靈芝三萜類物質液態發酵研究進展

馮 杰,劉艷芳,蘇曉薇,唐傳紅,李娥賢,李樹紅,周 帥,張勁松*

(1 上海市農業科學院食用菌研究所,國家食用菌工程技術研究中心,農業農村部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海市農業遺傳育種重點實驗室,上海 201403;2 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所,昆明 650223)

靈芝為多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌,日常生活中所說的靈芝都是指靈芝子實體,其是我國最受重視的傳統中藥之一,可藥食兩用[1]。 研究表明:由于靈芝的化學成分復雜,使其含有多樣的活性成分[2]。 靈芝已被證明具有治療癌癥、糖尿病和人類免疫缺陷病毒(HIV)病的作用[3],從靈芝中分離出來的主要活性成分有三萜類、多糖類、生物堿類、氨基酸類、油脂類及微量元素等。 靈芝三萜類物質因具有抗腫瘤、保肝、免疫調節、調血脂和降血糖、抗真菌、抗炎和延緩衰老等作用而日益受到國內外研究人員的重視[4-5]。

根據異戊二烯定則,多數三萜被認為是由6 個異戊二烯縮合而成的。 靈芝三萜是羊毛甾烷類衍生物[6],羊毛甾醇是其前體物,羊毛甾烷型靈芝三萜按結構可分為四環三萜和五環三萜,按碳原子數可分為C24、C27 和C30[7]。 根據官能團和側鏈的不同,可將其分為靈芝酸、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內酯等,以靈芝酸和靈芝醇類為主[8]。

靈芝三萜類物質主要存在于野生采摘和人工栽培的子實體或孢子粉以及液態深層發酵的菌絲體中。人工栽培主要分為原木栽培和代料栽培[9],原木栽培主要是椴木栽培,選擇以闊葉樹木為主的木頭栽培[10];代料栽培中代料指將樹木的下腳料和其他輔料如木屑、棉籽殼、麩皮等物質混合制成的培養基,可分為瓶栽和袋栽,目前袋栽應用較為廣泛[11]。 液態發酵是在富含必需營養成分的液態培養基中培養靈芝菌絲體,所獲得的菌絲體具有較高的生物活性,目前主要利用搖瓶和發酵罐培養,前者主要進行菌種的選育和培養工藝的優化,后者則應用于工業化生產[12]。

目前,野生靈芝較為稀少而較難獲取,人工栽培技術不穩定且生長周期較長、成本較高、存在連作障礙,而液態發酵技術有發酵周期短、培養條件易控、不受環境影響、生產效益高、可應用于工業化等優點[13-15],通過液態發酵可獲得高得率的菌絲體及高活性的靈芝三萜。

本文從靈芝三萜生物合成途徑、液態發酵高產靈芝三萜的培養條件調控、外源物對液態發酵高產靈芝三萜的影響等方面重點闡述靈芝三萜類物質液態發酵的進展,并通過總結代謝通量方法在微生物發酵領域的研究進展,討論代謝通量在靈芝三萜類物質液態發酵合成方面的應用前景。

1 靈芝三萜類物質生物合成途徑

1.1 萜類物質生物合成途徑

植物萜類合成主要為質體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑和細胞質中的甲羥戊酸(MVA)途徑。 有研究表明,MEP 途徑合成單萜、二萜和類胡蘿卜素,而MVA 途徑主要合成倍半萜和三萜[16]。 MEP 途徑和MVA 途徑都可以生成前體物質異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),且IPP 可以在細胞質和質體之間穿梭[17],說明MEP 途徑和MVA 途徑并非獨立存在。 不同數量的IPP 與DMAPP 結合生成香葉基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香葉基香葉基二磷酸(GGPP)。GPP、FPP 和GGPP 在萜烯合酶(TPS)的作用下生成不同類型的萜烯[18]。 各類烯丙基焦磷酸酯經特異性萜類合酶作用可產生各種萜類的碳骨架,如植烯、鯊烯等[19]。

MEP 途徑主要是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛(GAP)通過1-脫氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶(DXS)轉化成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(DXP),經過多步反應,最后生成IPP 和DMAPP[18,20](圖1)。 DXS 及DXR 是MEP途徑的兩個關鍵酶,其活性直接影響下游萜類化合物的合成[16]。

