鴨源新城疫病毒強毒株感染對番鴨致病性和β-防御素基因表達的影響

侯雨彤，陳玉秋，張莉莉，馬得瑩

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001）

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）強毒株感染引發的急性、高度接觸性傳染病[1]。NDV又稱禽Ⅰ型副黏病毒（Avian paramyxovirus type 1,APMV-1），屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員。病毒基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA[2-3]。NDV具有廣泛的宿主譜，目前為止，已經報道至少有鸚鵡、鴿、鴕鳥、番鴨、鸕鶿、鵝、鴨等250種鳥類能夠自然或實驗感染NDV[4]。各種家禽均可感染，其中雞和鵝發病率較高。同時病禽為此病傳染源，在其分泌物、排泄物中攜帶大量病菌，并且被病禽污染的飼料、飲水或墊料均攜帶病毒。若家禽接觸后會通過消化道、呼吸道和眼結膜傳播，進而誘發新城疫[5]。發生該病后，病禽主要表現為痢疾和神經癥狀，死禽主要特征為局部病灶出血，腸粘膜壞死，卵泡出血、淤血[6-7]。其中鴨感染該病毒的主要臨床癥狀表現為食欲不振、下肢麻痹、腹瀉等，與雞感染NDV后發病癥狀相似[8]。如果有細菌等混合感染（主要是大腸桿菌病和傳染性漿膜炎），會使死亡率升高[9]。但是，我們近期的研究發現，紹鴨感染鴨源NDV毒株后，鴨沒有臨床發病癥狀和死亡情況發生，說明NDV對不同品種鴨致病性存在差異[10]。

NDV是RNA病毒，其基因組易發生變異，導致其宿主的易感性經常發生改變，并且常規的疫苗接種對一些變異毒株不能提供理想的保護效果。因此，深入探究家禽抗感染的天然免疫調節機制，將對家禽養殖業的發展具有重要意義。禽防御素（Avian β-Defensin,AvBD）屬于β-防御素的一種，是一類廣泛存在于禽體內的內源性陽離子抗菌肽[11]。無論是人工合成的β-防御素還是天然β-防御素，都具有廣譜抗菌、抗病毒以及免疫調節作用[12-13]。有研究發現，鴨源NDV毒株可誘導紹鴨部分AvBD的表達量上調，這些反應可能與病毒的致病性及AvBD在機體內的抗病毒作用有關，揭示了鴨源NDV毒株感染可誘導紹鴨體內產生天然免疫反應[10]。NDV還可誘導鴿β-防御素1、2、7和10基因的表達量上調，從而增加先天性免疫系統對新城疫病毒的抵御[11-13]。此外，防御素也能夠激活樹突狀細胞和調節在抗原遞呈細胞中干擾素-γ（interferon,IFN-γ）的產生，表明它們可能在獲得適應性免疫的過程中也起了一定的作用[11,14]。

鴨源NDV的大多數研究集中于病毒分離和鑒定，而強毒株感染鴨后誘導機體免疫反應的研究報道較少。本試驗旨在探討鴨源NDV強毒株對番鴨的致病性，同時探究病毒感染誘導機體AvBD基因的表達，初步揭示新城疫病毒感染番鴨誘導機體的反應，同時為AvBD在抗新城疫病毒的臨床應用中提供初步參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與毒株 80只15日齡SPF番鴨，由哈爾濱國生生物科技股份有限公司實驗動物中心提供；1%SPF雞外周血紅細胞和9日齡SPF雞胚均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物實驗中心提供；鴨源新城疫病毒Md/CH/LGD/1/2005毒株[15]由本實驗室鑒定和保存。病毒基因組序列GenBank登錄號為KM885167，其雞胚半數感染量（50% egg infectious dose,EID50）為log108.38。1日齡雛雞腦內致病指數（intracerbral pathogenicity index,ICPI）值為1.88，雞胚平均死亡時間（mean death time,MDT）值為50 h。

1.2 主要試劑 One Step SYBR?Prime ScriptTMRTPCR KitⅡ試劑盒Cat.RR086A、ExTaqDNA聚合酶、DL100 marker、RNAiso Plus購自Takara公司；凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 主要應用軟件 DNA序列分析比對應用DNAMAN軟件；引物設計采用Oligo 7軟件。

