豆制品中大豆異黃酮轉化與富集的研究進展

王秀楷，張平安*，喬明武，趙秋艷，宋蓮軍，黃現青

（1.河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市大豆深加工重點實驗室，河南 鄭州 450002）

大豆異黃酮（soybean isoflavone，SI）屬于黃酮類化合物，目前，大豆異黃酮主要分為兩種形式，一種是結合型大豆異黃酮糖苷（soybean isoflavone glucoside），另一種是游離型大豆異黃酮苷元（free soybean isoflavone aglycone）。有研究表明，大豆異黃酮在人體腸道細菌作用下釋放游離型大豆異黃酮苷元，并在小腸上端被機體吸收或轉變為比雌激素活性更高的代謝物，如雌馬酚[1-2]，可以預防骨質疏松和女性更年期綜合癥，還可以抗氧化和抗癌抑癌、保護心血管等，人類吸收和利用大豆異黃酮苷元的速度和數量高于大豆異黃酮糖苷，游離型大豆異黃酮苷元具有更高的生理活性[3-4]，因此提高豆制品中大豆異黃酮苷元的含量十分重要。目前主要是通過酸堿水解法、微生物發酵法和酶水解法轉化大豆異黃酮，酸堿水解法條件苛刻，在豆制品加工中常用的大豆異黃酮轉化方法為酶水解法、微生物發酵法。

我國的大豆制品主要分為兩類，一類發酵豆制品，另一類是非發酵豆制品。目前市面上的大豆制品中，如豆豉、腐乳等含有豐富的大豆異黃酮苷元。非發酵豆制品中主要以大豆異黃酮糖苷為主，含有少量的大豆異黃酮苷元。非發酵豆制品主要有豆腐、豆漿和豆干等，在豆制品生產工序中會損失包括大豆異黃酮在內的許多營養成分，如豆腐加工流失的黃漿水中富含大量營養物質[5]。因此需要通過科學合理的方法防止豆制品中大豆異黃酮的流失。

本文主要從豆制品中大豆異黃酮的主要轉化方法及富集方法兩方面展開綜述，以期為深入研究大豆異黃酮的轉化富集和開發新型功能性大豆制品提供理論依據。

1 豆制品中大豆異黃酮及其苷元概述

大豆異黃酮是大豆在生長過程中形成的次級代謝產物，屬于黃酮類化合物，大豆異黃酮外觀形態是半透明的結晶體，產品是粉末狀的，具有不愉快氣味。目前發現大豆異黃酮母核的結構是3-苯并吡喃酮，根據分子結構的異同分為糖苷型和苷元型（見圖1），共有12 種（見表1）。其中大豆異黃酮糖苷主要有葡萄糖苷、乙?；咸烟擒蘸捅；咸烟擒?，約占總量的97%～98%。

表1 大豆異黃酮12 種存在形式Table 1 12 forms of soy isoflavones

圖1 大豆異黃酮結構式苷元型Fig.1 Soybean isoflavone aglycone

大豆異黃酮苷元主要有大豆苷元、染料木素和大豆黃素，約占總量的2%～3%[6]。據報道大豆異黃酮結構和雌激素結構十分相似，大豆異黃酮與雌激素受體可以相互作用，因此大豆異黃酮又被稱為植物雌激素[7]。在人體中，大豆異黃酮苷元的吸收程度大于相應的大豆異黃酮糖苷，并且大豆異黃酮苷元具有更高的類雌激素活性和抗氧化活性[4]，大豆異黃酮對人體的健康有極大益處，可以降低多種重大疾病的風險。大豆異黃酮的物理性質與結構息息相關[8]，大豆異黃酮苷元熱穩定性好，水溶性最差，易溶于弱極性溶劑，大豆異黃酮糖苷熱穩定性差，可溶于水。

豆類與豆制品是大豆異黃酮的主要來源，王富豪等[9]研究發現，大豆的品種、生長條件、生長地點和生長時間對大豆異黃酮的總含量有不同影響，其中生長年份影響效應最大。劉李婷等[10]通過高效液相色譜法對豆瓣醬、豆腐和豆腐乳等幾種有代表性的大豆制品中異黃酮各組分進行了定量測定，發現不同豆制品中異黃酮種類、含量和分布不同，這不僅與品種、生長條件、生長地點和生長時間有關，更與加工工藝密切相關。在發酵豆制品中，發酵可以改變大豆異黃酮種類及含量，在發酵過程中，菌種含有的β-葡萄糖苷酶活性增強，大豆異黃酮糖苷可以被β-葡萄糖苷酶水解為大豆異黃酮苷元，大豆異黃酮苷元含量升高，發酵后的豆制品中大豆異黃酮苷元為主要存在形式。非發酵豆制品中，β-葡萄糖苷酶含量少而且活性低，只有少量的大豆異黃酮糖苷水解為大豆異黃酮苷元，其余仍以大豆異黃酮糖苷為主要存在形式[11-12]。

