛋白孵育18 h。用NFKB p65轉錄因子試劑盒分析核細胞部分的NK-κB轉錄因子活化。使用細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒制備細胞質和核細胞級分。通過BCA蛋白質測定法測定蛋白質濃度。將0～2 μg核提取物在涂有NFKB p65共有序列的孔中孵育1 h。第一次孵育后，洗滌孔并與NFKB p65的特異性一級抗體孵育1 h。與一級抗體孵育后，洗滌孔并與HRP綴合的二級抗體孵孵育1 h，然后洗滌。向孔中加入化學發光工作溶液，并使用光度計檢測所得信號。據報道，活性NFKB轉錄因子為每μg蛋白質的化學發光。

1.6 使用ELISA試劑盒評估IL-1β、IL-18、IL-6和IL-8 如上（NFKB p65轉錄活性測定）所述處理HEK293T-hACE2細胞。收集培養上清液并以3 000 rpm離心20 min。根據說明完成試劑制備。將100 μL樣品稀釋劑、連續稀釋的標準品和測試樣品作為零孔、標準孔和測試樣品孔添加到微量滴定板中，并在37℃下孵育2 h。洗滌后，加入檢測抗體并在37℃下孵育1 h。與抗體孵育后，洗滌孔并與HRP綴合的二級抗體孵育40 min，然后洗滌。加入100 μL顯色溶液，在37℃的黑暗中顯色15～20 min后加入停止溶液，并使用波長為450 nm的微板讀數儀測量OD值。數據分析：需要從零井的OD值中減去每個標準和樣品的OD值。以標準產品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，進行四參數擬合。根據樣品的OD值，根據標準曲線計算擬合濃度，并乘以稀釋系數，以獲得樣品的測量濃度。

1.7 統計分析 結果以平均值±SD表示。Graphpad Prism 7.0軟件用于分析數據。通過Student的非配對t檢驗比較兩組之間的差異。通過單因素方差分析和事后Tukey檢驗分析不同組間的多重比較。P值小于0.05，被認為是顯著的。

2 結果

2.1 Venn分析和富集分析 來自Gene或Pubchem數據庫的結果顯示，與新冠肺炎、青蒿素和槲皮素相關的基因集中，經智人過濾的基因數分別為9 889、30和4 149。Venn分析結果如表1和圖1所示。對基因集1和基因集2、3或4之間的交叉基因進行GO術語富集和通路富集分析的結果如下：1.新冠肺炎和青蒿素（24 BP，18 MF，0 CC，75 KEGG 途徑和 95 REACTOME通路），2.新冠肺炎和槲皮素（782 BP、139 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME通路），3.新冠肺炎和青蒿素+槲皮素（787 BP、145 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME 通路）。根據研究方向，篩選出富集分析結果中的重要相關項目（涉及炎癥和冠狀病毒病-COVID-19等），并顯示在表2-7中。

圖1 新冠肺炎和青蒿素+槲皮素之間兩組基因的維恩圖

表1 Venn分析

表2 新冠肺炎與青蒿素交叉基因的GO富集分析

表3 新冠肺炎與槲皮素交叉基因的GO富集分析

表4 新冠肺炎與青蒿素+槲皮素交叉基因的GO富集分析

表5 新冠肺炎與青蒿素交叉基因的通路富集分析

表6 新冠肺炎與槲皮素交叉基因的通路富集分析

表7 新冠肺炎與青蒿素+槲皮素交叉基因的通路富集分析

2.2 青蒿素或槲皮素對Vero E6或HEK293-ACE2細胞的細胞毒性 細胞毒性試驗結果表明：用濃度≤100 μM的青蒿素或槲皮素分別處理Vero E6或HEK293-ACE2細胞24 h，不會導致 Vero E6和HEK293-ACE2細胞活力顯著性降低（P＞0.05）（如圖2所示）。

圖2 青蒿素或槲皮素對Vero E6和HEK293-ACE2細胞活力的影響

2.3 SARS-CoV-2S蛋白通過介導NFKB的過度激活誘導細胞因子風暴 基于圖3所示的數據，對結果的解釋如下：1）S蛋白可以通過以濃度依賴性方式介導NFKB的過度激活而顯著誘導細胞因子風暴（aP<0.05）；2）NFKB抑制劑PDTC通過抑制S蛋白介導的NFKB的過激活而顯著逆轉細胞因子風暴（bP<0.05）。