圖1 植物萜類物質合成的MEP 途徑Fig.1 MEP pathway for the synthesis of plant terpenoids

MVA 途徑是由乙酰輔酶A(Ac-CoA)經過乙酰輔酶A 硫解酶(AACT)和β-羥基-β甲基戊二酰-CoA 合成酶(HMGS)催化、縮合生成羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA),再由3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMGR)催化生成MVA,MVA 經過多步反應后在甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDD)的作用下生成IPP[21](圖2)。 HMGR 是MVA 途徑的第一個關鍵限速酶,其活性直接影響下游產物的合成[17]。

圖2 植物萜類物質合成的MVA 途徑Fig.2 MVA pathway for the synthesis of plant terpenoids

1.2 靈芝三萜生物合成途徑

靈芝三萜類化合物主要是一類高度氧化的羊毛甾烷衍生物,靈芝酸是靈芝三萜中的一類,主要是通過甲羥戊酸途徑進行生物合成。 甲羥戊酸途徑經過多步反應生成三萜的前體物質:IPP 和DMAPP,在萜類合酶的作用下生成法呢基焦磷酸(FPP),后在鯊烯合酶(SQS)的作用下產生鯊烯(SQ),經多步反應合成羊毛甾醇(LS)。 合成途徑的下游部分是羊毛甾醇,羊毛甾醇在合成靈芝酸的同時還會產生麥角甾醇和酵母甾醇[22](圖3)。 目前羊毛甾醇合成靈芝酸的途徑仍然未知,有研究表明[23],細胞色素P450(CYP450)單加氧酶參與了合成途徑,并且發現CYP450 對應的基因在修飾羊毛甾醇骨架、催化羊毛甾醇合成靈芝酸具有重要作用。 Zhang 等[24]經過多次篩選不同培養條件下與類固醇結合的P450 基因,在靈芝中過表達后發現CYP512v2 表達與靈芝酸T 的積累顯著相關。 Yang 等[25]研究發現,CYP450 基因中的CYP512U6 可以促進靈芝酸DM 和靈芝酸TR 生成靈芝酸Jc,利用釀酒酵母的甾醇還原酶還能夠羥基化改性靈芝酸DM,而CYP505D13 配合生成環狀靈芝三萜[26]。 從羊毛甾醇到靈芝三萜中的CYP450 基因方面的研究較復雜,且羊毛甾醇合成的靈芝三萜化合物種類較多,而CYP450 基因的相關研究成果只是“冰山一角”,所以羊毛甾醇合成靈芝酸這一未知途徑仍需繼續深入研究[27]。

圖3 靈芝三萜合成途徑Fig.3 Synthesis pathway of Ganoderma triterpenes

2 液態發酵高產靈芝三萜的培養條件調控

2.1 培養基因素調控

靈芝液態深層發酵的主要發酵過程與抗生素發酵過程較為類似,其培養基主要由碳源、氮源、無機鹽和微量元素、生長因子等組成。 通過對培養基的優化,可以直接影響靈芝三萜的產生。 王謙等[28]研究發現,玉米粉和葡萄糖較適合靈芝生長,發酵獲得的濕菌絲體產量達到35 g∕(100 mL);楊德等[29]研究表明,玉米粉可以提高靈芝菌絲體生物量至2.05 g∕(100 mL)。 金德寬[30]通過使用不同的碳源、氮源、無機鹽研究培養基組成對靈芝酸的影響,得到最佳發酵工藝條件為蔗糖40 g∕L、豆餅粉1.5 g∕L、KH2PO41.5 g∕L、MgSO41.5 g∕L,生物量和靈芝三萜產量分別為9.15 g∕L 和0.441 g∕L。 馮杰等[31]研究發現,在‘滬農靈芝1 號’培養過程中添加N-10 酵母自溶粉比對照的靈芝三萜產量提高了6.22%。 翟雙星等[32]在基礎培養基中使用不同酵母粉進行有機氮源復配試驗,發現將酵母粉N-1 與N-2 復配添加時,靈芝三萜產量可達0.478 g∕L,比單一添加酵母粉N-1 和N-2 分別提高了21%和139%。 當酵母粉N-1、N-2、N-3 混合添加時,靈芝三萜產量可達0.514 g∕L,比3 種氮源的對照組分別提高了30%、157%和74%。 Wei 等[33]通過葡萄糖蔗糖混合分批補料方式對靈芝進行液態發酵,靈芝三萜產量比對照提高了40%。