2 豆制品中大豆異黃酮的轉化

目前市面上的大豆制品中，發酵豆制品含有豐富的大豆異黃酮苷元，非發酵豆制品中主要以大豆異黃酮糖苷為主，含有少量的大豆異黃酮苷元。在人體和動物體中，大豆異黃酮苷元的功能活性要優于大豆異黃酮糖苷，具有更好的消化吸收率和更大的營養價值[13]。因此，在豆制品的加工工藝中，提高大豆異黃酮苷元含量是十分重要的。目前轉化大豆異黃酮的方法有酸堿水解法、微生物發酵法和酶水解法。酸堿水解方法應用條件苛刻，酸性和堿性較強，副產物多[14]，因此在豆制品加工中應用較少。豆制品加工中常用的大豆異黃酮糖苷轉化方法有酶水解法、微生物發酵法。

2.1 酶水解法

酶水解法是通過β-葡萄糖苷酶、纖維素酶和β-半乳糖苷酶等水解大豆異黃酮糖苷中的糖苷鍵，釋放出大豆異黃酮苷元和葡萄糖，如圖2 所示。酶水解法具有特異性強、反應速度快、反應條件溫和、不產生有害物質、安全、高效等特點，多用于非發酵豆制品加工，如豆漿。酶水解法是目前大豆異黃酮轉化最具發展前景的方法。

圖2 β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷Fig.2 Soy isoflavone glycosides hydrolyzed by β-glucosidase

周文紅等[15]以大豆異黃酮糖苷粗樣為底物，以大豆異黃酮糖苷的水解率為指標，在條件相同時，研究β-葡萄糖苷酶、纖維素酶和β-半乳糖苷酶3 種酶對大豆異黃酮酶解的影響，確定了β-葡萄糖苷酶的水解率最大，并得到β-葡萄糖苷酶的最佳酶解工藝條件：酶解溫度56 ℃，酶添加量7%，pH4.8，酶解時間6 h，在最佳條件下，大豆異黃酮糖苷的水解率達到96.84%。譚乃迪等[16]通過超聲波協同纖維素酶催化大豆異黃酮糖苷粗樣，在最佳工藝條件下，大豆異黃酮糖苷粗樣水解率達到82.91%以上。Silva 等[17]采用半纖維素酶輔助轉化和超聲輔助轉化兩種方法制備富含大豆異黃酮苷元的豆漿，經半纖維素酶輔助轉化和超聲輔助轉化處理的樣品中，大豆異黃酮苷元濃度分別增加了170%和240%，與對照組相比，試驗組的抗氧化能力提高，穩定性更好?？梢圆捎贸暡ㄝo助β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷，縮短酶解時間，更好地應用于豆制品加工。

改善豆漿中大豆異黃酮苷元的濃度，有利于提高豆漿的營養價值。Baú 等[18]在條件為5 ℃，大豆與水的比例1∶3（g/mL），浸泡14 h，以大豆與水的比例1∶8（g/mL）打漿均質后，在50 ℃水浴2.7 h 后，豆漿中大豆異黃酮苷元含量最大。趙石磊等[19]、茍赟等[20]、郭天賜等[21]分別采用來源不同的β-葡萄糖苷酶水解豆漿中大豆異黃酮糖苷，β-葡萄糖苷酶對豆漿大豆異黃酮轉化率的影響如表2 所示。

表2 不同來源β-葡萄糖苷酶在最佳工藝下對豆漿大豆異黃酮轉化率的影響Table 2 Effect of different sources of β-glucosidase on the conversion of soybean isoflavones in soybean milk under the optimal process

由表2 可知，這3 種不同來源的β-葡萄糖苷酶在最佳工藝下均可以提高豆漿中大豆異黃酮苷元含量，源自橡膠籽的β-葡萄糖苷酶在最佳工藝條件下大豆異黃酮轉化率最大，但與另外兩者相比加酶量大、反應時間長。Chen 等[22]采用β-葡萄糖苷酶固定在玻璃微球的方法，水解黑豆漿中的大豆異黃酮糖苷，研究表明，該酶體系可以保持最高酶活40 d，該酶體系處理30 min 后，黑豆漿中大豆異黃酮苷元總含量增加了（51.42±0.17）%。β-葡萄糖苷酶固定化的方法具有可重復使用、連續加工、降低成本、長期穩定等優點。

