PCR與G-四鏈體聯用可視化鑒別人參與西洋參

劉墨祎,汪香君,汪洺卉,李迎,劉麗梅

(北華大學 醫學技術學院,吉林 吉林,132013)

人參和西洋參均為五加科人參屬的草本植物,其根、莖等部位均可入藥,藥用價值極高[1-2]。由于人參和西洋參為人參屬近緣物種,兩者形態和化學成分較為相似,因此市場上將兩者摻雜混用現象時有發生[3]。但人參與西洋參在藥性和藥效上存在較大差異:人參性溫,補氣助陽,適合體質為寒性的人服用;而西洋參性涼,易于補氣養陰,適合陰虛體質或者燥熱的人服用[4-6],兩者在臨床上不可混用。目前國內外對人參和西洋參的檢測方法包括形態學、化學分析法和分子生物法[7-8],但都易受到外部環境條件、加工過程和人為主觀因素的影響。因此,急需建立一種簡單高效的人參和西洋參鑒別方法。

G-四鏈體(G-quadruplex)是由富含鳥嘌呤(G)的DNA或RNA序列形成的一類獨特的核酸結構[9-10]。G-四鏈體有3種不同的拓撲結構,分別為平行式、反平式和混合式[11]。CHENG等[12]研究發現,不同的結構下G-四鏈體的穩定性不同,且與氯高鐵血紅素結合能力也不同[13]。穩定的G-四鏈體結構可在K+作用下與氯高鐵血紅素(Hemin)結合,形成具有類似辣根過氧化物酶活性的模擬酶(DNAzyme),在H2O2存在的條件下催化ABTS由無色變為綠色[14]。根據這一原理已實現對金屬離子[15-17]、核酸及蛋白等小分子物質[18-19]的檢測。G-四鏈體形成的具有氧化酶活性的模擬酶(DNAzyme)與酶相比,具有熱穩定性、高催化效率、易于制備和修飾等特點[20]。本實驗將PCR技術與G-四鏈體功能特點結合,以人參與西洋參基因組DNA上的特異性snp位點,設計了5′端含有G-四鏈體互補序列的上下游引物,通過PCR擴增目標序列,獲得大量含G-四鏈體的雙鏈DNA,并形成G-四鏈體結構的DNAzyme,建立了針對人參和西洋參的PCR與G-四鏈體聯用的可視化鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中的人參和西洋參樣品均由國家參茸檢驗檢測中心提供;引物,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Premix TaqTM,寶生物工程(大連)有限公司;ABTS、氯高鐵血紅素(Hemin),上海源葉生物科技有限公司;植物基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;PCR產物純化回收試劑盒,北京博邁德基因技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LX-100手掌型離心機,江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;ETC811型基因擴增儀,蘇州東勝興業科學儀器有限公司;梯度電泳分析儀、酶標儀,Bio-Rad公司;凝膠成像分析儀,德國耶拿公司;DNA/蛋白質分析儀,Quawell公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取

用植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA,DNA濃度通過DNA分析儀檢測獲得。

1.3.2 引物設計

在NCBI上查找人參和西洋參的基因組序列,利用DNAMAN進行多序列比對。發現人參和西洋參在18S基因上存在snp位點,依據snp位點設計出用于特異性識別和擴增人參基因組序列的上下游引物。上游引物序列為:5′-ATAACAATACCGGGCTGATAC-3′;下游引物序列為:5′-GCCAGTTAAGGACAGGAG-3′,并在引物的5′端加上一段G-四鏈體的反向互補序列,修飾后的上游引物序列為:5′-CCCACCCACCCACCCATAACAATACCGGGCTGATAC-3′;修飾后的下游引物序列為:5′-CCCACCCACCCACCCGCCAGTTAAGGACAGGAG-3′,其中5′-CCCACCCACCCACCC-3′為G-四鏈體序列[(G3T)3G3]的反向互補,在K+的存在下可形成平行的G-四鏈體結構,且穩定性好,可視化反應結果明顯[21]。

