超高壓處理對鮮切萵苣酶促褐變及相關基因表達的影響

林德勝,帥良,劉云芬,潘中田1,,蔡文,殷菲朧*,梁園麗*

1(大連工業大學 食品學院,遼寧 大連,116034)2(南昌師范學院 化學與食品科學學院,江西 南昌,330023)3(賀州學院 食品與生物工程學院/廣西康養食品科學與技術重點實驗室,廣西 賀州,542899)

萵苣(LactucasativaL.)是我國重要的蔬菜作物,口感清新爽脆,富含氨基酸、維生素及多種礦物質,深受大家喜愛[1]。萵苣嫩葉易損傷,外表皮易纖維化,不耐貯藏,莖用萵苣在食之前須去皮,因此適合于鮮切加工[2]。鮮切萵苣食用方便,能滿足消費市場的多元要求,近年來廣受消費者的青睞。但是萵苣含水量高,酚類物質含量豐富,萵苣切割處理后容易引起組織代謝紊亂,貯藏銷售過程中極易褐變[3]。這使鮮切萵苣的保質期大大縮短,嚴重影響鮮切萵苣的商品價值。研究發現,褐變是導致鮮切果蔬類制品失去商品價值的最大原因,因此,控制褐變的發生也是鮮切萵苣貯藏保鮮亟需解決的關鍵問題[4]。近年來,對延緩鮮切萵苣褐變方法的研究取得了較大的成效,其中最常用的技術是物理和化學處理,主要包括氣調包裝[5]、紫外照射[6]、生物提取物[7-8]。

超高壓技術(high pressure processing,HPP)是一種以改善食品特性、達到殺菌和鈍化內源酶等為目的的純物理加工技術[9]。研究表明,HPP處理不僅能延緩多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)引起的酶促褐變,還能夠最大限度避免熱處理帶來的營養成分損失和相關質構特性的改變[10]。汪薇等[11]發現HPP處理(100～500 MPa)可抑制鮮切蓮藕的PPO活性并減緩色差變化,其中500 MPa處理的色差變化最小;郭淼等[12-13]利用HPP處理鮮切冬瓜和甜瓜均抑制了PPO和過氧化物酶(peroxidase,POD)的活力。目前,關于HPP對鮮切萵苣褐變影響的相關研究未見報道。本研究采用不同壓力(100、200、400 MPa)處理鮮切萵苣,在低溫貯藏條件下,研究HPP處理對鮮切萵苣褐變相關生理指標及基因表達的影響,為鮮切萵苣的酶促褐變控制提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萵苣,采收于廣西賀州市農業科學院實驗基地;植物RNA提取試劑盒(Quick RNA Isolation Kit)、反轉錄試劑盒(Super Script cDNA Synthesis Kit),北京華越洋生物科技有限公司;實時熒光定量PCR試劑,日本TaKaRa公司;引物合成及測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他試驗試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HPP.L2-550/1超高壓設備,天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司;3nh色差儀,深圳市三恩施科技有限公司;TA.XT PLUS質構儀,英國Stable Micro Systen公司;KH30R-Ⅱ高速冷凍離心機,艾本德中國有限公司;UV-1780紫外可見分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司;BF-6100迷你微孔板離心機,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;TC-96/G/H(b)B G100基因擴增儀,杭州博日科技有限公司;CFX Connect熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;RXZ-500B人工氣候箱,寧波市科技園區新江南儀器有限公司;NanoDropND-2000分光光度計,美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鮮切萵苣處理

采收的萵苣當天運回實驗室;挑選大小相似,無病蟲害的新鮮萵苣進行削皮處理并切成0.5 cm的薄片,全部混勻后將一部分萵苣切片裝進真空袋中進行抽真空處理,分別在超高壓設備下進行100、200、400 MPa的壓力處理4 min。處理完成的樣品從真空袋中取出分別對照(CK)放到生鮮塑料盤,每個處理裝16盒,每盤裝12片,用0.02 mm的聚乙烯保鮮膜封裝后放置在4 ℃、相對濕度85%的培養箱中貯藏,于0、2、4、6、8 d分別取樣拍照觀察,樣品經液氮速凍后放進-80 ℃的超低溫冰箱中保存,用于后續的指標測定以及基因表達分析。

