灰樹花多糖對多囊卵巢綜合征大鼠癥狀的改善作用

種超杰，吳亞琪，董哲文,2，李婉螢，鐘淑媚，王子嫻，周燕園,5*，宋家樂,6,7*

（1.桂林醫學院藥學院，廣西桂林 541199）（2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016）（3.桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林 541199）（4.柳州市人民醫院臨床營養科,廣西柳州 545026）（5.廣西糖尿病系統醫學重點實驗室，廣西桂林 541199）（6.廣西環境暴露組學與全生命周期健康重點實驗室，廣西桂林 541101）（7.桂林理工大學國家母嬰乳品健康工程技術研究中心南亞分中心，廣西桂林 541004）

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是育齡婦女期最常見的內分泌性疾病。據統計，全世界育齡期婦女PCOS的發病率高達5%～10%[1]。在中國，19～45歲的漢族女性人群中PCOS的發病率為5.6%[2]。臨床上，PCOS的主要特征為高雄激素血癥，排卵功能障礙，以及超聲下卵巢呈現多囊形態[3]。肥胖（尤其是腹部肥胖）、胰島素抵抗、高胰島素血癥、心血管疾病均與PCOS的發生有較強的相關性[4]。研究表明，PCOS患者體內存在異常的氧化應激水平，而這一生理事件被認為是促進PCOS病理發展的潛在誘因之一[5]。

二甲雙胍（Metformin，Met）是一種噻唑烷二酮衍生物，是臨床PCOS治療的常用藥物之一。Met可以提高PCOS患者對胰島素的敏感性，改善卵巢排卵功能[6]、抑制卵巢雄激素的合成[7]，但長期服用Met會造成惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道反應以及乳酸中毒和肝腎損害[8]等不良反應。

灰樹花（Grifola frondosa），又稱為“舞茸”，屬于擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，樹花屬，是一種我國傳統食藥兩用真菌[9]。目前，對灰樹花有效成分的研究主要集中于其多糖成分。已有的研究報道指出，灰樹花多糖（Grifola frondosaPolysaccharide，GFPS）具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化、免疫調節和調節腸道菌群等多方面的活性[10]。GFPS不僅可以改善高脂飼料（45%脂肪供能）誘發高脂血癥大鼠的脂代謝紊亂[11]，還可以降低高脂肪與高膽固醇混合飲食倉鼠血清中甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、谷胱甘肽水平，并升高過氧化氫酶水平[12]。本文擬采用來曲唑建立PCOS大鼠模型，通過觀察GFPS對PCOS大鼠動情周期、性激素水平、脂質代謝及氧化應激水平的改善作用，為GFPS用于臨床治療PCOS藥物的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GFPS多糖購自西安瑞迪生物科技有限公司（主要由葡萄糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比依次為3.30:0.12:0.038:0.030:0.018:0.008:0.011）；來曲唑（Letrozole，B25470）購自上海源葉生物科技有限公司；Met（M2009）購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；羧甲基纖維素（Carboxymethyl Cellulose，CMC，S14015）購自西隴科學股份有限公司；巴氏染液（G1612）購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒（C01055）和cDNA逆轉錄試劑盒（D7178M）購自上海碧云天生物技術有限公司；Trazol試劑（DP424）和SuperReal熒光定量試劑盒（FP205-2）購自北京天根生化科技有限公司；雌二醇（Estradiol，E2，MM-0575R1）、睪酮（Testosterone，T，MM-0577R1）、黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH，MM-0624R1）、卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH，MM-70867R1）ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司；TC（A111-1-1）、TG（A110-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C，A113-1-1）和高密度脂蛋白膽固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C，A112-1-1）試劑盒購自江蘇愛迪生生物科技有限公司；丙二醛（Malonaldehyde，MDA，A003-1-2）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，A001-3-2）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Allegra 64R高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter有限公司；Eppendorf 5424R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Leica DM4B顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；ELx808酶標儀，美國BioTek公司；KZ-II高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；ProFlex梯度PCR儀和Quant StudioTM 6 Flex PCR儀，美國Thermo Fisher科技公司。

1.3 實驗動物

總6周齡SPF級雌性SD大鼠32只（190～220 g）購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（生產許可證號SYXK（桂）2019-0004）。所有大鼠飼養于桂林醫學院公共衛生學院SPF級動物房（單位許可證號：SCKY（桂）2020-0005），標準光照/黑暗（12 h/12 h）循環條件下飼養，自由采食并提供清潔飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模與分組