2.2 微生物發酵法

微生物發酵法是指豆制品生產加工中，通過菌種發酵方式，微生物生長代謝所產生的生物酶能夠水解大豆異黃酮糖苷得到大豆異黃酮苷元，生產富含大豆異黃酮苷元的營養型發酵豆制品。我國許多傳統發酵豆制品的生產都離不開微生物，通過不同的發酵工藝與不同的菌種發酵可以得到不同的發酵豆制品，具有獨特的風味，同時豆制品中的大豆異黃酮苷元含量上升，如豆醬、豆豉、醬油和腐乳等。

劉婧美[23]優化了豆醬發酵工藝，篩選出一種高產β-葡萄糖苷酶的優勢米曲霉，較對照組豆醬中大豆異黃酮苷元含量顯著提高，在發酵最優條件下，染料木素含量為103.03 μg/g，大豆苷元含量為105.12 μg/g，染料木苷含量為15.76 μg/g，大豆苷含量為23.19 μg/g。李大鵬等[24]優化了豆豉發酵工藝，篩選得到高產β-葡萄糖苷酶的菌株菌種后，在最優發酵條件下，較對照組豆豉中大豆異黃酮苷元的含量顯著提高，大豆異黃酮苷元的總含量為684.89 μg/g。Delgado 等[25]優化了醬油發酵工藝，利用乳酸桿菌和雙歧桿菌的菌株發酵得到富含大豆異黃酮苷元的醬油。周帆[26]研究發現，通過植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵豆漿后，豆漿中大豆異黃酮苷元含量顯著提高，大豆異黃酮的生物利用率顯著提升，由36.76%上升至40.86%。Zhang等[27]通過乳酸菌發酵制備得到大豆酸面包，發現β-葡萄糖苷酶活性升高，大豆異黃酮苷元豐富，提高了面包的營養價值。

Zhu 等[28]、Chen 等[29]、上官修蕾等[30]分別研究了不同菌種在豆制品發酵前后大豆異黃酮苷元含量變化。大多數菌株在發酵過程中將大豆異黃酮糖苷完全轉化為相應的苷元，一些菌株發酵后依然存在大量的未轉化的大豆異黃酮糖苷。不同菌株對大豆異黃酮糖苷的轉化能力不同，可能是菌株中酶的種類與含量和樣品中大豆異黃酮的種類與含量有關。微生物法水解條件溫和，得到大豆異黃酮苷元不易變性，人體消化吸收率更高。同時，發酵的豆制品擁有獨特的風味，微生物繁殖周期短，成本低，更有利于實現工業化。

2.3 其他方法

Andrade 等[31]研究發現高溫可以促進丙二酰糖苷轉化為乙?；擒?、葡萄糖苷轉化為異黃酮苷元，在200 ℃下處理全豆粉20 min，丙二酰糖苷含量減少2.5倍，葡萄糖苷和苷元含量分別增加1.2 倍和3.5 倍。據報道，Toro-Funes 等[32]通過高溫和高壓均質處理豆漿，發現高壓均質后豆漿中大豆異黃酮苷元含量沒有顯著性變化，高溫處理后豆漿中大豆異黃酮苷元含量顯著增加。針對不同的豆制品，探索適宜的處理溫度和時間，可以提高豆制品中大豆異黃酮苷元含量。

3 豆制品中大豆異黃酮的富集

由于大豆異黃酮糖苷易溶于水，在豆制品加工過程中，會有大豆異黃酮隨著水流失，降低了豆制品中大豆異黃酮的含量，在豆腐生產加工中大豆異黃酮糖苷損失尤為顯著。李小鳳等[5]發現在豆腐生產過程中壓榨排出的黃漿水含有大量的大豆異黃酮糖苷。為了防止豆腐加工中大豆異黃酮糖苷的流失，目前主要的方法有添加單一凝固劑、復配凝固劑，乳化凝固劑、增稠劑和蛋白酶抑制劑等，可以增加豆腐持水率，富集豆腐中大豆異黃酮。