1.4 試驗設計 將80只15日齡健康SPF番鴨隨機分為兩組，其中試驗組和對照組各40只。試驗組以滴鼻點眼的方式每只鴨接種107EID50/0.2 mL NDV Md/CH/LGD/1/2005株。對照組接種同劑量的滅菌PBS。兩組番鴨在接種后36 h、72 h、7 d和25 d，各取10只頸部放血處死，采集處死鴨的骨髓、脾臟、盲腸扁桃體、哈德氏腺和法氏囊五個免疫器官樣品，分別標記，置于-70℃冰箱保存用于后續提取組織總RNA。同時，接種后36 h、72 h、7 d以及16 d、20 d和25 d采集兩組各10只番鴨的血清，用于NDV的血凝抗體檢測。

1.5 臨床及病理學變化觀察 人工感染番鴨NDV Md/CH/LGD/1/2005株后，持續觀察臨床癥狀25 d，對死亡番鴨進行剖檢，觀察病變。并采集番鴨胸腺和脾臟組織固定于4%甲醛溶液內，制備病理切片，進行病理學變化觀察。死亡動物采取與實驗組相同的組織器官，分組標記，置于-70℃冰箱儲存備用。

1.6 樣品處理及組織總RNA的提取 將采取的番鴨骨髓、脾臟、盲腸扁桃體、哈德氏腺、法氏囊凍存組織樣品各稱取100 μg，勻漿后按TRIzol法提取總RNA。最后用70 μL DEPC處理水溶解，-70℃冰箱保存備用。

1.7 real-time RT-PCR引物設計 番鴨18S rRNA、AvBD1、AvBD3、AvBD5、AvBD6、AvBD16、AvBD4、AvBD7和AvBD12基因引物根據已發表序列設計[16-18]，均由哈爾濱博仕生物公司合成，使用前需用無菌DEPC處理水稀釋備用。

1.8 real-time RT-PCR 以番鴨各組織器官的總RNA為模板，鴨18S rRNA作為內參基因，根據表1中設計的特異性引物進行real-time RT-PCR檢測18S rRNA及AvBD基因表達量。將每個基因的相應質粒標準品按10倍梯度稀釋后用于構建標準動力學曲線。其中，試驗組和對照組樣品均做10個平行，各取其平均值。引物濃度為2.5 μmol/L，熒光定量反應體系（25 μL）為：one step buffer 12.5 μL，RNA free ddH2O 7.5 μL，Prime Script one step Enzyme Mix 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1 μL，Total RNA 2 μL。反應條件為：反轉錄42℃ 5 min，95℃預變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環；40℃延伸30 s。計算公式如下：基因相對表達值（校正值）=log10（目標基因的拷貝數/內參基因的拷貝數）

表1 Real-time RT-PCR 引物序列Table 1 Real-time RT-PCR primer sequences

1.9 數據的分析和處理 所有數據均以平均值對數±標準誤差表示。所得數據采用SPSS Statistics 19軟件進行分析。

2 結果

2.1 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染番鴨后臨床癥狀及病理學組織變化 番鴨感染NDV Md/CH/LGD/1/2005毒株后，均有明顯的臨床癥狀，表現為精神沉郁、站立不穩、飲水和采食量下降，排稀便。發病率為100%，其中3只死亡（死亡率7.5%）。死亡番鴨剖檢變化為肝臟淤血（圖1A）；腺胃腫脹，腺胃壁增厚、乳頭明顯水腫且有出血點（圖1B）；脾臟明顯腫大變黑、質地變脆、出血，出現部分壞死灶，呈斑駁狀病變（圖1C）。病理組織學結果顯示死亡番鴨脾臟實質內的淋巴細胞顯著減少（圖1D，圖1E為對照組）；胸腺間質出血（圖1F，圖1G為對照組）。

圖1 番鴨感染NDV后組織剖檢癥狀Fig.1 Organization autopsy symptoms of Muscovy ducks infected with the NDV