將大鼠隨機分為正常組（n=8）、PCOS組（n=8）、Met組（n=8）、GFPS組（n=8）。正常組每日灌胃生理鹽水，PCOS組每日灌胃1 wt% CMC混懸液（含來曲唑1 mg/kg），Met組每日分別灌胃1 wt% CMC混懸液（含來曲唑1 mg/kg）和Met （265 mg/(kg·d)）[13,14]，GFPS組每日分別灌胃1 wt% CMC混懸液（含來曲唑1 mg/kg）和GFPS （600 mg/(kg·d)）[15]，每只大鼠每日灌胃1 mL，連續灌胃21 d后取材用于后續實驗。本動物實驗方案已通過桂林醫學院動物倫理委員會審查批（GLMC201813009）。

1.4.2 實驗動物動情周期的觀察

以陰道上皮細胞分類染色法觀察實驗動物的動情周期[13,14]。無菌棉簽沾取少量生理鹽水于大鼠陰道內壁順時針旋轉，將采集的細胞均勻涂抹于載玻片上晾干，95vol%乙醇固定30 min。根據染色試劑盒說明書操作進行巴氏染色觀察與記錄。

1.4.3 大鼠臟器質量測定和卵巢組織形態學觀察

實驗結束后，CO2麻醉處死大鼠，腹主動脈取血。使用高速冷凍離心機在4 ℃和3 000 r/min條件下離心10 min制備血清。冰上快速分離卵巢、子宮和內臟脂肪（腹部脂肪、腎周脂肪、子宮周脂肪），并算內臟脂肪相對質量。一側卵巢經10%（V/V）福爾馬林溶液固定行石蠟包埋切片（4 μm）并進行HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織病理學變化。

式中：

A——內臟脂肪相對質量；

m1——內臟脂肪質量，g；

m0——大鼠體質量，g。

1.4.4 血清生化指標的檢測

取1.4.3中制備的血清，按照對應ELISA試劑盒說明操作，檢測大鼠血清中FSH、LH、E2、T水平，并計算LH/FSH比值；檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、MDA及SOD水平。

1.4.5 qRT-PCR技術檢測PCOS大鼠卵巢組織中抗氧化基因酶的mRNA表達

卵巢組織（20 mg）用生理鹽水清洗血污后，Trazol試劑提取總RNA。定量RNA純度后使用SYBR Green定量聚合酶鏈式反應試劑盒檢測抗氧化基因酶Sod1（5′-3′：CGGATAAGAGAGGATGTT，3′-5′：TAGTA CGGCCAATGATGGAATG），Sod2（5′-3′：AGCGTG ACTTTGGGTCTTT，3′-5′：AGCGACCTTGCTCCTT ATTG），Cat（5′-3′：CAGAGGAAAGCGGTCAAGAA，3′-5′：CATTCTTAGGCTTCTGGGAGTT）和Gpx3（5′-3′：GACATCCGCTGGAACTTTGA，3′-5′：CCATCTTGACGTTGCTGACT）的表達水平，以Gapdh（5′-3′：GACATGCCGCCTGGAGAAAC，3′-5′：AGCCCAGGATGCCCTTTAGT）為內參。在總反應體系加入cDNA模板（1 μL），2×superReall PeMiK Pus（10 μL），50×ROX Rltene Dye（0.4 μL），上、下游引物各0.6 μL，最后添加無酶水（7.4 μL）至總體積20 μL，PCR反應程序為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。每個反應設置3個重復，采用2-△△Ct法計算樣品中各基因的相對表達量[16]。

1.4.6 數據處理與統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件進行分析，所有實驗數據以結果以均值（Means）±標準偏差（SD）表示。數據統計方法使用單因素方差分析（ANOVA）進行兩兩比較，組間比較采用最小顯著性差異法（Least Significant Difference，LSD）進行顯著性差異檢驗，方差不齊采用Tamhane T2檢驗，P＜0.05有統計學意義。Graphpad Prism9進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 GFPS對PCOS大鼠動情周期的影響