2.2 培養環境因素調控

除了培養基因素調控,發酵溫度、發酵時間、溶氧、攪拌轉速、pH 等培養條件對靈芝三萜產量的影響也有相關研究。 溫度對靈芝消耗葡萄糖的速率有一定影響,促使胞內發生各種生化反應,進而影響菌絲體的生長以及代謝物質的生成。 汪金萍等[34]研究發現,28 ℃為靈芝菌絲體最適生長溫度。 Wang 等[35]在靈芝液態發酵過程中對發酵溫度和初始pH 進行調控,發現溫度為28.6 ℃、初始pH 為5.9 時,胞內三萜產量可達到308.1 mg∕L。 Feng 等[36]研究了不同發酵時間段的溫度對靈芝液態發酵的影響,發現在0—61 h 時,32 ℃的發酵溫度促進菌絲體生長;在62—127 h 時,溫度從31 ℃降到30 ℃,保持菌絲體生長的同時促進靈芝三萜的合成;在128 h 后,溫度維持在29 ℃,穩定靈芝三萜的合成,使得產量達到0.269 g∕L。 發酵時間的長短會影響菌絲體的生長及靈芝三萜的生成。 Liu 等[37]研究發現,當培養基中的葡萄糖為44.4 g∕L、蛋白胨為5.0 g∕L、發酵時間為437.1 h 時,可得到菌絲體干重11.3 g∕L,靈芝酸Me 產量4.8 mg∕L。

靈芝液態深層發酵的過程需要氧氣促進菌絲體生長以及在發酵中后期促進靈芝三萜的合成。 有研究表明,較高的氧濃度可以促進菌絲體生長,而較低的氧濃度可以促使靈芝三萜的產生。 通氣量與培養環境下的溶氧直接相關。 Zhang 等[38]研究發現,當溶氧量達到80%時,靈芝三萜產量可達到1.43 g∕L。馮杰等[39]采用5 L 發酵罐研究通氣量對靈芝液態發酵的影響,發現當通氣量為8 L∕min 時,靈芝三萜得率為0.204 g∕L,最大菌絲體得率達到8.77 g∕L。 攪拌轉速也會通過影響溶氧量和剪切力的變化而影響靈芝液態發酵。 馮杰等[40]發現,在發酵40 h 前,將轉速調整為150 r∕min,40 h 后調整至100 r∕min,可得到三萜含量0.720 mg∕(100 mg)。

pH 會影響靈芝細胞膜通透性,進而影響營養物質吸收、產物分泌以及三萜酸合成相關酶的活性[41]。Wang 等[42]在靈芝的液態發酵研究中發現,pH 6.0 是產生靈芝酸的關鍵培養條件之一。 潘江安等[43]在靈芝的液態發酵中提出了四階段pH 控制策略,在0—26 h 時pH 自然,26—36 h 時pH 為4.0,36—81 h 時pH 為4.5,81—168 h 時pH 為5.0,得到菌絲體干重為14.18 g∕L,三萜產量為279.59 mg∕L。 Tang 等[44]運用多階段調節pH 結合溶氧量控制的方法對靈芝液態發酵進行研究,發現初始自然pH、在4 d 時pH 控制在3.0、在6 d 時pH 調為4.5,溶氧量在0—6 d 為25%、6 d 后為10%,靈芝三萜產量可達到754.6 mg∕L。

3 外源物對液態發酵高產靈芝三萜的影響

近年來,靈芝液態發酵過程中添加外源物質促進目的產物的增加已成為一種新的調控手段。 外源添加物可以提高菌絲體生物量和靈芝三萜產量,降低培養基原材料的成本、控制環境條件的耗能。 外源物通過調節代謝產物生物合成途徑中的關鍵酶活性、誘導特定酶的基因表達、改變細胞通透性來最大限度地積累目的產物[45]。