圖3 SARS-CoV-2S蛋白通過介導NFKB的過度激活而誘導細胞因子風暴

2.4 青蒿素和槲皮素對SARS-CoV-2S蛋白介導的NFKB過度激活引發的細胞因子風暴的逆轉作用

如圖4和圖5所示，結果如下：1）S蛋白顯著誘導NFKB的過度激活以介導細胞因子風暴（aP<0.05）；2）青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）單獨或聯合治療通過抑制由S蛋白介導的NFKB的過度激活顯著改善了細胞因子風暴（bP<0.05）；3）青蒿素（15μM）和槲皮素（15 μM）聯合治療顯示出比單獨治療更好的改善效果（cP<0.05）；4）NFKB抑制劑PDTC顯示出比單獨青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）更有效的改善效果（dP<0.05）；5）與 PDTC 相比，青蒿素（15 μM）與槲皮素（15 μM）的聯合治療顯示出類似的改善效果（eP＞0.05）。

圖4 青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）單獨或聯合治療對S蛋白介導的NFKB過度激活的抑制作用

圖5 青蒿素和槲皮素聯合治療對刺突糖蛋白介導的炎性細胞因子風暴的逆轉作用

3 討論

早在4 000年前的母系社會，彝族的醫療活動已經進行了很長時間[17]。彝族的祖先積累了大量的醫學知識，包括針灸、藥酒和草藥，為進一步研究中國少數民族的醫學奠定了寶貴的基礎[17]。民族藥物研究對于預防未來毀滅性的流行病緊急情況非常重要[18]。

自2019年以來，由SAS-CoV-2引起的新冠肺炎疫情對全球健康產生了深遠影響[19]。直到今天，青蒿和側柏葉一直被彝族用來治療咳嗽、肺病和呼吸道傳染病。本研究證明，青蒿素（濃度≤100 μM）或槲皮素（濃度≤100 μM）對Vero E6和HEK293-ACE2細胞沒有細胞毒性（圖2）。這與先前的研究結果一致，即青蒿素和槲皮素對Vero E6細胞的CC50分別為3.32 mM和29.1 mM[20-21]。根據本研究中的富集分析，可以推測青蒿素、槲皮素或青蒿素+槲皮素可能通過影響病毒介導的炎性反應來防治新冠肺炎（表2-7）。這些預測需要進一步的實驗來證實。

SARS-CoV-2病毒感染可在體內引發復雜的信號級聯反應并刺激NFKB，NFKB可誘導炎性細胞因子的轉錄，并增加 IL-1β、IFN-γ、IP-10、MCP-1、IL-4和IL-1057的分泌[22]。特別是TLR4最可能參與識別SARS-CoV-2的分子模式，以誘導炎癥反應[23]。SARS-CoV-2感染后，宿主的炎性細胞因子風暴通?？赡茉诓皇芸刂频拿庖叻磻聠?，失控的炎癥反應可能是SARS-CoV-2感染死亡的主要原因[24]。細胞因子風暴會通過免疫系統觸發宿主細胞的損傷，并與疾病嚴重程度相關，導致多器官衰竭或死亡[25]。該研究證明，刺突蛋白可以通過以濃度依賴的方式介導HEK293T-hACE2細胞中NFKB的過度激活，顯著誘導細胞因子風暴（圖3）。青蒿素以其抗瘧活性而聞名。除了抗瘧活性外，青蒿素還具有抗病毒和免疫調節作用。青蒿素可以抑制多種炎癥信號通路，如MAPK、PI3K/AKT和NFKB，抑制淋巴細胞活化，增加調節性T細胞的數量，抑制胞質分裂的釋放，最終減少炎癥損傷[26-28]。槲皮素具有良好的抗炎和抗病毒作用，可顯著減少IL-6、IL-1β、IL-8和 TNF-α46的分泌[29]。這兩種化合物在新型冠狀病毒肺炎中都有一定的應用潛力。該研究證明，青蒿素或槲皮素的單獨或聯合治療可以通過抑制刺突蛋白介導的NFKB的過度激活來顯著改善細胞因子風暴，聯合治療顯示出比單獨治療更好的效果（圖4和圖5）。這些結果提示，青蒿素或槲皮素的單獨或聯合治療可以通過抑制SARS-CoV-2刺突蛋白介導的NFKB的過度激活來有效地改善夸大的炎癥反應。

4 小結

總之，本項研究結果表明SARS-CoV-2刺突蛋白會介導細胞因子風暴。在SARS-CoV-2刺突蛋白的刺激下，青蒿素或槲皮素的單獨或聯合治療可以通過抑制NFKB的過度激活來顯著減輕細胞因子風暴。聯合治療顯示出比單獨治療更好的效果。我們的研究為預防和治療新冠肺炎提供了替代和補充藥物的參考。