青蒿琥酯體外抗弓形蟲作用的實驗研究

崔 潔,吳心悅,王小莉,楊小迪,夏 惠,沈繼龍,陳興智

剛地弓形蟲作為嚴格細胞內寄生的一類機會致病性原蟲,通過入侵溫血動物有核細胞的方式引發弓形蟲病[1-3]。家貓和野生貓科動物作為其唯一終宿主[4],全球陽性率大約為35%和59%[5]。既往血清學研究[6-8]顯示,全球人群的弓形蟲感染率高達30%。一般情況下弓形蟲的致病力取決于蟲株毒力、增殖能力及宿主種類,宿主在感染早期的固有免疫對感染后的結局亦至關重要[9]。作為TORCH綜合征的主要病因之一,弓形蟲感染對孕產婦及胎兒有著流產、致畸等重大生命威脅[10-13]。由于弓形蟲復雜的生物學特性,針對弓形蟲病的治療藥物顯得較為不足[14-15]?；前粪奏?、乙胺嘧啶等傳統藥物存在療程長、停藥后易復發以及產生耐藥性等諸多問題,經長期臨床應用藥物不良反應較大[16-18],因此研發低毒高效的抗弓形蟲藥物仍是弓形蟲病治療的重要任務。青蒿素作為我國自主研發的一線抗瘧藥物,有研究[19-21]顯示,該類藥物亦顯現出較強的抗弓形蟲作用。青蒿琥酯(Artesunate,Art)為雙氫青蒿素半琥珀酸酯衍生物,是青蒿素主要衍生物之一。陳炘等[22]報道,Art在弓形蟲腦病的治療過程中發揮了積極作用。還有研究[23]表明,阿奇霉素(Azithromycin,Azm)與Art配伍使用取得了很好的體內抗弓形蟲效果。但青蒿琥酯抗弓形蟲相關的體外研究較少,且觀察手段較為傳統,主觀性較大。本實驗采用流式細胞術對藥物作用后的轉基因弓形蟲進行檢測分析,旨在為Art作為弓形蟲病治療藥物提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株 RH-GFP株系中國農業大學動物醫學院索勛教授惠贈,本室液氮保種。

1.1.2 動物 BALB/c小鼠(雌性,6～8周,SPF級)和昆明小鼠(雌性,6～8周,SPF級)購于安徽醫科大學實驗動物中心,動物倫理批準文號:AMU26-08061。

1.1.3 藥物和主要試劑 Art為桂林南藥股份有限公司產品,Azm為東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司產品,吉姆薩染液為美國Sigma公司產品,RPMI-1640培養液、小牛血清和PBS均購自上海生工公司。

1.2 主要儀器設備 熒光顯微鏡(CX31)為日本OLMPUS公司產品。流式細胞儀(FACSVerse)為美國BD公司產品。CO2培養箱(SERIES 8000 DH)為Thermo Scientific Napco公司產品。

1.3 方法

1.3.1 RH-GFP速殖子的制備 蟲株經復蘇、連續傳代3～4次后,取發病晚期小鼠乙醚麻醉處死,75%乙醇浸泡后瀝干,充分暴露腹膜,用5 mL預冷的RPMI-1640沖洗小鼠腹腔并重復此操作2次收集腹腔灌洗液約10 mL,800 r/min離心3 min取上清液,再以3 000 r/min離心10 min,此時棄上清液重懸,分離純化速殖子后取10 μL懸液光鏡下計數,調整蟲體密度備用。

1.3.2 流式檢測平臺的建立 為便捷有效地觀察藥物對RH-GFP感染宿主巨噬細胞(Macrophage,Mφ)的影響,我們將新鮮收集的RH-GFP速殖子以(1～2)×106的量經腹腔感染BALB/c小鼠,感染后72 h將小鼠乙醚麻醉處死,沖洗小鼠腹腔,以RPMI-1640完全培養基重懸細胞并接種于24孔細胞培養板,調整其密度為1×106/孔。

1.3.3 實驗分組 我們設置了對照組(0.9%氯化鈉溶液陰性對照);Art組,使其終濃度分別為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL;Azm組(陽性對照),終濃度分別為12.5、25、 50、100、 200、400、800和1 600 μg/mL;Art+Azm組,終濃度分別為:Art1.562 5+Azm12.5、Art3.125+Azm25、Art6.25+Azm50、Art12.5+Azm100、Art25+Azm200和Art50+Azm400 μg/mL。各組每濃度于細胞培養板中設5復孔,每孔定容1 mL。

1.3.4 流式細胞儀檢測 將24孔板置37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育24 h,各孔常規制樣以流式細胞儀檢測感染體系中游離速殖子、感染Mφ以及未感染Mφ各組分比例變化,檢測結果用FlowJoV10軟件分析。