3.1 細胞色素P450 誘導劑和抑制劑

在靈芝三萜生物合成的下游途徑中,細胞色素P450 是從羊毛甾醇到靈芝三萜生成途徑中一個關鍵的影響因素。 Wang 等[46]通過轉錄組動力學分析發現,cyp5150L8 是調節羊毛甾醇的關鍵基因。 Xu 等[47]通過透明顫菌血紅蛋白表達提高靈芝酸的研究發現,cyp512a2、cyp512v2 和cyp512a13 轉錄水平上調,推測這些P450 基因與靈芝酸生成有關。

Liang 等[48]研究表明,靈芝液態發酵中在靜置培養的第5 天添加100 μmol∕L 的細胞色素P450 誘導劑苯巴比妥,總靈芝酸含量、靈芝酸Mk、S、T 和Me 含量都增加,HMGR、SQS 和LS 的轉錄水平均有提高,說明苯巴比妥對靈芝酸合成的誘導作用可能歸因于其對代謝流的促進。 梁翠霞[49]研究發現,在第7 天添加10 μmol∕L 的麥角固醇合成抑制劑咪康唑抑制了麥角固醇合成,促進了羊毛甾醇積累,提高了靈芝酸產量,推測咪康唑對靈芝酸合成的促進作用機制可能是通過基因以外的方式實現的。 Nojokiden 等[50]在靈芝液態發酵的第9 天添加100 μmol∕L 細胞色素P450 誘導劑利福平,靈芝酸產量達到18.6 mg∕g,并發現利福平雖然能夠提高靈芝酸產量,但同時也抑制了菌絲體的生成。

靈芝酸的生成也可能建立在細胞凋亡的基礎上,You 等[51]使用阿司匹林誘發ROS 增加,促使細胞凋亡、靈芝酸生成,角鯊烯合酶和羊毛甾醇的表達合酶編碼基因也有所下調。

3.2 植物激素

植物激素是指植物生長過程中產生的微量但能響應環境脅迫調節自身生理過程的有機化合物,在植物的生長過程中可以調節植物生長、影響次級代謝、激發免疫防御系統等[52-53]。 植物激素作為信號分子可通過激活特定代謝途徑來提高目的代謝產物。 近年來,關于植物激素誘導靈芝酸生成的研究以茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)為主。

辛燕花等[54]在研究MeJA 對靈芝液態深層發酵的影響時發現,在發酵的第4 天添加100 μmol∕L MeJA,靈芝菌絲體中靈芝酸含量積累到最大50.02 mg∕g。 任昂[55]以吐溫-20 為助劑,研究MeJA 對靈芝液態深層發酵的影響,發現在第6 天加入254 μmol∕L MeJA,靈芝三萜含量可達到4.52 mg∕(100 mg)干菌絲體,比對照提高了45.3%。 考察MeJA 對關鍵酶基因轉錄水平的影響時發現,不同濃度MeJA 在不同時間的誘導下,每個基因響應MeJA 誘導的變化情況各不相同,但靈芝三萜生物合成途徑中的羥甲基戊二酰CoA 還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和羊毛甾醇合成酶(OSC)基因被MeJA 上調最為顯著。Cao 等[56]研究發現,SA 能夠誘導靈芝三萜合成,HMGR、SQS 基因的轉錄水平也顯著提高。 Liu 等[57]研究發現,SA 信號可以通過抑制線粒體復合物Ⅲ調節胞內ROS 水平,參與調控靈芝的次級代謝合成。 Ye等[58]研究發現,單獨添加150 μmol∕L SA 誘導靈芝液態發酵時可以提高37.19%的三萜含量,上調法呢基焦磷酸合酶(FPPS)、鯊烯合酶(SQS)和羊毛甾醇合酶(LS)基因的表達,將鈣離子和SA 結合添加可以提高46.9%的三萜含量,上調6 種基因表達,推測SQS 是該途徑的關鍵酶。 褪黑素是一種植物生長促進劑,鮑銳等[59]研究表明,褪黑素可以提高靈芝生物量和促進靈芝酸產生,并推測作用機理可能與SA 誘導靈芝酸生物合成相關酶的基因表達、促進靈芝酸的生物合成相似。 Zhang 等[60]研究表明,靈芝液態發酵中添加乙烯可以提高靈芝酸產量,達到33 mg∕g 干菌絲體,比對照提高了90%,同時羊毛甾醇和鯊烯含量增加。