雌性SD大鼠的動情周期一般為4～5天[17]，其陰道上皮細胞的類型可分為存在大量橢圓形有核上皮細胞的動情前期，存在大多數不規則角化上皮細胞的動情期，存在不規則角化上皮細胞、有核上皮細胞和白細胞的動情后期和以白細胞為主的動情間期等4個典型階段[18]。在用來曲唑誘導的PCOS大鼠經典模型中，可以觀察到模型大鼠伴有激素水平的異常及動情周期紊亂等與人PCOS類似的臨床癥狀[19]。

如圖1a所示，在整個實驗期間正常組大鼠呈現規律的動情周期，而PCOS大鼠的動情周期多處于后期和間期，出現典型動情周期紊亂情況（圖1b～e）。本次研究中所觀察到的PCOS大鼠動情周期長時間處于間期的現象與Wang等[20]所報道的PCOS大鼠動情周期紊亂較為一致。GFPS和Met分別處理后，PCOS大鼠動情周期逐漸趨于正常，提示GFPS能夠有效改善PCOS大鼠所出現的動情周期紊亂。PCOS大鼠動情周期紊亂的原因與下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Ovarianaxis，HPOA）的失衡相關，HPOA的失衡，抑制卵巢E2、FSH水平的產生，導致PCOS大鼠失去規律的動情周期，影響卵泡發育的成熟[21]。GFPS通過改善PCOS大鼠的性激素水平有效的改善了PCOS大鼠動情周期紊亂。Li等[22]的研究表明從灰樹花子實體提取的多糖主要單糖組成為葡萄糖（Glc）、少量的甘露糖（Man）和半乳糖（Gal），三者間的摩爾比為15.2:2.8:1.0，這與本次實驗中我們所使用GFPS的單糖構成較為接近。此外，傳統藥食兩用植物石斛多糖（主要單糖構成為Glc、Man和Gal，其中Glc占比66.2%）也能夠糾正來曲唑誘導的PCOS大鼠紊亂的動情周期[23]。

圖1 GFPS對PCOS大鼠陰道上皮細胞（a）及動情周期（b～e）的影響Fig.1 Effect of GFPS on vaginal epithelial cells (a) and estrous cycle (b~e) in PCOS rats

2.2 GFPS對PCOS大鼠子宮、卵巢形態和卵巢病理學變化的影響

PCOS患者因體內存在過高的雄激素水平，造成卵巢形態異常[24]，同時引發子宮炎癥和血管分布異常等病理現象[25]。與正常組相比，PCOS大鼠卵巢組織和子宮普遍蒼白、供血減少，卵巢包膜增厚且體積增大這一結果與我們前期研究一致[13,14]。GFPS和Met分別干預后上述癥狀明顯改善（圖2a）。HE染色結果顯示，正常組大鼠卵巢中可見多個黃體和不同階段發育的卵泡，少見囊性擴張的卵泡（圖2b）。與正常組相比，PCOS大鼠多個卵泡呈囊性擴張，黃體明顯減少、顆粒細胞層變薄，提示無排卵，這與Rajan等[26]所報道的對卵巢的研究結果一致。經GFPS和Met分別干預后，PCOS大鼠卵巢組織內囊泡減少，黃體增多、顆粒細胞層增厚，部分可恢復至正常卵泡形態。研究顯示鐵皮石斛多糖也可減少PCOS大鼠囊性卵泡、增加黃體數量，增厚卵巢顆粒層[27]，而石斛多糖主要由Glc和Man構成[28]。這一研究也佐證了富含Glc的GFPS能顯著改善PCOS大鼠的卵巢病理癥狀。

圖2 GFPS對PCOS大鼠子宮和卵巢形態（a）及卵巢病理學變化（b）的影響Fig.2 Effect of GFPS on uterine and ovarian morphology (a) and ovarian pathological changes (b) in PCOS rats