1.3.3 PCR反應體系和條件的優化

以人參和西洋參的基因組DNA為模版進行PCR反應體系和條件的優化。首先在無模版的體系下進行PCR,檢測1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L引物濃度下引物二聚體的形成對G-四鏈體顯色反應的影響;然后進行引物濃度與模版濃度之間的優化,引物濃度梯度設置為2、4、6、10 μmol/L,模版濃度梯度為0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL;最后確定最適的PCR退火溫度,退火溫度梯度設置為54、58、62、66、70 ℃。

最終對比PCR和顯色結果確定反應體系:10 μL Premix TaqTMDNA聚合酶,4 μL DNA(10 ng/μL)模版,1 μL上下游引物(10 μmol/L),加雙蒸水至20 μL。PCR擴增條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性25 s,54 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,72 ℃延伸5 min,30個循環。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳(120V,40 min)進行鑒定,利用凝膠成像系統對結果進行觀察分析。

1.3.4 可視化反應體系的優化

將用DNA純化回收試劑盒回收得到的PCR產物加入20 μL結合緩沖液(25 mmol/L HEPES pH 7.4、20 mmol/L KCl、200 mmol/L NaCl、質量分數0.05% Triton X-100、體積分數1%的DMSO與2 μL不同終點濃度Hemin溶液充分混勻,終濃度梯度為0.005、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L。95 ℃孵育5 min完成G-四鏈體的折疊。之后4 ℃孵育8 min,使G-四鏈體與Hemin充分結合。加入20 μL不同終點濃度的ABTS,終濃度梯度為3、10、30、45、60 mmol/L,以及2 μL H2O2(3%)室溫避光反應至變色,酶標儀測定420 nm處的吸光度值,選擇最優的可視化結果進行后續的實驗。

1.3.5 特異性檢測

為驗證特異性,分別對4組人參樣品和4組西洋參樣品的基因組DNA進行提取。按照優化后的反應條件和最適體系進行PCR擴增與G-四鏈體聯用可視化檢測,測定420 nm處的吸光值,驗證本實驗方法的特異性。

1.3.6 靈敏度檢測

將提取的人參基因組DNA進行稀釋,濃度梯度為:0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL,根據已優化好的反應條件和最適體系進行PCR擴增與G-四鏈體聯用可視化檢測,測定420 nm處的吸光值,以檢測本實驗方法的靈敏度。

1.4 數據處理

數據處理采用Excel,柱狀圖和折線圖的繪制采用GraphPad Prism8,并采用Adobe Photoshop軟件對圖片進行組合排列。每組實驗數據進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系以及條件的優化

2.1.1 無模版情況下引物濃度對可視化顯色效果的影響

和普通PCR引物不同,本實驗在PCR上下游引物的5′端加入了G-四鏈體反向互補序列進行修飾,這樣可能會導致引物二聚體更易形成,并干擾實驗結果。為了排除這一干擾因素,將引物稀釋為1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L的梯度濃度,對其進行G-四鏈體與PCR聯用可視化檢測。由圖1-a可知,在不同引物濃度下,無模版的PCR體系在擴增后未產生目的條帶,且引物濃度與引物二聚體的增加成正比;由圖1-b可知,引物濃度對顯色反應無明顯影響,且在420 nm下吸光度值之間無明顯差異。因此,無模版情況下引物濃度對G-四鏈體與PCR聯用可視化顯色效果沒有明顯影響。

a-PCR產物凝膠電泳圖;b-G-四鏈體可視化檢測顯色效果和420 nm處吸光值圖1 無模版PCR體系里引物濃度對G-四鏈體顯色反應的影響Fig.1 Effect of primer concentrations in a PCR reaction system without templates on the G-quadruplex colorings reaction注:M-Marker DL2000;1～8分別為1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L。

2.1.2 PCR體系中引物濃度對模版DNA濃度的優化

根據PCR擴增的原理,在模版濃度不變時,引物濃度增加會導致PCR產物的增加,反之亦然。所以找到最適的引物濃度與其相對應的最適模版濃度對PCR反應的優化尤為重要。從圖2可以看出,當引物濃度為10 μmol/L時,可檢測出最低濃度為0.1 ng/μL的模版,因此選擇引物濃度為10 μmol/L作為后續實驗的引物濃度。且在此引物濃度下,模版濃度為10 ng/μL時,電泳圖的目的條帶最為明顯,所以選擇模版濃度為10 ng/μL進行后續的實驗。

a-2 μmol/L;b-4 μmol/L;c-6 μmol/L;d-10 μmol/L圖2 PCR反應體系中引物濃度與模版濃度之間的優化Fig.2 Optimization of the ratio of primer to template in a PCR reaction system注:M-Marker DL2000;1-陰性對照;2～6為0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL

