干旱脅迫下油用牡丹‘鳳丹’基因組DNA 甲基化分析

樊明月,李昱瑩,王 璨,侯小改,郭麗麗

(河南科技大學農學院,洛陽 471023)

全球變暖所導致的干旱等氣候問題對植物造成了嚴重影響[1],降水量不足以及降水模式改變使干旱成為非生物脅迫中最具破壞性及最能影響作物產量的重要因素[2-5],極大限制了植物的正常生長發育[6-8]。 干旱對植物的影響貫穿植物生長發育的各個階段,不僅影響植物的生長形態,還可引起植物體內生理生化發生變化[9-11]。 已有研究證明,干旱脅迫可誘導植物基因組DNA 甲基化狀態發生改變[12-13]。DNA 甲基化是植物自身應對干旱脅迫重要的途徑之一,可通過改變植物基因表達水平,引起不同生理反應,從而適應干旱[14-15]。

DNA 甲基化作為表觀遺傳學的重要研究內容,其在調控基因表達、維持基因組穩定性等方面具有重要作用[16-17]。 隨著對DNA 甲基化的研究日益精進和分子研究技術手段的不斷發展,DNA 甲基化檢測的方法和手段日新月異。 其中,甲基化敏感擴增多態性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術是利用限制性內切酶HpaII 和MspI 對基因組DNA 進行特異性酶切,酶切后獲得不同的DNA切割片段,以此來揭示植物基因組DNA 的甲基化狀態[18]。 該方法中的限制性內切酶HpaII 和MspI 可識別相同的5’-CCGG 序列[19],基于其對胞嘧啶的敏感程度不同,HpaII 選擇性酶切一條鏈被甲基化的位點,而MspI 選擇性酶切雙鏈內側被甲基化的位點,HpaII 和MspI 均可切割無甲基化位點[20-21]。

牡丹(Paeonia suffruticosaAndrews)作為中國傳統名花,在我國有著悠久的人工栽培應用歷史[22],其觀賞價值和藥用價值被廣泛肯定[23]。 油用牡丹‘鳳丹’(P.ostii‘Fengdan’)作為新興的油用作物,籽油品質高,且其生態適應性強[24-25],于2011 年被國家衛生部批準為新資源食品[26-28]。 隨著國家對新型油料作物的大力扶持和油用牡丹產業鏈的不斷完善,人們對油用牡丹的關注度越來越高,不斷深入研究挖掘其潛在價值。 本試驗研究不同干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 的甲基化差異及其變異模式,分析干旱脅迫對‘鳳丹’基因組DNA 甲基化帶來的影響,以期為其在培植繁育等方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河南省洛陽市國際牡丹園內4 年生油用牡丹‘鳳丹’。 挑選長勢良好且生長情況一致的4年生‘鳳丹’,移栽于規格為20 cm×16 cm×13 cm 的花盆中,所有植株的光照條件一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗設對照組(按80%的日蒸騰量57.4 mL 澆水)、輕度干旱處理組(按40%的日蒸騰量28.7 mL 澆水)及輕度干旱復水處理組、重度干旱處理組(干旱過程中不澆水)及重度干旱復水處理組。 不同處理組植株均在干旱處理14 d 后出現表型;對出現表型的輕度干旱復水處理組和重度干旱復水處理組植株進行復水處理,對其正常澆水即為復水,復水處理3 d 后,輕度干旱處理組植株恢復至正常狀態的表型,復水處理5 d 后,重度干旱處理組植株恢復至正常狀態的表型。 隨機選取同一處理組不同植株上的完整葉片,混合放在錫箔紙上,包裹、標記,放入液氮中低溫冷凍保存、待用。

1.2.2 甲基化敏感多態性分析

(1)采用改良的CTAB 法提取處理后的‘鳳丹’葉片基因組DNA[29]。

(2)采用付勝杰等[30]建立的MSAP 反應體系及程序對‘鳳丹’基因組DNA 進行酶切、連接、預擴增和選擇性擴增。 選擇EcoRI∕MspI 和EcoRI∕HpaII 作為雙酶切組合,對‘鳳丹’基因組DNA 進行雙酶切,MSAP分析所用接頭和預擴增引物序列見表1。

表1 MSAP 分析的接頭序列和引物序列Table 1 Adapter sequences and primer sequences for MSAP analysis

(3)為方便酶切體系的配制,需將DNA 樣品質量濃度保持一致(400 ng∕μL),酶切體系共20 μL,包含1 μL 基因組DNA、1 μLEcoRI、1 μLHpaII∕MspI、2 μL 10 ×EcoRI Buffer、2 μLHpaII∕MspI Buffer,用無菌雙蒸水補齊。

(4)酶切后應立即進行連接反應,連接反應體系共20 μL,包含2 μL 10 ×T4 連接酶Buffer、1 μL T4連接酶、0.4 μLHpaII-MspI 接頭、0.4 μLEcoRI 接頭、10 μL 酶切產物,用無菌雙蒸水補齊,連接產物需16 ℃過夜;過夜連接后的產物于65 ℃溫育10 min 后終止反應。