2.2 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染番鴨后血清抗體變化 Md/CH/LGD/1/2005毒株感染番鴨后能夠誘導機體產生抗體。在接種后72 h時，部分番鴨產生抗體，在第7 d抗體水平達到最高峰，之后開始下降并進入抗體滴度平臺期，但仍處于較高水平（圖2）。

圖2 番鴨感染NDV后HI血清抗體效價Fig.2 The HI titers of Muscovy duck serum antibodies infected with the NDV

2.3 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染后番鴨組織中AvBD基因的表達水平 在接種NDV Md/CH/LGD/1/2005強毒株后的各個時間點，番鴨的不同組織器官中AvBD表達量表現一定的差異。鴨AvBD1、2、5和10在機體內廣泛分布，而在骨髓中未檢測到AvBD3和AvBD9，在脾臟中未檢測到AvBD6和AvBD16（圖3）。

圖3 感染NDV后番鴨各組織中AvBD基因表達水平變化Fig.3 The expression of AvBD mRNA in tissues of Muscovy ducks infected with the NDV

在感染后36 h，AvBD2和AvBD4在法氏囊中表達量顯著增加（P＜0.05）；AvBD12和AvBD16分別在法氏囊和骨髓中的表達量顯著降低（P＜0.05）。在感染后72 h，AvBD2在脾臟、法氏囊中顯著上調（P＜0.05），卻在盲腸扁桃體中表達量顯著下降（P＜0.05）。AvBD10在骨髓中表達量明顯下降，在法氏囊內表達呈整體上升趨勢。在感染后7 d，AvBD3、AvBD6在法氏囊中表達量顯著升高（P＜0.05），AvBD4在脾臟和法氏囊內顯著高表達（P＜0.05），AvBD5在7 d及25 d的法氏囊內顯著高表達（P＜0.05），AvBD16的表達在骨髓內與同組對照組相比呈降低趨勢，在法氏囊內顯著增加（P＞0.05）。AvBD7在36 h、72 h、7 d和25 d 4個時間點的法氏囊內均呈升高趨勢，且在感染后36 h和25 d差異性顯著（P＜0.05），卻在72 h骨髓內顯著降低表達（P＜0.05）。

3 討論

早期報道顯示，在發病鴨和無臨床癥狀的健康鴨體內，分離到大量毒力不等的NDV毒株，但大部分毒株僅被宿主攜帶而不會致鴨發病，即便是強毒力毒株也如此[19]。我們近期的研究也發現，NDV強毒對紹鴨無明顯致病性[10]。然而，近年來鴨新城疫出現頻率增加，且毒力也有明顯增強的趨勢。NDV不同致病性的復雜性狀是由多個基因型決定的，最主要是取決于病毒毒力以及宿主先天免疫反應的結果。新城疫病毒可以誘導宿主的天然免疫反應[20]，抗體反應和細胞介導免疫反應對闡明機體感染NDV后的一系列免疫應答是同樣重要的。

本試驗對番鴨利用滴鼻點眼的方式接種Md/CH/LGD/1/2005強毒株，發生個別番鴨死亡情況，有明顯的組織剖檢癥狀，并伴有組織器官不同程度的病理損傷。這一結果現象與Shi等[21]以點眼滴鼻的方式接種鴨源NDV后部分白羽番鴨出現的發病癥狀和死亡情況的研究結果相同。而石悅等[22]選用鴨源NDV以同樣方式接種紹鴨，未見紹鴨有明顯發病癥狀和死亡情況。以此推測這可能是由于不同品種的鴨對NDV強毒的反應和敏感性不同。而Dai[23]也證實了這一觀點，通過將同一鴨源NDV分別感染北京鴨和綠頭鴨發現，綠頭鴨在攻毒后3～5 d全部死亡，而北京鴨無明顯癥狀。許麗文等[10]將與本試驗同一鴨源NDV毒株感染紹鴨后，鴨沒有臨床發病癥狀和死亡情況發生，且感染后鴨排毒期間在攻毒組咽喉及泄殖腔拭子中均檢測到NDV。進一步說明NDV強毒株對不同鴨源致病性的差異。