3.3 油脂物質

油脂物質通過改變真菌細胞膜結構和通透性或直接影響代謝途徑中某些重要的酶活性以促進真菌的次生代謝產物合成。 朱會霞[61]研究發現,當添加油酸、α-萘乙酸、L-谷氨酸時,油酸是影響靈芝酸生成的最顯著因素。 姚強等[62]使用不同的脂肪酸作為外源添加物進行靈芝液態發酵,發現硬脂酸、亞油酸和棕櫚酸對生物量有促進生長,僅亞油酸對胞內三萜表現出較強的促進作用,其他兩者均呈現抑制作用,說明不同脂肪酸對靈芝三萜的產生表現出不同的效果,可能與其鏈的長短以及飽和度的差異有關。

Feng 等[63]考察了6 種外源添加劑油酸、大豆油、正己烷、正十二烷、乙酸乙酯和吐溫-80 對靈芝液態發酵的影響,發現當油酸為主要外源添加劑時,得到最大菌絲干重為12.15 g∕L、三萜產量為0.776 g∕L,說明培養基中加入油酸是最有效的。 孫冰沁等[64]考察油酸對靈芝三萜生物合成途徑中關鍵酶編碼基因的影響時發現,油酸可以上調SQS 和CYP51 基因表達,抑制14α-LDM 酶基因表達,但達到最高靈芝三萜產量時,SQS、CYP51 基因表達上調并不是最高,14α-LDM 基因表達也沒有下調到最低,推測油酸誘導產生靈芝三萜的機理可能是改變細胞膜的通透性或靈芝的基礎代謝、轉錄調控和信號轉導的相關基因轉錄。

薏苡仁油是主要成分含9.26%油酸、17.83%棕櫚酸、31.94%亞油酸的油脂類物質[65]。 黎李平[65]研究發現,當初始pH 為6.9,發酵第2 天添加3%的薏苡仁油時,菌絲體內的靈芝三萜得率為44.01 mg∕g。Yang 等[66]研究發現,與玉米油、紅花油、橄欖油相比,薏苡仁油可以更好地促進菌絲體和靈芝三萜的生長,在第0 天添加薏苡仁油后,菌絲體生物量是對照的3.34 倍,靈芝三萜產量是對照的2.76 倍。 畢澎洋[67]在靈芝液態發酵的第48 小時添加2%薏苡仁油,菌絲體生物量可達到11.44 g∕L,是對照的3.58 倍;在發酵過程的第24 小時添加,靈芝酸產量可達到130.4 mg∕L,是對照的4.04 倍。 Liu 等[68]研究表明,薏苡仁油誘發NO、H2O2的增加,NO 和H2O2參與了薏苡仁油誘導靈芝三萜合成的信號轉導過程,從而促進靈芝三萜含量的提高。 張容容[69]研究發現,在第0 天添加1.5 g∕L 薏苡仁油不僅可以顯著提高靈芝液態發酵的生物量和三萜產量,而且菌絲體細胞在指數生長末期到穩定期間對誘導作用表現最為敏感,說明薏苡仁油可在較長時間內誘導靈芝菌絲體產生次級代謝產物,進一步發現NO 和H2O2作為信號分子在薏苡仁油的誘導過程中具有協同作用。 Zhou 等[70]研究發現,添加0.2%薏苡仁酯可以促進靈芝液態發酵的菌絲體生長,推測薏苡仁酯可作為促進因子影響靈芝液態發酵。

4 代謝通量方法在微生物發酵領域的研究進展

通過靈芝三萜合成途徑可以看出,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應是未知的,無法通過信號通路和基因表達解釋,但也無法規避該反應,所以尋找一種新方法研究靈芝三萜合成途徑的機理是有必要的。 代謝通量方法是代謝途徑中一種常用的研究菌種調控生成代謝產物機理的方法,可以圍繞次生代謝產物合成途徑中的關鍵中間前體進行定量分析,發現是否有同一前體的非目標產物的通量生成,從而進一步深入研究。 代謝通量方法可以直接應用于菌種的初級代謝產物,也可以控制初級代謝產物的通量[71]。