2.1.3 PCR反應退火溫度的優化

退火溫度也是PCR反應中重要的影響因素,退火溫度的高低會影響PCR產物的產生,找到最適合反應體系的退火溫度至關重要。在以上優化條件的基礎上將退火溫度梯度設置為54、58、62、66、70 ℃,觀察反應結果。圖3為退火溫度為54、58、62、66、70 ℃下PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖,可見退火溫度為54 ℃時,條帶最明顯,因此選擇退火溫度為54 ℃進行后續實驗。

圖3 PCR反應退火溫度的優化Fig.3 Optimization of PCR reaction annealing temperature注:M-Marker DL2000;1-陰性對照;2-54 ℃人參PCR產物;3-54 ℃西洋參PCR產物;4-58 ℃人參PCR產物;5-58 ℃西洋參PCR產物;6-62 ℃人參PCR產物;7-62 ℃西洋參PCR產物;8-66 ℃人參PCR產物;9-66 ℃西洋參PCR產物;10-70 ℃人參PCR產物;11-70 ℃西洋參PCR產物

2.2 可視化反應體系的優化

2.2.1 Hemin終濃度的優化

將反應體系中的Hemin終濃度設置為0.005、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L進行反應,對比顯色結果得到最適的Hemin濃度。如圖4-a可見,在420 nm處隨著Hemin濃度的增高,人參PCR產物吸光度值不斷增加,當濃度>0.5 mmol/L時增加較少,說明G-四鏈體產生的量趨于飽和。且觀察對比圖4-a中人參組與西洋參組的顯色變化,在Hemin濃度為0.5 mmol/L時有明顯差異,所以Hemin終濃度定為0.5 mmol/L。

a-Hemin濃度;b-ABTS濃度圖4 Hemin濃度、ABTS濃度的優化Fig.4 Optimization of Hemin and ABTS concentration

2.2.2 ABTS終濃度的優化

將反應體系中的ABTS終濃度設置為3、10、30、45、60 mmol/L進行反應,對比顯色結果得到最適的ABTS濃度。如圖4-b可見隨著ABTS濃度的增加,在420 nm處人參PCR產物的吸光度值先是上升,到達30 mmol/L濃度時開始下降,且觀察對比圖4-b中人參組與西洋參組的顯色變化,在ABTS濃度為30 mmol/L時顯色有明顯差異,所以ABTS終濃度選擇為30 mmol/L。

2.3 特異性檢測

按照已優化好的反應體系,將4組人參樣品和4組西洋參樣品的基因組DNA作為模板,進行PCR反應,再對PCR反應產物進行G-四鏈體顯色反應。如圖5可見4組含有人參基因組DNA的反應體系均有明顯的顏色變化,且4組含有西洋參基因組DNA的反應體系無明顯顏色變化;在420 nm處的吸光度值對比,人參組和西洋參組也有明顯差異。因此表明本實驗的PCR與G-四鏈體聯用可視化鑒別人參與西洋參的方法具有很高特異性。

圖5 特異性檢測Fig.5 Detection of specificity注:1～4為人參樣品;5～8為西洋參樣品

2.4 靈敏度檢測

根據已優化好的體系,分別將濃度為0.1、0.5、1、5、10 ng/μL的人參基因組DNA作為模板,進行PCR反應,對PCR反應產物進行G-四鏈體顯色。如圖6可知,含有1、5、10 ng/μL濃度人參基因組DNA的反應體系顯色反應有變化,且在420 nm處的吸光度值與空白對照有明顯差異;而含有0.1、0.5 ng/μL人參基因組DNA的反應體系顯色反應沒有明顯變化,在420 nm處吸光度值與空白對照無明顯差異。所以當樣品中含有1 ng/μL的人參基因組DNA時,即可通過本實驗的G-四鏈體與PCR聯用可視化方法鑒別檢測。

