65%氨氟樂靈水分散粒劑的高效液相色譜-質譜和氣相色譜-質譜分析方法

林威,常海龍,黃晨宇,李保同,王龍,周雯雯

(江西農業大學 國土資源與環境學院,江西 南昌 330045)

氨氟樂靈屬于二硝基苯胺類選擇性芽前土壤封閉除草劑,作用方式為抑制紡錘體的形成,從而抑制細胞分裂和根系、芽的生長[1-3]。主要通過雜草的胚芽和胚軸吸收,對已出土雜草及以根莖繁殖的雜草無效果,持效期長,適用于棉花、大豆、冬小麥和果園等作物一年生禾本科和部分闊葉雜草的防治[4-8]。目前,有關氨氟樂靈原藥和制劑有效成分的檢測有氣相色譜法和液相色譜法[9-10],此類方法雖定量較準確,但檢出限較高。本文在優化前人分析方法的基礎上,采用HPLC-MS和GC-MS對65%氨氟樂靈水分散粒劑中有效成分檢測進行了實驗,方法操作方便,檢出限低,結果可靠,可用于氨氟樂靈制劑中有效成分的分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、丙酮、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純;65%氨氟樂靈水分散粒劑;氨氟樂靈(≥97%)標準品LGC DR公司。

Agilent6120單四級桿液質聯用儀;Agilent1260高效液相色譜儀;安捷倫氣相色譜(7890B)-質譜(5977B)聯用儀;EX224ZH電子天平;TST-USB-20超純水機;0.22 μm有機濾膜。

1.2 儀器條件

1.2.1 HPLC-MS儀器條件

1.2.1.1 液相色譜條件 Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),甲醇∶0.2%乙酸水(體積比80∶20)為流動相,流速1 mL/min,柱溫箱35 ℃,進樣量10 μL。

1.2.1.2 質譜條件 采用ESI離子源負離子掃描SIM模式,SIM模式離子選擇349.1(m/z),碰撞誘導解離電壓100 V,干燥器溫度350 ℃,霧化器壓力0.31 MPa,干燥器(氮氣)流速12.0 L/min,駐留590 ms,相對駐留100%,增益1.00。

1.2.2 GC-MS儀器條件

1.2.2.1 氣相色譜條件 HP-5MS型毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);氦氣作載氣,載氣流速1.2 mL/min;進樣口溫度250 ℃。升溫程序:初溫170 ℃保持1 min,以25 ℃/min速度升溫至230 ℃, 再以10 ℃/min速度升溫至260 ℃,并保持3 min。采用分流進樣的方式,分流比為1∶1,進樣量1 μL。

1.2.2.2 質譜條件 定量離子為321,輔助定性離子為279,333,離子化能量70 eV,溶劑延時6 min,質譜接口溫度270 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫150 ℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標樣溶液配制 準確稱取兩份0.01 g氨氟樂靈標準品(精確至0.000 1 g),分別用甲醇和丙酮溶解,超聲20 min,冷卻至室溫。用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成100 mg/L甲醇、丙酮標樣儲備液。

1.3.2 試樣溶液配制 準確稱取兩份0.015 38 g 65%氨氟樂靈水分散粒劑(精確至0.000 1 g),分別用甲醇和丙酮溶解,超聲20 min,冷卻至室溫,用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成有效成分為100 mg/L 甲醇、丙酮試樣溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 HPLC-MS測定 將甲醇標準儲備液逐級稀釋至0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1 mg/L,用0.22 μm有機濾膜過濾,待HPLC-MS開機后儀器穩定進行測定。

1.4.2 GC-MS測定 將丙酮標準儲備液逐級稀釋至0.05,0.1,0.25,0.5,1,2 mg/L,用0.22 μm有機濾膜過濾,待GC-MS開機后儀器穩定進行測定。

試樣中氨氟樂靈的質量分數W1(%)按下式計算。

式中A1——氨氟樂靈試樣響應值;

A2——標樣響應值;

M1——氨氟樂靈試樣量,mg;

M2——標樣質量,mg;

W2——氨氟樂靈標樣的質量分數,%。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

氨氟樂靈在不同溶劑中的溶解度分別為:丙酮極易溶,乙腈、甲醇和氯仿易溶,正己烷、異戊烷、超純水微溶。氨氟樂靈標準品用甲醇、乙腈和丙酮作溶劑配制成濃度均為1 mg/L的樣品,在GC-MS上進行分析。結果表明,用甲醇作為溶劑時,響應值較小,且基峰較高;丙酮作為溶劑時,響應值高,且峰形好;乙腈作為溶劑時,樣品響應值與丙酮接近,但長期使用乙腈,易造成色譜柱固定相流失,降低色譜柱壽命。所以,GC-MS檢測采用丙酮作樣品溶劑。

HPLC-MS通常優先選用流動相作為樣品溶劑,經測試,用甲醇作為溶劑時,響應值較高,且無雜峰,故選用甲醇作流動相。

2.2 HPLC-MS條件選擇

2.2.1 色譜條件優化 選擇1 mg/L氨氟樂靈標準品溶液對條件進行優化,選用甲醇-水/0.2%乙酸水和乙腈-水/0.2%乙酸水兩種流動相對氨氟樂靈進行分離。結果表明,乙腈-水作為流動相時,峰面積較小,且有峰拖尾發生;將超純水更換為0.2%乙酸水后,峰拖尾情況有所改善,但峰面積依然較小。選用甲醇-水作為流動相時,峰面積較大,但峰型拖尾,而將超純水更換為0.2%乙酸水后,峰面積增大,且峰型對稱,所以確定選用甲醇-0.2%乙酸水作為流動相。