番鴨感染NDV強毒后血清抗體檢測顯示，在感染NDV后72 h開始產生陽性抗體，此時能夠抑制病毒的復制，且在第7 d抗體水平達到最高峰，在16 d左右進入抗體滴度平臺期?？贵w變化規律與王秋玲[16]研究結果相同。本實驗中NDV在感染后72 h即能達到最高復制水平，其病毒增殖復制速度非常之快。而體液免疫應答則須在感染后3～5 d才開始產生特異性中和抗體，并在7 d時達到最高抗體水平。就實驗過程中番鴨的死亡情況來看，盡管抗體產生時間相對較晚，但仍可以發揮很好的保護作用。這表明ND疫苗的初次免疫在番鴨的生產和養殖中非常重要。

大量研究表明禽β-防御素不僅具有廣譜抗細菌的活性，參與機體抗菌反應[24]。同時具有免疫調節特性，可誘發炎癥反應促進機體適應性免疫[25]。為了探究番鴨是否在接種NDV強毒后會誘導AvBD基因在體內組織中的表達，本試驗探討了感染該病毒后AvBDs在不同組織中的表達量。結果表明該NDV強毒感染番鴨后能夠誘導AvBD的表達。Xu等[26]在鵝感染NDV 36 h和72 h后，發現在鵝的脾臟和肝臟中該病毒載量與對照組相比差異顯著，且鵝AvBD4、AvBD16等AvBD基因表達量與病毒載量相關性差異顯著，證明新城疫病毒可誘導鵝AvBD的產生。此研究與本試驗結果一致，且與傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）[27]和鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）[28]感染紹鴨和北京鴨引起的組織中AvBD表達水平變化一致。在SPF北京鴨感染DHV后，可誘導胸腺AvBD4和骨髓AvBD7表達，并呈時間依賴性，相反，DHV感染后，盲腸扁桃體、脾臟、法氏囊和胸腺中AvBD12的表達顯著降低，在某些時間點檢測不到AvBD12的表達[12]。這與本試驗中AvBD12的表達情況相似，但與骨髓中AvBD7的表達量恰恰相反。云驁[29]建立雞AvBD2和AvBD6的體外表達進行抗ALV-J試驗，發現雞AvBD2和AvBD6可以協同抵抗病毒感染，證明防御素可以激活免疫反應。Liu等[30]的結果顯示，NDV能顯著誘導雞胚成纖維細胞產生AvBD2，且在兩個重組AvBD2蛋白中，只有在真核細胞中表達的蛋白在體外對新城疫病毒F48E9株具有直接的抗病毒活性。本試驗中番鴨在接種NDV 36 h和72 h后AVBD2在多個組織中表達量顯著上升，推測AVBD2可發揮重要抗病毒作用。雛雞在感染白痢沙門菌后，可在十二指腸中檢測到AvBD2、4、5、6、7、9的表達水平明顯上升，其中AvBD6的升高幅度最大[31]。而本實驗中檢測到AvBD2、3、4、5、6、7、16顯著表達的組織是在法氏囊中。以上我們可以得出：禽β-防御素在機體組織中分布具有組織特異性，且不同種禽類的在組織中的表達有明顯差異，這可能是由于不同的β-防御素在抗菌、抗病毒過程中所起作用不同所造成。另有研究發現，AvBDs對FadV-4（禽腺病毒）[32]、MDA（馬立克氏病病毒）[33]、ALV-J（禽腫瘤病病毒）[21]、金黃色葡萄球菌和沙氏菌[34]有抵抗作用。綜上所述，實驗證明AvBDs在禽類先天防御系統的抗病毒過程中發揮重要作用。

番鴨經鴨源基因Ⅶ型ND強毒株（Md/CH/LGD/1/2005）感染后出現臨床發病癥狀和死亡現象，經血清抗體檢測發現NDV能夠引起番鴨機體內的免疫應答反應，通過定量檢測證明組織中AvBDs表達量的顯著高表達，積極的參與了番鴨抗NDV的免疫調控。揭示了該鴨源NDV毒株感染所誘導番鴨體內天然免疫反應的分子基礎，為后續禽類ND的防控提供一定參考意義。