土壤中抗生素抗性基因研究進展

陳優,張瑤,肖方景,蔡甲,張強英,布多,崔小梅

(西藏大學 理學院,西藏 拉薩 850000)

抗生素會誘導產生抗生素抗性基因(ARGs),具有在環境中長時間殘留、遠距離遷移傳播等特點,且會造成生物污染[1]。土壤中包含多樣化的微生物,更有利于ARGs的產生和擴散,土壤中ARGs的快速富集膨脹會對植物和微生物造成傷害[2]。此外,土壤是ARGs的重要儲蓄層和匯,富含的微生物為適應復雜多變的環境,自身攜帶多種類型的抗性基因,并會產生與抗生素相關的基因[3]。本文綜述了土壤環境中抗生素及ARGs的來源及賦存特征,總結分析了土壤中ARGs的傳播的影響因素,針對去除土壤環境中的抗性基因的消減技術進行了討論,最后展望了目前土壤中抗生素及抗性基因存在的問題并提出了相關建議,旨在為土壤ARGs的污染防治提供理論依據。

1 土壤環境中抗生素及抗生素抗性基因的來源和賦存特征

抗生素自1940年在臨床上開始使用,有效降低了細菌感染造成的死亡率,增加了人類壽命,但吸收率不高造成大量抗生素進入土壤環境中。2013年抗生素的總使用量為92 700 t,其中約有53 800 t抗生素進入到自然環境且54%排放到土壤環境中。

1.1 來源

土壤中抗生素及ARGs的來源分為內在抗性和外源輸入。研究表明,在未使用抗生素的自然環境下,土壤環境中存在著大量由微生物合成的天然抗生素,某些微生物可以通過隨機突變產生對某種抗生素的抗性,即獲得“內在抗性”。在沒有人類活動干擾的北極凍土中檢測到抗性基因[4],同樣,研究人員對3萬年前凍土沉積物進行了宏基因組分析,并檢測到β-內酰胺、四環素和糖肽抗生素的耐藥性基因[5]。因此,在抗生素被人類廣泛應用于臨床之前,ARGs已經存在于土壤環境中。

外源輸入包括糞便施肥、中水回用、大氣干濕沉降等。糞便施肥是動物體內抗生素進入土壤環境的主要方式。畜禽糞便中含有大量的抗性基因,其種類和豐度高于土壤環境中的ARGs水平,進而導致在施用畜禽糞便制備的有機肥后,土壤中的ARGs豐度增加[6]。此外,施用有機肥會增加重金屬和無機鹽含量,進而改變土壤環境的電導率等其他理化性質,無機鹽、重金屬與抗生素協同作用會進一步促進土壤中ARGs的累積[7]。長期施用有機肥也會改變微生物群落結構,從而增強土壤微生物的耐藥性水平。

畜禽養殖廢水、生活污水和醫療廢水中存在大量的抗生素及抗性微生物,但目前污水處理工藝無法徹底去除廢水中的ARGs,出水中仍有大量殘留的ARGs檢出,進而排放到土壤中。研究表明持續使用中水灌溉的土壤中可以檢測到多種抗生素抗性基因,其豐度和多樣性顯著增加,且ARGs顯著富集,因此再生水灌溉是土壤環境中ARGs的重要來源之一[8]。

另外,大氣干濕沉降也是環境中抗生素及抗性基因進入土壤中的途徑之一。研究表明陸地上的ARGs會以生物氣溶膠形態進入大氣環境中,而空氣環境中的抗性基因又會以雨雪等干濕沉降的形式返回至陸地進入土壤中,從而促進ARGs在環境中的傳播[9]。

1.2 賦存

研究表明中國常見的抗性基因包括喹諾酮類、磺胺類和四環素類 ARGs,并且磺胺類 ARGs比四環素類更穩定[10]。其中,土壤環境中的抗生素及抗性基因種類繁多(表 1),但由于土壤類型的差異,土壤中抗生素及抗性基因的賦存狀態也不盡相同。