隨后對甲醇-0.2%乙酸水流動相比例進行調整,結果表明,體積比為80∶20時,峰型最佳,且保留時間較短。而后調整流速與柱溫,在流速1 mL/min、 柱溫35 ℃時峰型最好,且峰面積最大。經多次進樣,數據并無較大波動,由此確定色譜條件。

圖1 HPLC-MS氨氟樂靈標準品色譜圖Fig.1 HPLC-MS Standard chromatogram of prodiamine

2.2.2 質譜條件優化 在SCAN模式下,對1 mg/L氨氟樂靈標準品溶液進行ESI離子源(+/-)模式相對分子質量為200～500范圍內掃描,得出在負離子模式下可獲得強有效峰,且349.1,351.0為主要離子,隨后選擇SIM模式雙通道模式對349.1,351.0進行分析發現,在m/z為349.1時為最強有效峰。隨后在SIM模式下對質譜條件進一步優化,調整碰撞誘導解離電壓等參數,至樣品在儀器條件下響應值達到最大時確定最終質譜條件。

2.3 GC-MS條件選擇

2.3.1 離子選擇 對100 mg/L氨氟樂靈標準品溶液在相對分子質量為100～700范圍內進行全掃描,根據氨氟樂靈質譜圖(圖2)中豐度最大的離子,以及全掃描結果中豐度最大的離子確定設置定量離子為321,并另外選擇兩個豐度較大的離子作為輔助定性離子分別為279,333,隨后以上述離子進行選擇離子監測模式(SIM)對樣品進行測定。

圖2 氨氟樂靈標準質譜圖Fig.2 Standard mass spectrometry of prodiamine

圖3 GC-MS氨氟樂靈標準品色譜圖Fig.3 GC-MS Standard chromatogram of prodiamine

圖4 氨氟樂靈HPLC-MS標準曲線Fig.4 Standard curve of prodiamine in HPLC-MS

圖5 氨氟樂靈GC-MS標準曲線Fig.5 Standard curve of prodiamine in GC-MS

2.3.2 升溫程序的優化 進樣口溫度設置為250 ℃,可確保樣品完全氣化,且在進樣口端不會因樣品分解造成峰面積減小等問題。初始柱溫設置為170 ℃保持1 min,以25 ℃/min升溫至230 ℃,再以10 ℃/min 升溫至260 ℃保持3 min,期間氨氟樂靈可以與雜質完全分離,縮短了檢測時間并提高了檢測效率。

2.4 方法線性相關性與檢出限

2.4.1 HPLC-MS法標準工作曲線 甲醇標準工作液根據所述條件上機測定,采用外標法定量,橫坐標為質量濃度x(mg/L),縱坐標為響應值y,將數據擬合得到線性回歸方程:y=657 674x-967.1,R2=1.000 0。根據國家標準,在實際進樣時,儀器的信噪比(S/N)等于3時所檢測的樣品濃度,得出在該儀器條件下的最低檢出限(LOD)值為0.002 mg/L。

2.4.2 GC-MS法標準工作曲線 丙酮標準工作液根據所述條件上機檢測,用Agilent MassHunter進行分析,以溶液質量濃度(mg/L)為橫坐標x,響應值為縱坐標y繪制標準曲線,得出線性回歸方程為y=6 448.2x-26.037,R2=0.999 6,在儀器信噪比(S/N)為3時,在該儀器條件下的LOD值為0.005 mg/L。

2.5 方法精密度測定

取氨氟樂靈甲醇、丙酮試樣溶液各5份,分別在上述兩種儀器條件下進行檢測,結果見表1、表2。

表1 HPLC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 1 Precision determination of 65% prodiamine WG in HPLC-MS

表2 GC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 2 Precision determination of 65% prodiamine WG in GC-MS

HPLC-MS方法的標準偏差和變異系數分別是0.23%,0.36% (見表1),GC-MS方法的標準偏差和變異系數分別是0.32%,0.49%(見表2)。

2.6 準確度實驗

準確稱取10份已知含量65%氨氟樂靈水分散粒劑試樣,置于50 mL容量瓶中,各取5份分別加入一定量甲醇標準溶液和丙酮標準溶液,按上述兩種方法進行測定,結果見表3、表4。

表3 HPLC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑準確度測定Table 3 Accuracy of 65% prodiamine WG in HPLC-MS

表4 GC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 4 Accuracy of 65% prodiamine WG in GC-MS

由表可知,HPLC-MS法氨氟樂靈回收率為98.12%～101.35%,平均回收率為99.66%;GC-MS氨氟樂靈回收率為99.77%～101.91%,平均回收率為100.94%。

3 結論

采用HPLC-MS和GC-MS技術,建立了測定65%氨氟樂靈水分散劑有效成分含量的兩種分析方法。與目前已有的氣相色譜法和高效液相色譜法比較,檢出限更低,且準確度和精密度更高,線性相關性更好,同時具有操作方便、檢測時間較短等優點,可作為氨氟樂靈水分散粒劑中有效成分的分析方法。