1.3.2 色度a*值測定

使用色差分析儀測定,隨機選擇30片鮮切萵苣的中心點進行測定。

1.3.3 失重率的測定

采用稱重法計算。

1.3.4 硬度的測定

參照祝競芳等[2]的方法略加修改。采用物性質構儀進行測定,探頭型號P/5。檢測參數:觸發力為5 g;測前、測中和測后速度均設為2 mm/s。每種處理測定6個樣品,硬度單位為g。

1.3.5 褐變度的測定

參照帥良等[14]的方法進行測定。

1.3.6 總酚、類黃酮的測定

參照劉云芬等[3]的方法進行測定。

1.3.7 PPO、POD的測定

參照YILDIZ等[15]的方法稍作修改。3 mL的PPO反應體系包括0.1 mL粗酶液,1.9 mL 0.2%愈創木酚,1 mL 0.1% H2O2。3 mL的POD反應體系包括0.2 mL粗酶液,2.8 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚。

1.3.8 苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonia lyase,PAL)的測定

參照ASSIS等[16]的方法略加修改,4 mL的反應體系包括0.5 mL粗酶液,2.5 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸,2 mL蒸餾水,搖勻后在40 ℃恒溫箱保溫1 h,最后用0.1 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應,在波長290 nm處測定吸光值。以每小時OD變化0.01為1個酶活力單位(U)。

1.3.9 丙二醛(malondialdehyde,MDA)的測定

參照謝曉宇[17]的方法進行測定。

1.3.10 褐變相關酶基因表達分析

參照RNA試劑盒說明書提取萵苣總RNA,總RNA純度和濃度使用分光光度計在260 nm下測量。萵苣的RNA樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于反轉錄等后續實驗。

使用反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA。以18S rRNA基因(GenBank序列號HM047292.1)作為內參基因來定量不同基因qRT-PCR產物的量,所用熒光定量引物詳細信息如表1所示。20 μL PCR反應體系包括10 μL BlasTaqTM2X qPCR MasterMix;0.5 μL上游引物;0.5 μL下游引物;8 μL H2O;1 μL cDNA。利用2-ΔΔCt方法計算LsPPO、LsPOD、LsPAL在貯藏過程中的表達量。

1.4 數據處理

使用Excel 2021進行數據處理,顯著性差異以及相關性分析使用SPSS 26.0和Origin 2021進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 鮮切萵苣在貯藏過程中外觀品質的變化

由于機械損傷,萵苣在鮮切處理后極易發生褐變。由圖1可知,CK組和100 MPa處理組的鮮切萵苣經過8 d貯藏已經嚴重褐變,失去了食用價值。其中經200 MPa處理的鮮切萵苣,在貯藏8 d后出現了輕微的褐變現象,而經400 MPa處理后的鮮切萵苣在整個貯藏期內都沒出現褐變現象。由圖1可以直觀發現HPP處理可有效抑制鮮切萵苣的褐變,更好地保持萵苣的原始顏色,維持較高的商品價值。

圖1 不同處理條件下鮮切萵苣貯藏期間外觀品質的變化Fig.1 The quality change in the appearance of fresh-cut lettuce during storage under different treatment conditions

2.2 HPP處理對鮮切萵苣色度及褐變度的影響

色澤是影響鮮切果蔬商品價值的重要因素,不同鮮切果蔬褐變的顏色不一樣,而萵苣的褐變大部分是紅褐色[18]。色度a*值表示樣品顏色由綠色變紅色區域變化的參考值;褐變指數是反映鮮切果蔬褐變程度的重要指標之一[15]。由圖2可見,鮮切萵苣的色度a*值和褐變指數都隨著貯藏時間的延長逐漸增加,其中HPP處理能顯著抑制鮮切萵苣褐變度的增加(P<0.05)。在貯藏第8天,100、200、400 MPa處理鮮切萵苣的褐變指數分別為對照組的70.63%、67.41%和49.29%。這一變化趨勢也與鮮切萵苣在貯藏過程中外觀品質的變化一致,其中400 MPa處理組的鮮切萵苣在整個貯藏期間的褐變指數最低,說明400 MPa處理效果最好,能夠有效保持萵苣的原始顏色和維持較高的商品價值。

a-a*值;b-褐變指數圖2 HPP處理對鮮切萵苣貯藏期間色度a*值及褐變指數的影響Fig.2 Effect of HPP treatment on a* value and browning index of fresh-cut lettuce注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.3 HPP處理對鮮切萵苣貯藏過程中失重率和硬度的影響