表1 土壤環境中常見抗生素及抗性基因種類Table 1 Common antibiotics and antibiotic resistance genes in soil environment

1.2.1 不同土地利用類型 土地利用類型可分為自然地類(草地、林地)和人工地類(旱地、水澆地及園地)。研究發現放牧通過影響可移動遺傳元件(MGEs)、細菌多樣性和細菌群落組成來間接影響ARGs,即可以通過調節草地土壤微生物種群來影響土壤抗性[18]。Song 等[14]在中國原始森林土壤中檢測到許多對現代抗生素具有耐藥性的ARGs,以抗氨基糖苷和編碼失活機制的RNA為主。水澆地通常表現出較高的ARGs積累,因為厭氧條件下可能延長抗生素在土壤中的半衰期,高水分含量也可能阻斷從肥料修正土壤到根莖層的接觸途徑,從而影響ARGs的傳播。水澆地-旱地輪作系統中有機肥施用的增加也會導致土壤ARGs急劇增加。此外,土壤中總ARGs的相對豐度因土地利用的不同而存在顯著差異,工業和交通地區土壤中總ARGs的相對豐度分別比農業土壤高3個和2個數量級。在中國各地的溫室土壤和相應的露天土壤中檢測到磺胺類、四環素類和喹諾酮類ARGs,其中溫室土壤中的ARGs豐度的平均值高于露天土壤,且兩種農業土壤中磺胺類ARGs水平都高于其他類型的土壤[19]。

1.2.2 不同區域土壤環境 不同區域土壤環境中的抗性基因存在明顯差異,近期關于中國各地區ARGs檢出情況(表2)的研究表明 ,土壤環境中ARGs以四環素類、磺胺類和喹諾酮類抗性基因為主,經濟發達的長江三角洲其地區抗性基因的相對豐度明顯高于其它地區,華南地區的抗性基因的相對豐度較低,東部地區溫室土壤中抗性基因的含量和豐度明顯高于西部地區[19]。

表2 中國部分地區土壤環境中檢出的抗性基因種類及相對豐度Table 2 Species and relative abundance of ARGs detected in soil environments in Parts of China(copies/16S rRNA genes)

2 土壤環境中抗生素抗性基因傳播的影響因素

殘留于土壤環境中的抗生素及其選擇壓力是ARGs轉移擴散的主導因素,抗生素的存在促進了ARGs的產生,AGRs與其抗生素的濃度之間存在相關性。但ARGs的遷移轉化并不依賴于抗生素,在低濃度抗生素污染及沒有抗生素污染的地區也存在ARGs[4-5]。ARGs可以通過水平基因轉移(HGT)等方式在細菌間轉移,同時微生物群落結構的不同也會影響ARGs的豐度[23]。此外,有機肥料、重金屬、土壤類型以及抗生素之間的相互作用也會影響土壤環境中抗性基因的傳播。

2.1 有機肥料

有機肥料廣義上是指動植物殘體及其代謝物,包括無機物(氮、磷、重金屬等)和有機物(抗生素、激素、多環芳烴等)。在農業生產過程中,人們經常將動物糞便作為肥料滋養田間作物,以提高土壤肥力[21]。研究表明有機肥處理的土壤中ARGs豐度的增加比無機肥處理的土壤中更顯著[24]。

有機肥類型及不同施肥方法會影響土壤中的ARGs。在長期施用糞肥的農田中觀察到耐藥細菌會隨著施肥次數的增多而增多[25]。Qing等[23]證實了動物源性有機肥是ARGs、抗生素耐藥細菌(ARB)和MGEs的重要載體。Lin等[26]評估了蘇格蘭草地上反復施用不同有機肥料對ARGs的影響,結果表明不同肥料處理后,土壤中檢測到的大多數ARGs的相對豐度隨時間而降低,但多次施加有機肥料會在一定程度上抵消土壤ARGs相對豐度的下降趨勢。實驗結束時幾乎所有土壤的細菌群落與實驗開始時的未處理土壤不同,證明施肥可以影響土壤微生物群落進而影響土壤ARGs的豐度。