圖6 靈敏度的檢測Fig.6 Sensitivity detection

3 討論

近年來隨著科學技術的發展,人參與西洋參的鑒別方法也在逐漸進步,越來越多的現代生物技術被應用到其中[22],包括DNA條形碼鑒定[23]、DNA分子遺傳標記技術[24]、蛋白質指紋圖譜分子鑒定技術等[25]。但都存在著不同的缺點,無法做到簡便快速地鑒別人參與西洋參。G-四鏈體作為一種具有氧化酶活性的模擬酶,具有熱穩定性、催化效率高,易于制備和修飾等優勢[20],已被廣泛用于核酸、蛋白或小分子的檢測中,且檢測效率高、特異性強,適用于現場的快速檢測[26-27]。但目前G-四鏈體的研究和應用還存在一定的局限性,例如,在金屬離子的檢測中,所能檢測的金屬離子種類過少;比色傳感器中,可用顯色底物只有幾種;缺乏對優化傳感系統和消除基質效應的研究等。在以后研究中如能更好地優化和發揮G-四鏈體的作用,可將其應用到更廣泛的領域中去。

PCR作為一種核酸擴增技術,可通過變性、退火、延伸組成的多個循環反應使模版序列以指數倍擴增,在核酸檢測領域中得到廣泛應用。傳統的PCR結果分析一般采用瓊脂凝膠電泳技術,但存在操作復雜、結果無法直接觀察等缺點。本實驗將G-四鏈體與PCR技術的優勢相結合,設計了5′端含有G-四鏈體反向互補序列的PCR引物,通過對目的序列的擴增產生大量的G-四鏈體序列,最后G-四鏈體催化底物顯色使PCR結果可在肉眼下直接觀察。

綜上所述,通過將G-四鏈體與核酸擴增技術相結合,我們建立了一種可視化鑒別人參與西洋參的方法,相較于目前已有的人參和西洋參的鑒別方法,耗時更短、靈敏度更高、成本更加低廉。且PCR的引物設計簡單,使該方法更易于普及。但對于參類產品的鑒定中,相比于實驗樣品DNA的提取效率可能會更低,顯色結果顏色更淺,肉眼比色鑒定時靈敏度可能會變低;顯色反應時ABTS變色的時間沒有明確的標準,需要時刻進行觀察;G-四鏈體在反應中生成的效率也會受到結合緩沖液pH、陽離子、溫度等因素的影響,對實驗的操作環境要求較高。

4 結論

目前,利用G-四鏈體與PCR聯用鑒別人參與西洋參的相關研究尚未報道。本實驗所建立的針對人參與西洋參的 PCR與G-四鏈體聯用的可視化鑒別方法,相比于其他生物技術鑒別方法,無需測序和電泳,在室溫下便可用肉眼直接觀察結果。含有人參基因組DNA的樣品,在引物作用下通過PCR擴增,獲得大量含G-四鏈體的雙鏈DNA,并形成G-四鏈體結構的模擬酶,催化ABTS顯色。

在本實驗中G-四鏈體的形成是最后達到可視化鑒別的關鍵,所以如何設計適合的引物使G-四鏈體更好地形成是本實驗的重點。G-四鏈體具有多種拓撲結構,包括平行結構、反平行結構和雜合結構等[26]。不同序列的G-四鏈體其結構和DNAzyme活性都不同,根據現有的對G-四鏈體結構與DNAzyme活性的研究結果[21],本實驗選擇的G-四鏈體序列為[(G3T)3G3],可形成平行的G-四鏈體結構,且穩定性好,具有較高的過氧化物酶活性。

本實驗針對人參與西洋參基因組DNA,將PCR技術與G-四鏈體功能特點結合,建立了鑒別人參和西洋參的PCR與G-四鏈體聯用的可視化鑒別方法,靈敏度可達0.1 ng/μL。且該方法具有穩定性好、操作簡便、便于觀察等優點,為中藥材鑒定提供了新的思路。