萵苣水分含量豐富,失重率是判斷新鮮度的重要指標之一。由圖3-a可知,鮮切萵苣的失重率隨對照貯藏時間的延長而不斷增加,各組的變化趨勢一致,對照組的質量損失率在整個貯藏期內始終高于處理組。其中400 MPa處理組失重率上升最緩慢,從貯藏的第2天開始,400 MPa處理組質量損失率依次為0.82%、2.15%、3.22%、5.87%,顯著低于CK組(P<0.05)。這表明HPP處理可以減緩鮮切萵苣水分散失,延緩質量損失率的升高。由此可見,特定條件的下的HPP處理能更好地保持鮮切萵苣的新鮮度。

硬度是衡量鮮切果蔬感官品質的重要指標,鮮切萵苣中水分損失和細胞結構的破壞會導致硬度下降,造成組織軟焉[2]。此外,硬度變化還與果蔬中果膠酶水解果膠有關,HPP處理可能會鈍化萵苣中的果膠酶[12]。如圖3-b所示,不同處理條件下,鮮切萵苣的硬度隨著貯藏時間的延長而逐漸下降。在貯藏前4 d,HPP處理組的硬度高于對照組;其中在貯藏第2天,200和400 MPa處理組顯著高于對照組(P<0.05),貯藏4 d后,CK組與各處理組均無顯著性差異(P>0.05)。這可能是貯藏后期,HPP處理導致細胞結構損傷程度加重以及失水率升高有關。由此可見,HPP處理沒有降低貯藏過程中鮮切萵苣的硬度,反而在貯藏前期可以維持較高的硬度。

2.4 HPP處理對鮮切萵苣總酚以及類黃酮含量的影響

果蔬組織中的酚類物質是酶促褐變發生的基礎,酚類物質作為酶促褐變的底物已經在多種鮮切果蔬的研究中得到證實[19]。如圖4所示,HPP處理可有效減緩鮮切萵苣在貯藏期間總酚及類黃酮的積累,其中200和400 MPa處理分別對抑制總酚含量和類黃酮含量積累效果最顯著(P<0.05)。其中,CK組和100 MPa處理組的類黃酮含量在貯藏第2天開始迅速上升,200、400 MPa處理顯著抑制了貯藏過程中類黃酮的上升,且顯著低于CK組。貯藏至第8天時,處理組的類黃酮含量都顯著低于CK組(P<0.05)。綜上結果表明,HPP處理可以有效延緩鮮切萵苣貯藏過程中酚類物質積累,這與劉云芬等[3]的研究結果相一致。

a-總酚;b-類黃酮圖4 HPP處理對鮮切萵苣貯藏期間總酚和類黃酮含量的影響Fig.4 Effects of HPP treatment on total phenols and flavonoids in fresh-cut lettuce during storage

2.5 HPP處理對鮮切萵苣貯藏過程中PPO和POD活力的影響

PPO在酶促褐變中扮演著重要的角色,與果蔬褐變密切相關[20]。在氧氣存在的情況下,PPO可以利用氧氣將酚類物質氧化為醌類,后者聚合成棕色色素的積累,導致褐變并降低商品價值[21]。由圖5-a可知,與CK相比,HPP處理能夠顯著抑制PPO活力(P<0.05),從第2天開始PPO活力隨貯藏期的延長而下降,其中400 MPa處理對PPO活性的抑制最明顯,在第8天僅為對照組的32.7%。由此可知,HPP處理可有效抑制PPO活力的增加。

a-PPO;b-POD圖5 HPP處理對鮮切萵苣貯藏期間PPO和POD活力的影響Fig.5 Effects of HPP treatment on PPO and POD activity of fresh-cut lettuce during storage

POD可以將酚類物質催化成醌。PPO和POD對氧化酚類具有協同作用,這是因為POD可以在PPO的存在下加速褐變反應[22]。由圖5-b可知,對照組的POD活力隨貯藏時間延長而逐漸上升,而HPP處理組的POD活力在貯藏至第6天后才上升。從貯藏第2天開始,HPP處理組的POD活力在貯藏過程中始終低于CK組(P<0.05)。以上說明了HPP處理可以顯著抑制POD活力的上升,這一實驗結果與郭淼等[12-13]報道的結果相一致。