2.2 土壤理化性質

土壤理化性質能夠顯著影響土壤中細菌群落結構和功能,細菌群落組成是土壤中ARGs含量的主要決定因素。不同土層的細菌群落結構存在顯著差異,部分外源寄主細菌不能在土壤中定位,無法從表層土壤遷移到深層土壤,且細菌多樣性通常隨著土壤深度的增加而降低[24]。ARGs和共存的細菌類群具有顯著的正相關性[27],細菌群落是ARGs垂直遷移的主要驅動因素,且宿主細菌豐度的變化影響了ARGs的分布。Qing等[23]對暴露于不同肥料的土壤中的四環素抗性基因(TRG)進行了研究, 結果表明土壤理化性質是促進施用有機肥的稻田中TRG分布的決定性因素,其中電導率(EC)是施用動物源有機肥料的水稻土中TRG變化的主要驅動因素。施用有機肥能夠增加土壤中無機鹽和重金屬含量來提高EC[7]。EC作為一個非生物脅迫因子,與土壤鹽度密切相關,故EC可能重塑ARGs的分布[28]。

2.3 重金屬共選擇

重金屬污染能夠影響ARGs的豐度和遷移[29]。重金屬不易降解,穩定存在于土壤環境,可能會對土壤中ARGs的產生提供長期的選擇壓力。重金屬和抗生素也可以通過協同抗性機制、交叉抗性機制以及協同調控機制等方式使ARGs產生共選擇抗性,重金屬含量越高,共選擇抗性的產生也越容易。Wang等[30]通過宏基因組分析發現,在高重金屬含量的土壤中,ARGs和金屬抗性基因(MRGs)普遍同時出現,重金屬可能增強了ARGs和MRG的共選擇抗性。

2.4 土壤類型

土壤類型通過顯著影響土壤性質、細菌豐度和細菌多樣性來影響ARGs的類型。Wang 等[7]從黃河三角洲褐土、潮濕土和鹽堿土中檢測出193個ARGs亞型,其中多重耐藥性和氨基糖苷類抗性基因是最普遍的。土壤類型也會影響ARGs的分布和動態影響因素,潮土和鹽堿土中的ARGs多樣性和相對豐度高于褐土。紅土和黑土中ARGs的分布對微生物群落的變化更敏感,而黃土中水平基因轉移對ARGs的動態分布貢獻更大。此外,土壤中ARGs的相對豐度和粘土含量也有關系[31]。

2.5 其他污染物

人類活動過程中產生了許多新型污染物,比如殺菌劑、農藥、微塑料等,這些污染物進入土壤環境中可以促進水平基因轉移、增加不同細菌類群之間的遺傳物質交換,最終調控抗性基因進化。

殺菌劑可以改變土壤微生物群落結構進而影響ARGs的豐度。研究表明溫室培養過程中由于大量使用殺菌劑,造成溫室土壤比山地土壤具有更多樣性的ARGs,總ARGs的豐度也相應提高[32]。此外,一些殺菌劑可能是溫室土壤中ARGs的共選擇劑,通過MGEs介導的水平基因轉移提高ARGs的豐度。農藥也會改變土壤中ARGs的總豐度,會降低水稻土中ARGs的含量,但對根際土壤中ARGs豐度的影響不顯著[33]。

微塑料具有較大的比表面積,可以吸附土壤中的抗生素、重金屬等污染物,進而提高對ARGs的富集量。相較于傳統塑料,可生物降解塑料具有相對較低的物理強度,可能會產生更多的微塑料顆粒,導致ARGs 豐度顯著增加[34]。微塑料中水溶性的低分子量聚合物可能作為微生物同化的額外碳源,從而誘導土壤中ARGs進化。

3 土壤環境中抗生素抗性基因的消減技術

目前處理環境介質中抗生素抗性基因的方法主要有微生物處理法、吸附法以及高級氧化法。其中土壤中ARGs的消減技術主要包括好氧堆肥、厭氧消化以及生物炭添加等。好氧堆肥和厭氧消化是畜禽糞便的兩種主要處理方法,被認為是減少有機廢物中化學和生物危害的一種常見而有效的方法。

