犬博卡病毒流行病學調查及基因序列分析

程 群，韓宏曉，郁達義，趙秋華，孫安幫，馬福余，陳美松，王海根，孫 清

（上海市閔行區動物疫病預防控制中心，上海 201109）

博卡病毒（Bocavirus,BoV）為無囊膜的線性單鏈DNA病毒，屬于細小病毒亞科（Parvovrinae）。博卡病毒最初于20世紀60年代在犬中發現，隨后在人、大猩猩、豬、奶牛、貓等多種哺乳動物中檢測到博卡病毒的存在[1-6]。博卡病毒感染后能引起呼吸道和消化道癥狀，其中消化道的癥狀以引起人或動物的腹瀉為主，博卡病毒的流行與傳播對人或其他哺乳動物的健康構成較大的威脅。

犬博卡病毒（Canine bocavirus,CBoV）屬于博卡病毒亞家族的成員之一，其基因組大小約為5.4 kb，含有3個開放閱讀框，分別編碼NS1、NP1和VP1/2蛋白[7]。近年來，中國、德國、美國、意大利、韓國和日本等多個國家相繼報道了犬博卡病毒的存在，并發現犬博卡病毒包含CBoV1、CBoV2和CBoV3三種基因型[8-10]。然而，犬博卡病毒的流行情況及遺傳演化情況仍不清楚，因此，我們對上海地區犬糞便中的犬博卡病毒感染及病毒的遺傳演化情況進行分析，揭示犬博卡病毒在上海犬中的存在情況，為犬博卡病毒的致病性相關研究及潛在的犬博卡病毒傳染病的預警和防控提供科學依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品采集 自2019年6月至2019年12月，從上海市分別采集犬新鮮糞便206份，糞便樣品凍存于-80℃備用。

1.2 主要試劑 PBS磷酸鹽緩沖液購自Thermo公司；DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR所用試劑購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自OMEGA公司。

1.3 糞便樣品處理 取-80℃保存的糞便樣品置于冰上融化，按照質量體積比為1∶10的比例加入PBS磷酸鹽緩沖液，糞便懸液于渦旋儀劇烈震蕩5 min，然后4℃條件下12 000 ×g離心5 min，吸取200 μL上清液置于新的無菌1.5 mL離心管中，以備后續提取核酸使用。

1.4 DNA提取及反轉錄 糞便樣品按照DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit試劑盒說明書提取病毒DNA，提取出的DNA用60 μL的無RNase水溶解，-20℃保存備用。

1.5 PCR擴增 根據參考文獻[8]合成能夠特異性擴增CBoV1、CBoV2和CBoV3三種基因型的通用引物，CBoV-F：5'-AARAGRAARCTYTATTTTGC-3'，CBoV-R：5'-TGCCAGTCTTGWGGHGARAA-3'。以糞便cDNA樣品為模板對CBoV片段進行擴增，擴增CBoV1、CBoV2和CBoV基因片段大小分別為377、386、404 bp。PCR反應體系（50 μL）為：dNTP Mixture（2.5 mmol/L）8 μL，10× LATaqbuffer 5 μL，LATaq0.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，共32個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行純化，膠回收產物送生工生物工程（上海）有限公司測序鑒定。

1.6 CBoV全基因擴增 根據NCBI公布的基因序列（GenBank登錄號：KY038922）設計特異性擴增引物（表1），擴增陽性樣品中CBoV的全基因序列。根據SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書擴增CBoV基因組的5' RACE和3' RACE。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行純化，膠回收產物送生工生物工程（上海）有限公司測序鑒定。

表1 PCR擴增引物Table 1 The primers of the PCR amplification

1.7 序列分析 PCR擴增序列經SeqMan軟件組裝成完整的CBoV基因組，利用NCBI的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找病毒基因組開放閱讀框，通過MEGA 5.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與討論