2.3 GFPS對PCOS大鼠體重、內臟脂肪及脂質水平的影響

PCOS患者多伴有肥胖，這不僅會加重IR和代償性高胰島素血癥，增加脂肪的生成，同時肥胖使卵泡膜細胞對黃體生成素的刺激敏感，造成高雄激素血癥[29,30]，這些都會阻礙PCOS患者卵泡發育[31]。內臟脂肪的堆積與代謝綜合征、2型糖尿病和心血管疾病的發生相關，它是反映疾病嚴重程度的指標[32,33]。本研究對比各組大鼠體質量和內臟脂肪相對質量發現（圖3），各組大鼠初始體重無顯著性差異，至21 d實驗結束時，PCOS大鼠體重和內臟脂肪相對質量較正常組顯著升高了21.79%和62.22%（P＜0.01）。Met組大鼠體重和脂肪相對質量較PCOS組分別下降了12.20%和23.67%（P＜0.01），GFPS組大鼠的體重和脂肪相對質量較PCOS組分別下降了9.20%和24.08%（P＜0.01）。研究發現，主要構成為Glc的烏龍茶多糖[34]，能顯著降低高脂飲食大鼠體重并減少其內臟脂肪堆積[35]。鐵皮石斛多糖也能降低高脂飲食所造成的小鼠內臟脂肪組織中的炎癥水平[36]，這有力的佐證了GFPS對PCOS大鼠體重和內臟脂肪具有改善作用。

圖3 GFPS對PCOS大鼠體重及內臟脂肪相對質量的影響Fig.3 Effect of GFPS on body weight and relative mass of visceral fat in PCOS rats

進一步檢測大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平發現（圖4），PCOS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平較正常組分別升高了2.48倍、1.87倍和4.97倍（P＜0.01），HDL-C下降了50.00%（P＜0.01）。Met組大鼠血清中TG、LDL-C降低了33.94%、36.81%（P＜0.01），HDL-C升高了2.04倍（P＜0.01）；GFPS組大鼠血清中TC、TG、LDL-C分別降低了82.46%、66.94%、83.71%（P＜0.01）。這與Pan等[37]所研究GFPS降低高糖高脂飼料飲食大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平降低的研究結果一致。但值得注意的是，我們的研究結果顯示GFPS對PCOS大鼠血清HDL-C水平無顯著改善作用（P＞0.05），且Guo等[38]研究結果也提示GFPS對糖尿病小鼠血清中HDL-C水平無顯著性影響。這表明GFPS通過降低PCOS大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平從而發揮調節脂質代謝紊亂的作用。

圖4 GFPS對PCOS大鼠血清中（TC，TG，LDL-C和HDL-C）水平的影響Fig.4 Effect of GFPS on serum levels of (TC, TG, LDL-C and HDL-C) in PCOS rats

2.4 GFPS對PCOS大鼠性激素水平的影響

性激素紊亂作為PCOS患者的典型癥狀其具體的機制可能與HPOA軸失衡和芳香化酶功能失調有關。正常生理情況下，促性腺激素釋放激素刺激垂體前葉分泌LH和FSH。下丘腦的促性腺激素釋放激素脈沖頻率增加會刺激LH的合成，導致LH/FSH比率升高[39]。LH進一步刺激卵泡膜細胞合成雄烯二酮，FSH通過芳香化酶活性影響雄烯二酮向雌二醇的轉化，而來曲唑抑制了芳香化酶活性，導致卵巢中雄激素升高，雌激素下降[40]。卵巢激素水平的紊亂會導致排卵障礙，進一步引發月經生理周期的紊亂并造成不孕癥[41]。

如圖5示，PCOS大鼠血清中激素T、LH和LH/FSH比值較正常組升高了20.59%、23.56%和69.39%（P＜0.01），E2和FSH水平則分別下降了26.25%、37.18%（P＜0.01），這些激素水平的變化與Ndeingang等[42]采用相同造模方法的PCOS大鼠T、LH水平升高、E2降低的研究結果一致。相比PCOS模型組，Met組大鼠的T、LH水平下降了17.69%和22.87%，E2升高了31.30%（P＜0.01）；GFPS組大鼠血清T、LH及LH/FSH比值分別下降20.48%、14.57%和23.63%（P＜0.01），E2和FSH水平則分別升高50.23%和15.00%（P＜0.05）。此外，藥食同源類石斛多糖、黃芪多糖也降低了PCOS大鼠血清T水平、升高了PCOS大鼠血清E2水平[24,43]，而多項關于黃芪多糖的結構研究表明其主要由Glc構成[44]，這為GFPS能夠改善PCOS大鼠異常的性激素水平提供了有力支撐。

圖5 GFPS對PCOS大鼠血清激素（T、LH、FSH和E2）及LH/FSH比值的影響Fig.5 Effect of GFPS on serum hormones (T, LH, FSH and E2)and LH/FSH ratio in PCOS rats