3.1 好氧堆肥

好氧堆肥是指通過好氧微生物將各種有機物轉化為更穩定和更環保的物質的過程,可以防止ARGs從糞便擴散到農田土壤中,以降低多種污染物的生態風險[35]。研究表明好氧堆肥可以有效減少ARGs的傳播和豐度,且工業好氧堆肥比厭氧堆肥效果更好[36]。但在好氧堆肥過程中,更多的ARGs亞型被誘導[37]。高熟糞肥能降低土壤和農作物中ARGs的污染,且土壤中ARGs傾向于向植物根系方向積累[38]。此外,高溫堆肥通過減少抗生素耐藥質粒和相關宿主細菌的豐度,可以有效地清除抗生素發酵廢棄物中的ARGs和相關耐藥基因[39]。

3.2 厭氧消化

厭氧消化是指在無氧條件下,有機質被厭氧細菌和兼性菌生物降解的過程。研究表明厭氧消化能有效降低養豬場廢水中所有檢測到的ARGs[40]。溫度不同,去除效率也不一樣,其中總ARGs在25,37,55 ℃厭氧處理中顯著降低[41]。Wang 等[42]通過不同化學氧化過程和中溫厭氧消化處理,來研究廢活性污泥處理過程中ARGs豐度和細菌群落進化的控制。結果表明熱活化氧酮與中溫厭氧消化結合的工藝能使大部分ARGs的絕對豐度降低,總ARGs的絕對豐度也下降。沼液作為動物糞便厭氧消化處理的最終產物,在農業土壤中作為肥料被廣泛應用,但研究表明長期施用沼液可顯著提高土壤中四環素的濃度,并顯著增加土壤中ARGs和ARGs相關細菌的豐度[43],因此厭氧消化處理的農業廢棄物的可持續利用需要進一步研究。

3.3 生物炭添加

生物炭(biochar)是一種用于改善土壤的理化性質和微生物特性的土壤改良劑,具有強吸附、可固定土壤中的有機污染物和重金屬的能力。研究表明生物炭添加可以顯著降低非植被土壤中的ARGs,但對根際和葉際的ARGs沒有顯著影響[44]。He等[2]針對使用或不使用生物炭的情況,對土壤微觀結構進行了研究。結果表明,ARGs在生物炭添加的土壤中會緩慢消散。此外,生物炭改良有助于維持細菌多樣性[45]。生物炭也可以通過降低土壤的協同選擇壓力,控制土壤中ARGs的豐度[46]。

4 總結與展望

隨著抗生素的廣泛使用,環境中的ARGs的種類和豐度不斷增加,并在不同介質中進行廣泛傳播和擴散,對生態環境和人類健康帶來危害。土壤是ARGs的重要儲庫,但目前關于土壤環境中ARGs的分布特征、傳播擴散機制等還沒有厘清,對于ARGs消減技術的研究還存在許多不足,所以對于土壤環境中ARGs的研究仍有許多亟待解決的科學問題,該文對進一步深入研究的方向提出以下建議:

(1)不同土壤環境中的抗生素及ARGs的豐度和多樣性存在較大差異,需進一步研究不同類型土壤中抗生素及ARGs的分布,明確ARGs與土壤環境因子之間的關系;

(2)土壤環境復雜多變,需要增加對土壤環境中ARGs動態變化過程的關注,進一步探究ARGs的傳播機制,特別是對于水平基因轉移機制的研究,以及影響水平基因轉移機制的各種因素;

(3)復合污染物可能會加速ARGs的擴散與傳播,但目前關于復合污染物對ARGs水平基因轉移機制影響方面的研究較少,需利用宏基因組學等結合宏蛋白組學、宏轉錄組學等方法,對土壤環境中復合污染物的傳播機制進行深入探究;

(4)亟需加強優化或發展新型高效的ARGs 傳播阻斷和消減技術,探究土壤中ARGs的動態消減規律及作用機制,控制ARGs的產生和傳播。