2.6 HPP處理對鮮切萵苣貯藏過程中PAL活力的影響

PAL是植物苯丙烷代謝途徑中的關鍵限速酶,可催化L-苯丙氨酸解氨基生成反式肉桂酸,生成的反式肉桂酸可作為底物合成其他酚類物質[23]。PAL活力的增加會加速苯丙氨酸的分解,導致大量酚類物質合成,為氧化褐變提供前體。如圖6所示,對照組的鮮切萵苣在第2天時PAL活力達到峰值,之后趨向平緩。而100 MPa處理組的PAL活力在貯藏前4 d快速上升,達到峰值后緩慢下降;200、400 MPa處理顯著抑制鮮切萵苣的PAL活力,在整個貯藏過程中顯著性低于對照組(P<0.05)。且400 MPa處理組的PAL活力在整個貯藏過程中最低。200、400 MPa處理可有效抑制了鮮切萵苣在貯藏期間PAL活力的增加,這可能是較低的高壓條件可適度激活PAL活性,對于較高的高壓條件,PAL活性被鈍化。綜上,一定壓力的HPP處理可能會導致PAL蛋白結構發生了變化,進而抑制其活力的上升。

圖6 HPP處理對鮮切萵苣貯藏期間PAL活力的影響Fig.6 Effect of HPP treatment on PAL activity of fresh-cut lettuce during storage

2.7 HPP處理對鮮切萵苣MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化重要的產物之一,其含量常用來表征細胞膜系統受損的程度[24]。如圖7所示,處理組和CK組鮮切萵苣的MDA含量都隨著貯藏時間的延遲而增加。與CK組相比,200和400 MPa處理組的MDA含量在整個貯藏期間逐漸升高且顯著高于CK組(P<0.05)。有研究表明,HPP對組織細胞的破環會隨著壓力的提高而加劇[25]。本研究結果表明HPP處理會一定程度上導致鮮切萵苣細胞膜受損。

圖7 HPP處理對鮮切萵苣貯藏期間MDA含量的影響Fig.7 Effect of HPP treatment on MDA content of fresh-cut lettuce during storage

2.8 HPP處理對鮮切萵苣褐變關鍵酶基因表達的影響

為了進一步研究HPP處理抑制鮮切萵苣酶促褐變的機制,通過CK和400 MPa處理組的qRT-PCR分析可知(圖8),貯藏過程中CK組LsPPO、LsPOD、LsPAL的表達量均呈先上升后下降的趨勢。在前6 d貯藏期間,處理組的PPO、POD基因表達量低于CK組,而CK組LsPAL的表達量在整個貯藏過程中顯著下調。這一結果從基因層面驗證了酶活力的變化,說明HPP處理可以有效抑制鮮切萵苣褐變相關酶的活力及其基因表達。

a-LsPPO;b-LsPOD;c-LsPAL圖8 HPP處理對鮮切萵苣LsPPO、LsPOD、LsPAL表達量的影響Fig.8 Effect of HPP treatment on the expression of LsPPO, LsPOD, and LsPAL of fresh-cut lettuce during storage注:*代表相同貯藏時間不同處理間差異顯著(P<0.05),**代表相同貯藏時間不同處理間極顯著(P<0.01)。

2.9 HPP處理對鮮切萵苣褐變的相關性分析

為了更直觀研究HPP與鮮切萵苣褐變之間的相互關系,對CK組和400 MPa處理組數據進行相關性分析。從圖9可以發現褐變指數和色度a*值、失重率、PPO、POD、PAL活力極顯著正相關(P<0.01),這說明了鮮切萵苣褐變和PPO、POD、PAL密切相關,即酶活力越大,鮮切萵苣的褐變情況越嚴重。而褐變指數與失重率以及硬度顯著負相關,這說明了褐變和萵苣水分、質構有著密切聯系,抑制鮮切萵苣褐變可以延緩水分流失以及萵苣硬度的下降,維持鮮切萵苣較高的外觀品質。褐變指數與總酚和類黃酮的含量也呈極顯著正相關(P<0.01),說明酚類物質作為酶促褐變的底物影響鮮切萵苣的褐變。但褐變指數與MDA相關性不明顯,其相關系數為-0.072,這與HPP處理鮮切萵苣導致細胞膜損害有關。褐變指數和LsPPO、LsPOD、LsPAL相關性也不明顯,它們相關系數分別為0.007、0.12、-0.10,其原因可能是分子層面的基因表達比生理要提前,相關酶活性的變化也滯后于基因相對表達的變化。