3.1 凝固劑富集法

凝固劑富集機理是通過蛋白變性形成蛋白凝膠，蛋白凝膠擁有立體網狀結構，保水性強，可以防止大豆異黃酮流失。不同的凝固劑，凝固機理不同，對大豆異黃酮保留程度也不同。δ-葡萄糖酸內酯（gluconoδ-lactone，GDL）屬于酸性凝固劑，在高溫條件下（約90 ℃），通過釋放出葡萄糖酸導致豆漿的pH 值下降，同時減少變性大豆蛋白表面帶負電荷的基團，促進大豆蛋白凝膠形成。關于鹽凝固劑的凝固機理，目前有不同的理論，一是離子橋學說，如圖3 所示，點腦時，鹽類凝固劑中的陽離子（如Ca2+、Mg2+）與蛋白分子結合，產生蛋白-離子橋而形成蛋白凝膠[33]，加熱后，大豆蛋白分子間二硫鍵等價鍵斷裂，由盤區折疊的狀態轉變為松散的大豆蛋白分子鏈，加入鈣鎂離子后誘導形成不同的大豆蛋白凝膠，石膏豆腐形成致密立體網狀結構，持水率強，對大豆異黃酮的保留能力更強。另一種是鹽析理論，熱變性大豆蛋白表面的氨基酸殘基帶負電荷，氨基酸殘基與鈣鎂離子結合后，大豆蛋白質分子間的靜電斥力下降形成大豆凝膠[34]。酶類凝固劑機理是不同蛋白酶可以水解大豆蛋白成較短的肽鏈，有利于大豆蛋白質分子凝結。

圖3 鈣鎂離子誘導大豆凝膠形成對大豆異黃酮的保留Fig.3 Retention of soybean isoflavones by calcium and magnesium ions inducing soy bean gel

不同的單一凝固劑對豆腐中大豆異黃酮保留率不同，龔麗等[35]研究發現GDL 豆腐大豆異黃酮含量最高，為3.04 mg/g；石膏豆腐次之，為2.00 mg/g；鹵水大豆豆腐異黃酮保留最少，為1.84 mg/g。Prabhakaran 等[36]比較了多種鈣鹽、鎂鹽和GDL 對豆腐大豆異黃酮的保留率，研究發現不同凝固劑的凝固速度有差異，可能導致所得豆腐凝膠中的大豆異黃酮保留率有差異，CaSO4作為凝固劑時大豆異黃酮含量最高。蔡梟[37]發現通過添加復合凝固劑可以提高豆腐大豆異黃酮保留程度，得到復合凝固劑最佳配比（CaSO4∶MgCl2∶GDL質量比為40∶30∶30），此時大豆異黃酮得率最高。岳文婷等[38]采用復合凝固劑制作全豆豆腐，分析其營養品質發現，CaSO4與0.3%轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）制作的豆腐中大豆異黃酮的含量顯著高于另外兩組，研究發現TG 交聯大豆分離蛋白使其功能特性發生改變，二硫鍵含量增加，可以提高大豆分離蛋白的凝膠特性，持水性增強，大豆異黃酮含量提高。傳統的豆腐凝固劑對大豆異黃酮的含量有保留作用，其中內酯豆腐中大豆異黃酮保留的最多，GDL 豆腐含水量比鹵水豆腐與石膏豆腐高，大豆異黃酮含量降低，石膏豆腐的大豆異黃酮含量最大，復合凝固劑要優于單一凝固劑。

3.2 增稠劑富集法

增稠劑可以形成水凝膠，水凝膠是高分子聚合物通過物理或化學交聯形成的立體三維網絡結構，能夠吸收并保持大量水分，豆腐的持水率增加，大豆異黃酮糖苷保留率增加[39]。魔芋膠可以增強CaSO4誘導大豆蛋白凝膠的斷裂應力，改變大豆蛋白凝膠的彈性和黏性等流變特性，改善蛋白分子的空間折疊和交聯，凝膠強度增加[40]。高酯果膠和麥麩纖維素以增強蛋白質分子之間的氫鍵相互作用及范德華力的方式提高大豆蛋白的凝膠強度及持水率[41-42]。