(5)以連接產物作為模板進行預擴增,預擴增反應體系共20 μL,包含10 μL 連接產物、預擴增引物各0.5 μL、0.2 μLTaqDNA 聚合酶、0.4 μL dNTPs、2 μL PCR Buffer,用無菌雙蒸水補齊。

(6)預擴增完成后,用稀釋40 倍的預擴增產物作為模板進行選擇性擴增,MSAP 選擇性擴增反應體系共20 μL,包含2 μL 預擴增產物、特異性擴增引物各1 μL、10 μLTaqDNAMix,用無菌雙蒸水補齊。

(7)配制濃度為6%(體積比)的變性聚丙烯酰胺凝膠,將選擇性擴增獲得的PCR 產物上樣于聚丙烯酰胺凝膠中進行垂直電泳,電壓220 V,電泳時間140 min。 電泳結束后對凝膠進行銀染,觀察條帶。

1.2.3 數據分析

染色顯影后,觀察統計每個PAGE 膠圖版的條帶,在同一位點處有清晰條帶顯示記為“1”,無條帶顯示處記為“0”。 通過Quantity One 軟件讀取MSAP 條帶信息并轉化成表型數據0∕1 矩陣,統計結果制成Excel 表格。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對‘鳳丹’牡丹表型變化的影響

在干旱脅迫下,‘鳳丹’植株的葉片形態變化顯著,葉片長勢明顯變差,具體表現為:輕度干旱時,植株葉片開始下垂,并出現萎蔫和發黃;重度干旱時,葉片出現嚴重的干枯卷曲,葉片數量減少,枝條下垂。 對不同程度干旱處理后的植株進行復水處理,輕度干旱復水的植株仍能恢復其生命活力,外觀上基本恢復正常,葉片皺縮和萎蔫消失,葉片舒展,但與對照植株相比,仍表現出葉片發黃、葉片數量減少的現象;重度干旱的植株復水后也仍具有生命力,但與對照植株相比,葉片發黃且較為皺縮,枝條下垂(圖1)。

圖1 干旱脅迫對‘鳳丹’表型變化的影響Fig.1 Effects of drought stress on phenotypic changes of P.ostii ‘Fengdan’

2.2 不同干旱脅迫下‘鳳丹’牡丹總甲基化狀態

使用EcoRI∕MspI 和EcoRI∕HpaII 組合對樣品DNA 酶切后,檢測出4 種甲基化類型(圖2),分別為I 型(超甲基化):H、M 均無帶,DNA 雙鏈外部甲基化或雙鏈內外部都甲基化,記為(0,0);II 型(全甲基化):H無帶、M 有帶,DNA 雙鏈內部甲基化,記為(0,1);III 型(半甲基化):H 有帶、M 無帶,DNA 單鏈外部甲基化,記為(1,0);IV 型(非甲基化):H、M 均有帶,即DNA 雙鏈的CCGG 位點無甲基化發生,記為(1,1)。

圖2 選擇性擴增凝膠電泳圖譜Fig.2 Selectively amplification gel electrophoresis

以30 對選擇性引物進行擴增,通過觀察比對篩選出多態性豐富、重復性較好的26 對引物組合,使用MSAP 檢測分析不同處理下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化狀態(表2)。 結果顯示,26 對選擇性引物共擴增出932 個CCGG 位點。 對照植株半甲基化位點(III 型)有115 個,半甲基化率為12.34%;全甲基化位點(II 型)86 個,全甲基化率為80.90%。 在不同程度干旱處理組中,輕度干旱和重度干旱的‘鳳丹’牡丹半甲基化位點分別為103 個和101 個,半甲基化率分別為11.05%和10.84%;全甲基化位點分別為140 個和174 個,全甲基化率均為85.09%。 輕度干旱誘導‘鳳丹’牡丹基因組DNA 的半甲基化率下降了1.2%;重度干旱誘導其半甲基化率下降了1.5%;輕度干旱和重度干旱脅迫下,‘鳳丹’牡丹的全甲基化率均表現為上升趨勢,升幅為4.2%。

表2 不同干旱條件下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化水平Table 2 Genomic DNA methylation levels of P.ostii ‘Fengdan’under different drought stress

干旱復水處理組的‘鳳丹’牡丹基因組DNA 半甲基化位點數和全甲基化位點數均發生改變。 統計結果顯示:輕度干旱復水后,‘鳳丹’牡丹的半甲基化位點有119 個,半甲基化率為12.8%,全甲基化位點有161 個,全甲基化率為83.4%,與對照相比,半甲基化率和全甲基化率均呈現上升趨勢;與輕度干旱處理組相比,半甲基化率升高了1.7%,全甲基化率降低了1.7%。 重度干旱復水后,‘鳳丹’牡丹的半甲基化位點有68 個,半甲基化率為9.7%,全甲基化位點有174 個,全甲基化率為85.0%,與對照相比,半甲基化率降低了2.6%,全甲基化率升高了4.1%;與重度干旱處理組相比,半甲基化率降低了1.1%,全甲基化率降低了0.1%。