4.1 代謝通量方法在細菌代謝合成目的產物方面的應用

朱文澤等[72]建立了谷氨酸棒桿菌合成L-組氨酸的代謝網絡模型,發現在發酵初期添加檸檬酸鈉能夠改變L-組氨酸生物合成途徑的關鍵節點6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰輔酶A 的代謝流分布,維持糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑與三羧酸循環之間的代謝流量平衡,有利于提高L-組氨酸生物合成途徑的代謝流量,最終使L-組氨酸的代謝流增加了7.86%。 張克旭等[73]應用黃色短桿菌發酵合成L-纈氨酸,通過物料衡算和MATLAB 線性規劃方法,發現發酵中后期L-纈氨酸合成過程中的代謝流量分步主要通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑,再進入三羧酸循環途徑,找到關鍵節點6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸節點,得出降低三羧酸循環的代謝流量,增大糖酵解途徑的流量可以使L-纈氨酸產量增加。

黃金等[74]建立了不同溶氧條件下大腸桿菌合成L-蘇氨酸的代謝網絡模型,對關鍵節點6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及α-酮戊二酸進行代謝通量分析發現,增加磷酸戊糖途徑代謝流量,減少糖酵解途徑和三羧酸循環代謝流量,可以大幅降低碳物質的流失;確定溶氧是發酵中后期的關鍵因素,增加溶氧有利于L-蘇氨酸的生成,抑制副產物生成。 Niu 等[75]建立了大腸桿菌發酵促使甘油生成L-蛋氨酸的代謝網絡模型,發現L-蛋氨酸主要來源于磷酸烯醇丙酮酸轉化為草酰乙酸的途徑,增強磷酸戊糖途徑可提供大量NADPH,增加溶氧水平促使目的產物合成。 Yao 等[76]建立了大腸桿菌產乙醇的代謝模型,對菌株HJ06PN 的產醇通量分布分析發現,磷酸二羥丙酮節點的碳分配將更多的碳從較低的糖酵解途徑逐漸引導到乙醇的生物合成途徑,三羧酸循環減少了乙酸的生成,NADH 轉化為NADPH 的轉氫化通量不斷增大。 Hong 等[77]建立了兩種大腸桿菌菌株高產白藜蘆醇模型,第一株菌株以酪氨酸為前體,通過磷酸戊糖途徑合成對香豆酸,第二株菌株結合第一株菌株產生的對香豆酸和糖酵解途徑合成的乙酰輔酶A 合成丙二酰輔酶A 生成白藜蘆醇,以20 g∕L 葡萄糖為底物可獲得55.7 mg∕L 的白藜蘆醇。 通過代謝通量分析表明,檸檬酸循環和丙二酰輔酶A 供應節點之間的平衡是白藜蘆醇產生的關鍵點。

王澤建等[78]建立了糞產堿桿菌發酵合成凝膠多糖的代謝網絡模型,通過分析葡萄糖和麥芽糖作為底物對凝膠多糖代謝通量的影響,發現麥芽糖比葡萄糖的凝膠多糖得率高出45.8%,原因是以麥芽糖為碳源時磷酸戊糖途徑的絕對代謝通量提升了40%以上。 磷酸二羥丙酮途徑通量的增加提升了NADPH 還原力供給速率,加快了碳源作為底物向產物的摩爾轉化速率。

林美君[79]使用代謝通量方法構建了4 種乳酸菌中央碳代謝網絡模型,找出關鍵節點為6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸,并對乳酸產量和乳酸菌OD 值的相關性進行了研究。

4.2 代謝通量方法在真菌代謝合成目的產物方面的應用

Zhang 等[80]通過代謝通量方法探討了不同氮源對糖多孢紅霉菌8 號產紅霉素的影響,發現在氮源優化條件下,磷酸戊糖途徑為紅霉素合成提供了更多的NADPH。 較高的正丙醇比消耗率促進紅霉素合成,正丙醇通過甲基丙二酰輔酶A 節點流入中樞碳代謝。