2.5 GFPS對PCOS大鼠血清中MDA及SOD水平的影響

氧化應激在PCOS發病機制中發揮著關鍵作用[45]。MDA、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等是評估氧化應激損傷重要的生物標志物[46]，PCOS患者中的高雄激素血癥、肥胖、胰島素抵抗會引起卵巢中氧化應激水平的異常[47]，主要表現為抗氧化酶水平下降，MDA水平升高[48]。本研究中，PCOS組大鼠血清中MDA水平較正常組升高了2.57倍，血清中SOD水平較正常組降低了5.85%（P＜0.05，圖6）。這與Haslan等[49]所報告的來曲唑誘導PCOS大鼠血清中MDA及SOD水平變化趨勢較為一致。而GFPS和Met干預后，MDA水平較PCOS組分降低了43.52%和38.87%（P＜0.01），SOD水平分別升高了9.90%和6.10%（P＜0.01）。Kou等[50]發現GFPS能降低糖尿病大鼠血清中MDA，升高SOD水平，從而改善氧化應激水平。上述結果支持了GFPS能夠改善PCOS大鼠血清中氧化應激水平這一結論。

圖6 GFPS對PCOS大鼠血清中MDA與SOD水平的影響Fig.6 Effect of GFPS on the serum levels of MDA and SOD in PCOS rats

2.6 GFPS對PCOS大鼠卵巢組織中抗氧化基因酶（Sod1、Sod2、Cat和Gpx3）表達的影響

研究顯示PCOS患者血清中SOD、GPx、CAT等抗氧化酶水平是顯著下降的[51]。多糖具有提高抗氧化酶活性、消除自由基、抑制脂質過氧化的作用，可以減少組織或器官中氧化應激損傷[52,53]。為了進一步探索GFPS對PCOS大鼠氧化應激的影響，我們檢測了PCOS大鼠卵巢組織中Sod1、Sod2、Cat和Gpx3抗氧化基因酶的mRNA表達。如圖7所示，PCOS組織中Sod1和Cat的mRNA表達水平較正常組降低了26.91%、35.06%（P＜0.05），Sod2、Gpx3的mRNA表達水平較正常組降低了72.09%、72.72%（P＜0.01）。Met干預后的PCOS大鼠卵巢組織中Sod1、Cat、Gpx3的mRNA表達水平較PCOS組顯著提高3.90、1.93、3.19倍（P＜0.01），Sod2的mRNA表達水平提高了63.90%（P＜0.05）。GFPS組大鼠卵巢組織中Sod1、Sod2、Gpx3的mRNA表達水平分別較PCOS組提高了3.86、3.16和2.75倍（P＜0.01），Cat的mRNA表達水平提高了1.57倍（P＜0.05）。研究提示經酶解處理提取的灰樹花多糖具有α糖苷鍵構型，主要單糖由Man、Glc和Gal構成，摩爾比為1.00:16.36:5.25，其具有的三螺旋立體構型，會使抗氧化活性更高[54]，這也提示了GFPS對PCOS大鼠機體的氧化應激狀態具有改善作用。

圖7 GFPS對PCOS大鼠卵巢中抗氧化基因酶(Sod1、Sod2、Cat和Gpx3)mRNA水平的影響Fig.7 Effect of GFPS on the mRNA levels of antioxidant gene enzymes (Sod1, Sod2, Cat and Gpx3) in the ovaries of PCOS rats

3 結論

本研究結果表明，GFPS能夠通過改善PCOS大鼠血清中性激素水平，改善PCOS大鼠動情周期的紊亂并促進PCOS大鼠卵泡的成熟和發育。同時，GFPS處理還能降低PCOS大鼠體重的增長，減少其內臟脂肪相對質量，改善PCOS大鼠血清脂質代謝水平。此外，GFPS也通過上調PCOS大鼠卵巢組織中抗氧化基因酶（Sod1、Sod2、Cat和Gpx3）的基因表達水平來改善PCOS大鼠氧化應激狀態（即升高了血清中的SOD水平，并降低了血清MDA水平）。上述結果充分證明了GFPS對PCOS大鼠的癥狀具有較好的改善效果，具體的作用機制可能與其參與調控PCOS大鼠的脂質代謝以及參與對抗氧化應激所導致的機體損傷有一定的關系。本研究同時也為GFPS用于臨床輔助治療PCOS提供了較為有力的研究證據。