2.3 干旱誘導的‘鳳丹’牡丹甲基化變化和去甲基化變化

分析不同程度干旱處理后下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化的變異模式,發現26 對選擇性引物在不同處理的樣本中擴增產生了4 種變異模式,共15 種條帶類型(表3 和表4)。

表3 輕度干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化模式的變化Table 3 Changes in genomic DNA methylation patterns of P.ostii ‘Fengdan’ under slight drought treatment

表4 重度干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化模式的變化Table 4 Changes in genomic DNA methylation patterns of Paeonia ostii ‘Fengdan’ under severe drought treatment

模式A:對照和干旱處理組有相同的甲基化CCGG 位點,甲基化位點無變化,該模式包含3 種條帶類型A1、A2、A3,在輕度干旱處理組中占14.78%,在重度干旱處理組中占11.69%。 模式B:與對照相比,處理組DNA 甲基化水平下降,為去甲基化,該模式包含5 種條帶類型,B1—B3 為對照中的甲基化位點變成非甲基化位點;B4 表示與對照相比,超甲基化位點變為半甲基化位點,在重度干旱處理組中該變化高于輕度干旱處理組;B5 表示超甲基化位點變為全甲基化位點。 該模式在輕度干旱處理組中占39.78%,在重度干旱處理組中占46.00%。 模式C 為甲基化模式,包含5 種條帶類型C1、C2、C3、C4、C5,其中C1—C3為對照中的非甲基化位點變成了甲基化位點;C4 為半甲基化位點變為超甲基化位點;C5 為全甲基化位點變成了超甲基化位點。 該模式在輕度干旱處理組中占40.00%,在重度干旱處理組中占38.60%。 模式D為特殊模式,在此類別下,對照與處理組之間的甲基化變異水平不是單純的升高或降低。

3 結論與討論

‘鳳丹’牡丹在遭受干旱脅迫后,其生長發育受到顯著影響。 在不同干旱處理下,‘鳳丹’牡丹的表型發生改變,葉片會出現失水皺縮,對其進行復水處理后,可恢復活力,表明面對干旱脅迫時‘鳳丹’牡丹總體趨向于休眠以應對外界的危害。 大部分高等植物基因組DNA 甲基化水平在30%—50%[31-35],本研究表明,‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化水平明顯高于其他植物。 干旱脅迫下的‘鳳丹’牡丹基因組DNA 半甲基化率隨著干旱程度的增加呈現逐漸下降的趨勢,全甲基化率呈現增加的趨勢;在進行干旱復水后,輕度干旱復水處理組的半甲基化程度和對照基本相同,出現該現象的原因可能是原來某些非甲基化位點發生了甲基化使半甲基化水平略微增加;而重度干旱復水處理組與對照相比,半甲基化水平顯著降低,表明重度干旱對其影響較大,可能導致牡丹基因組DNA 產生了一些不可逆轉的變化。

在長期進化中,植物形成了自身的抗旱機制[36]。 DNA 甲基化在植物抵抗非生物脅迫的過程中發揮著至關重要的作用,使植物得以在逆境中生存[37]。 DNA 甲基化作為一種潛在的可遺傳的表觀遺傳現象,在防御外源DNA 入侵和阻遏轉座子在基因組移動以及調控高等植物基因表達方面具有雙重作用[38-39]。許多研究表明,DNA 甲基化參與了植物對抗非生物脅迫的過程,且已證明DNA 甲基化是植物參與適應干旱脅迫的調節系統中的重要一環。 植物通過調節基因組的甲基化水平,適應外界的非生物脅迫,以保證植物自身能夠適應外界環境而正常生長[40]。

本試驗對干旱脅迫下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化水平變化進行了探究,旨在揭示油用牡丹抗逆能力與其DNA 甲基化程度之間的關系。 ‘鳳丹’牡丹作為多年生木本植物,其基因組龐大而復雜,甲基化水平與植物自身基因組復雜程度緊密相關[34,41],‘鳳丹’牡丹基因組的高甲基化率可能與其自身基因組包含大量轉座子及其他重復序列有關。 面對干旱脅迫,‘鳳丹’牡丹改變自身甲基化水平,其基因組甲基化率上調;在解除脅迫后,‘鳳丹’基因組總甲基化率仍高于對照,表明DNA 甲基化參與了其對抗干旱脅迫的過程。 植物基因組DNA 的甲基化和去甲基化往往還影響著其基因轉錄的激活和抑制[42-45],即影響基因的表達,探究參與干旱脅迫調控DNA 甲基化的基因,挖掘其功能,將成為改良油用牡丹抗性及品質后續工作的重要思路。