2.1 CBoV PCR檢測 采集的206份糞便處理后經PCR擴增后發現其中有3份樣品呈現CBoV陽性，對擴增出的PCR產物進行測序，結果顯示擴增出的核酸片段為CBoV序列。對序列進行分析發現，3條序列間的同源性為94.5%～99.9%，由此推測擴增出的3種CBoV屬于同一種屬。以上結果表明所采集的犬糞便中含有CBoV，CBoV的陽性率約為1.5%。

2.2 CBoV全基因擴增 為了進一步了解CBoV基因組特性，我們根據NCBI公布的基因序列（GenBank登錄號：KY038922）設計并合成了3對特異性擴增引物，擴增CBoV的全基因序列。擴增的PCR序列經3次重復驗證無誤后，利用SeqMan軟件組裝成完整的CBoV基因組。經分析發現CBoV基因組全長5246 bp，包含249 bp的5' UTR，4853 bp的開放閱讀框和144 bp的3' UTR（圖1）。CBoV基因組中A+T的含量占50.3%，G+C的含量占49.7%。通過ORF Finder查找CBoV的主要開放閱讀框發現，CBoV主要編碼三種蛋白：非結構蛋白（non-structural protein,NS）編碼基因位于基因組250～2631 bp，核衣殼蛋白（nucleoprotein,NP）編碼基因位于基因組2396～2983 bp，病毒衣殼蛋白（VP1/2）編碼基因位于基因組2967～5102 bp。

圖1 CBoV基因組結構示意圖Fig.1 Schematic representation of CBoV genome organization

2.3 CBoV基因進化樹分析 為了進一步比較檢測出的CBoV與其他種屬CBoV的系統發育關系，我們把CBoV基因組全長、NS1基因、NP1基因和VP1基因分別與已報道的其他博卡病毒基因組進行比對分析，結果發現，擴增出的CBoV基因型屬于CBoV2（圖2）。從系統進化樹中可以看出擴增出的CBoV與香港（JQ692591）、韓國（KP281720）和廣州（KY038922）等亞洲分離株親緣關系較近，處于同一個分支，同屬于CBoV2。

圖2 CBoV進化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CBoV

近年來，新發和再現的病毒性傳染病不斷出現，嚴重威脅著人類與動物的健康，逐漸成為全球關注的重要公共衛生問題。尤其是近幾年對人類健康造成重大威脅的人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、埃博拉病毒（Zaire Ebola virus,EBOV）、嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV）、中東呼吸綜合征病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）以及2019年底暴發的新型冠狀病毒SARS-CoV-2等[11-13]，這些病毒性傳染病的最初宿主都是動物，病毒在其不斷的遺傳演化過程中逐漸突破物種屏障，通過與人類接觸，最終感染人類。犬作為人類的伴侶動物，與人接觸比較頻繁，其攜帶的病原體容易對人的健康造成潛在的威脅，因此及時對犬攜帶病毒進行調查，掌握病毒的遺傳變異情況，能夠為防控潛在的犬源傳染病提供參考。

博卡病毒能夠感染人、犬、貓、豬、牛和大猩猩等多種哺乳動物，感染宿主較為廣泛。人博卡病毒的感染與呼吸道癥狀相關，在2016—2018年廣州地區急性呼吸道感染（acute respiratory tract infection,ARTIs）兒童中的調查發現，博卡病毒的總檢出率為4.24%，而≤2歲患兒感染率為86.98%，表明了博卡病毒是誘發部分嬰幼兒喘息性疾病的重要病原體[14]。2014—2015年黑龍江牡丹江地區腹瀉犬糞便樣品中CBoV的陽性率高達20%，推測犬博卡病毒可能與犬病毒性腹瀉相關[15]，然而也有學者從健康犬中檢測到CBoV的存在[8]，因此對于犬博卡病毒的流行情況與治病情況還有待于進一步研究。我們在上海地區犬糞便樣本中檢測到CBoV，通過基因組比對分析發現檢測出的CBoV屬于CBoV2，與其他亞洲分離株親緣關系較近，處于同一個分支。CBoV的流行病學調查和基因組特征分析有助于監測CBoV在犬中的流行情況，評估對于犬健康的潛在威脅，為CBoV的致病性研究及潛在的傳染病預警和防控提供科學依據和理論參考。