圖9 HPP處理鮮切萵苣褐變相關指標的相關性分析Fig.9 Correlation analysis of browning indexes of HPP treatment of fresh-cut lettuce注:紅色和藍色分別表示研究參數之間的正相關和負相關;*代表顯著相關,**代表極顯著相關(*P≤0.05,**P≤0.01)。

3 結論與討論

酶促褐變是影響鮮切果蔬貯藏品質和降低商品貨架期的主要原因之一,鮮切萵苣在切分過程中受到機械損傷,使得其在貯藏過程中極易褐變,它的產生與酚類物質及PAL、POD和PPO活性密切相關[25]。因此,控制鮮切萵苣褐變的發生,從控制褐變相關酶活力及底物入手尤為關鍵。HPP處理能夠延長果蔬保質期,并有效抑制園藝產品的次生代謝,但應用在鮮切萵苣護色方面的研究鮮有報道。通過研究不同壓力的HPP處理鮮切萵苣發現,400 MPa高壓處理能夠有效抑制鮮切萵苣a*值的變化及褐變指數的上升,這說明HPP處理可延緩鮮切萵苣表面褐變的出現。植物體內存在大量酚類物質,其中包括了總酚和類黃酮,這些物質是重要的次級代謝物,一方面它具有一定的抗氧化能力,可以修復自身傷害,另一方面作為酶促褐變反應的底物,參與酶促褐變反應[26]。HPP處理可顯著抑制總酚和類黃酮的上升,尤其是400 MPa處理組效果顯著。

HPP處理可以抑制鮮切萵苣體內PPO和POD的活力,且400 MPa處理在貯藏過程中顯著低于CK組。PAL是合成酚類物質的關鍵酶,可催化苯丙氨酸轉化為酚類物質,它通常在植物機械損傷后大量表達,并與褐變密切相關[27]。本研究發現對照組的鮮切萵苣PAL活力隨貯藏時間延長而快速提高,而400 MPa處理可以顯著抑制PAL活力的上升。由此可見,HPP處理鮮切萵苣可以通過苯丙烷途徑抑制PAL的活力來減少酚類物質的合成,進而減少酶促褐變底物的生成。另一方面,細胞膜的完整性與褐變過程密切相關。細胞膜受損后,鮮切萵苣內的酶與底物的區域化被破壞,細胞內的酚類物質與褐變關鍵酶直接接觸。但本實驗研究發現,HPP處理會加快貯藏過程中MDA的生成,這可能是HPP處理達到一定壓力值時會對鮮切萵苣的組織細胞膜造成破壞。因此,HPP處理主要是抑制褐變底物的上升以及褐變相關酶的提高。蔡英豪等[28]研究發現PPO以及PAL活力與褐變度呈正相關。趙喜亭等[29]研究表明PPO、POD和PAL的活力均與褐變度呈正相關,并且其相關性強至弱依次為PPO、POD、PAL,這也與本研究結果高度一致。

傷信號會誘導鮮切果蔬出現復雜的次生代謝,這一過程受到分子層面復雜的調控[30]。通過基因層面了解PPO、POD、PAL等關鍵褐變酶基因的表達,可以深入了解鮮切萵苣酶促褐變的分子機制。本研究通過HPP處理對鮮切萵苣PPO、POD和PAL的影響發現,HPP處理可以顯著抑制鮮切萵苣PPO、POD和PAL的活力,而且通過對照組和400 MPa處理的qRT-PCR分析表明,HPP處理能顯著抑制相關褐變酶LsPPO、LsPOD和LsPAL的表達。易建勇等[31]的研究表明800 MPa以上壓力能有效鈍化蘑菇PPO活力,本研究的HPP處理也有可能改變鮮切萵苣貯藏過程中相關酶的二級結構,鈍化了相關酶的活力。而有關HPP對酶活性結構的改變以及如何鈍化相關酶的機理,尚待研究。

雖然HPP處理會一定程度上導致鮮切萵苣細胞膜受損,但其主要是通過抑制酚類物質合成和褐變相關酶,并且能抑制相關基因表達的提高,從而有效延緩鮮萵苣的褐變和貯藏貨架期。