不同的增稠劑對豆腐持水性的影響不同，持水性好有助于保留大豆異黃酮。據報道，不同的食用膠體對豆腐中大豆異黃酮的保留影響不同，果膠、明膠、β-環糊精、黃原膠與海藻酸鈉對大豆異黃酮保留無顯著影響，羧甲基纖維素鈉和魔芋膠對豆腐中大豆異黃酮保留呈正面影響，羧甲基纖維素鈉最適添加量為1.00%，魔芋膠最適添加量為0.05%，添加后豆腐中大豆異黃酮含量分別較對照多24%與11%[35]。黃才歡等[43]研究發現復配凝固劑和增稠劑可以顯著提高豆腐持水率，以GDL 為凝固劑，海藻酸鈉及明膠作增稠劑提高了豆腐的產率及大豆異黃酮的保存率。汪建明等[44]在研究富含大豆異黃酮豆腐凝膠時，通過添加不同的食用膠，確定了添加1.25%的卡拉膠可使豆腐得率和大豆異黃酮保留率最高。確定最適卡拉膠添加量后，添加蛋白酶制劑，發現隨著蛋白酶制劑添加量的增加，豆腐得率和大豆異黃酮保留率降低，在后續試驗設計中可以考慮降低蛋白酶制劑添加量。增稠劑對豆腐持水率有正面影響，不同凝固劑與不同增稠劑產生的影響不同，確定最適的添加條件有助于提高豆腐中大豆異黃酮含量。

3.3 乳化凝固劑法

乳化凝固劑是一種新型的凝固劑，乳化劑對鹽類凝固劑溶液進行乳化，形成油包水微粒，形成乳液型緩釋體系減小凝固劑的釋放速度，從而在某段時間內，以實現慢釋或定時釋放的目的，可以提高豆腐持水率，保留豆腐中的大豆異黃酮。目前關于乳液緩釋的機理有不同的看法，Jager-Lezer 等[45]研究發現在內外水相滲透壓不平衡時水溶性分子可以穿過水油界面膜進行傳遞，引起水油界面膜的膨脹。隨著水溶性物質不斷傳遞，水油界面膜不斷膨脹，超過油膜的最大承受能力時水油界面膜破裂，內外水相融合并伴隨著包埋物的釋放，如圖4 所示。

圖4 W/O/W 乳液包埋物溶脹釋放機制Fig.4 Swelling and release mechanisms of W/O/W emulsion embedding

酈金龍[46]認為乳液緩釋的機理在于擴散和滲透機制，其在試驗中發現多重乳液水滴的粒徑和濃度不隨著時間發生變化，同時，該研究者以W/O 及W/O/W 乳液包埋無機鹽MgCl2制作乳化凝固劑，并用于豆腐加工中，能夠顯著提升豆腐干基中總大豆異黃酮的保留率，可以提升11%～46%。錢麗穎等[47]發現MgCl2凝固劑點腦時，Mg2+與蛋白質之間反應太快，凝固反應速度不均衡，質構粗糙持水率下降，用MgCl2乳化液為凝固劑制作的豆腐持水率更高。朱巧梅等[48]研究發現W/O乳液型鹽鹵凝固劑有利于提高豆腐的保水性，從而提高豆腐的產量。

乳液型緩釋體系的主要應用領域為醫藥和日用化工領域，而在豆制品加工領域，處于實驗室模擬應用階段，通過選擇不同的乳化方式和不同種類的乳化劑對凝固劑進行乳化，對乳液型緩釋體系進行合適研究和改良，研發新型乳化凝固劑增強豆腐持水率，有助于生產富含大豆異黃酮的豆腐，兼具科學意義與應用價值。

4 總結與展望

大豆異黃酮具有多種生理活性功能，是天然的植物保健品，在食品保健方面應用前景廣闊。研究豆制品中大豆異黃酮的轉化與富集，有助于生產富含大豆異黃酮苷元的功能性豆制品。目前大豆異黃酮的轉化主要集中在發酵豆制品中，然而在非發酵豆制品中如豆腐和豆干等，關于大豆異黃酮的轉化研究較少。豆制品中大豆異黃酮糖苷易溶于水造成豆制品中大豆異黃酮的損失，最常用的富集方法是添加凝固劑和增稠劑，不同的凝固劑對異黃酮的保留效果不同，形成豆制品的風味和口感不一樣，鹵水豆腐對大豆異黃酮的保留效果最差。乳化凝固劑在豆制品加工中應用較少，為了提高非發酵豆制品中的大豆異黃酮苷元的含量，以下幾項研究可以成為今后研究工作的重點。探究乳化凝固劑的緩釋機理，研究O/W 和W/O/W 乳液包埋物在豆漿中的釋放過程，形成大豆凝膠對大豆異黃酮的保留能力；探究非發酵豆制品中酶轉化大豆異黃酮的最優生產工藝，提高非發酵豆制品中大豆異黃酮苷元的含量。