Li 等[81]建立了熱帶念珠菌CICC1779 利用葡萄糖和木糖產乙醇的代謝模型,發現溶氧量是高產乙醇的關鍵節點,誘變菌株產生的乙醇為24.85 g∕L,是野生菌株的1.41 倍,溶氧量增加后可以達到26.56 g∕L,且突變株的木糖還原酶和木糖脫氫酶活性均高于原株,表明誘變株可以有效利用木糖促進目的產物代謝。

Tomàs-Gamisans 等[82]研究發現,以甘油為碳源可以促進畢赤酵母產氨基酸。 Hayakawa 等[83]建立了添加乙醇促進釀酒酵母產腺苷蛋氨酸的代謝模型,發現乙醇培養中三羧酸循環和乙醛酸分流的代謝通量水平顯著高于葡萄糖培養,更多的ATP 是由乙醇通過氧化磷酸化產生的。 沈寧燕等[84-85]對法夫酵母發酵生成蝦青素的前中后期進行代謝通量分析,并對關鍵節點乙酰輔酶A、α-酮戊二酸以及5-磷酸核酮糖進行研究,得出在發酵前期,法夫酵母JMU-VDL668 的糖酵解途徑通量增大,為合成新細胞提供前體物和能量;在發酵中后期,三羧酸循環及磷酸戊糖途徑的通量都增大,為細胞內代謝產物的合成提供NADPH和ATP。

4.3 代謝通量方法在其他方面的應用

王景川等[86]建立了螺旋藻合成β-胡蘿卜素的代謝網絡模型,研究了不同溫度對β-胡蘿卜素代謝通量的影響。 Cheah 等[87]研究了長球藻PCC 7942 產醛的代謝通量,發現丙酮酸是其產醛的關鍵節點,在該節點上丙酮酸激酶(PK)和乙酰烯烴合成酶(ALS)與醛產量直接相關,而丙酮酸脫氫酶(PDH)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)的通量隨著醛產量的增加而變化。

5 討論

靈芝是我國著名的藥用真菌,其含有多種活性成分,目前的研究以靈芝多糖和靈芝三萜較多。 靈芝三萜是羊毛甾烷型萜類物質,其具有廣泛的藥理活性,主要來源是子實體和孢子粉以及液態發酵的菌絲體和胞外液,液態發酵以發酵周期短、條件易控制、目的產物較穩定等優點成為獲得靈芝三萜的主要手段之一。

通過培養基組成、pH、攪拌速度、溫度、溶氧量等方面的工藝條件優化可以使靈芝的生物量以及菌絲體三萜含量增加,但單從以上方面進行工藝優化可能需要較高成本,且并不能較大幅度提高單體靈芝酸產量。 通過添加外源物可以從調控靈芝次生代謝產物的關鍵酶活性、關鍵酶基因轉錄水平以及細胞通透性等方面促進靈芝生物量和菌絲體靈芝三萜含量增長,可以避免工業上的成本浪費,降低環境污染等。

目前,外源添加物主要通過活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等信號通路方向進行研究。 通過靈芝三萜合成途徑來看,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應是未知的,無法通過信號通路方面的研究進行解釋,尋找一種新的方法對靈芝三萜合成途徑進行研究進而揭秘其合成機理是有必要的。 另外,目前圍繞靈芝三萜生物合成途徑的研究大多集中在基因方面,可對關鍵酶的基因轉錄水平進行檢測。 由于靈芝三萜合成下游過程中碳環骨架的復雜修飾,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間途徑較為復雜,目前主要聚焦在P450 家族基因的研究。 代謝通量方法可以圍繞次生代謝產物的關鍵中間前體進行定量分析,作為代謝途徑中的一種研究菌種調控生成代謝產物機理的常用方法還未曾在藥用真菌的研究中出現過。 筆者通過國家自然科學基金青年基金項目的實施已建立了靈芝三萜代謝網絡模型,項目通過靈芝三萜代謝通量分析,強化靈芝三萜類物質合成的代謝流向,為提高靈芝三萜的產量奠定了一定基礎。