1.3.5 吉姆薩染色 按照前述方法加藥孵育24 h后各孔輕柔混勻取樣以1 500 r/min離心10 min,棄上清液取6 μL置無菌EP管,加入6 μL小牛血清輕柔混勻并簡短離心,此時取3 μL涂片以吉姆薩染液A液與B液以1∶9比例充分混勻后滴加染色,10 min后以細水流沖洗(勿直接沖洗涂膜),晾干后油鏡觀察并拍照。

1.4 統計學方法 采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 RH-GFP感染Mφ流式檢測平臺成立 根據前期檢測結果,將提純后的(1～2)×106個RH-GFP速殖子經腹腔感染小鼠的第2～3天,腹水中Mφ與游離蟲體數目的比例約為1∶1,小鼠腹腔Mφ的感染率接近50%,感染第4天,腹腔Mφ的整體數量急劇下降,游離蟲體數目迅速上升(見圖1)。為更加便捷,在反復預實驗后確立選取感染后2～3 d的小鼠腹腔抽提物進行流式檢測(見圖2)。

2.2 流式檢測結果 與對照組相比,Art組速殖子自3.125 μg/mL起呈梯度減少(P<0.01),50 μg/mL時,游離蟲體比例已經低于0.3%(P<0.01),Mφ感染率自1.562 5 μg/mL逐漸下降,在6.25 μg/mL已明顯低于對照組(P<0.01),至50 μg/mL時低于1.6%(見圖3、表1)。Azm組隨藥物濃度遞增,速殖子比例下降明顯(P<0.01),在400 μg/mL時蟲體比例低于0.6%,Mφ感染率低于3.5%(見圖4、表2)。Art+Azm組速殖子隨藥物濃度升高明顯減少(P<0.01),在Art12.5 +Azm100 μg/mL組,游離蟲體的比例低于0.04%,此時Mφ感染率低于1.8%(見圖5與表3)。

表1 梯度濃度Art作用24 h后感染體系各組分比例變化

表2 梯度濃度Azm作用24 h后感染體系各組分比例變化

表3 梯度濃度Art+Azm作用24 h后感染體系各組分比例變化

2.3 吉姆薩染色觀察藥物對蟲體結構的損傷 對照組速殖子呈新月形或香蕉狀,形態沒有非常明顯的變化,經吉姆薩染色后胞質呈淺藍色而胞核為紫紅色。其余各組中蟲體形態、結構隨藥物濃度上升而逐漸崩塌。低濃度組中蟲體首先呈現外形腫脹,內部出現空泡;隨藥物濃度增加,蟲體變形明顯,弓狀弧消失,體內空泡增多增大呈泡沫狀,部分胞膜、核膜斷裂,內容物溢出;至高濃度組,蟲體破碎,胞核固縮深染,胞質溶解,視野中無完整蟲體存在(見圖6)。

3 討論

伴隨寵物飼養的普遍性、畜牧業的發展以及飲食方式的多樣化,人獸共患的弓形蟲病仍是世界性的公共衛生問題。傳統用藥方案療程長、根治率低、不良反應大[17-18],抗弓形蟲藥物的篩選任重道遠。Art由我國自主研制,為青蒿素衍生物,其藥理作用廣泛,藥物活性顯著,不僅是臨床一線抗瘧藥物,在病毒、腫瘤及其他寄生蟲領域也有較強作用。有研究[22,24-25]提示,Art對弓形蟲病有積極治療作用。

本實驗利用蟲株胞質穩定表達綠色熒光蛋白的轉基因弓形蟲(RH-GFP),以流式細胞儀檢測分析,相比以往臺盼藍染色后以肉眼計數蟲體存活率更為準確、客觀。利用此方法分析藥物的的抗弓形蟲作用較為創新,且該蟲株在運動能力、胞內增殖速度和致病性上與野生蟲株無顯著差異[26]。Mφ是弓形蟲感染早期宿主固有免疫屏障中的重要成員之一,與感染結局息息相關,因此觀察藥物對Mφ感染弓形蟲后的影響極具潛在臨床應用價值。有研究[23,27]顯示,當Azm和Art配伍時亦獲得了更好的抗蟲效果。所以我們選擇Azm作為陽性對照的同時又設置了Art+Azm組進行了聯合用藥的嘗試。本實驗中藥物作用劑量參照以往文獻報道(劑量大小較為參差寬泛)以及前期預實驗結果自行設計,以10∶1→5∶1→2∶1倍比稀釋梯度摸索,確立有效范圍后以2∶1倍比稀釋設立。為減小誤差,每組每濃度設5個復孔,統計時舍去最高值和最低值,取其余三孔平均值,同時在每濃度梯度上進行了3次以上的流式檢測,取3次檢測結果代表。結果顯示,50 μg/mL濃度Art 24 h后可達99%以上的攻蟲效果,殺滅速殖子、降低Mφ感染率,而Azm在400 μg/mL時方接近此效果。聯合組展現出一定優勢,Art 12.5+Azm 100 μg/mL組統計結果與Art 50 μg/mL組或Azm 400 μg/mL組結果接近,同等效果下藥物濃度梯度有所降低。吉姆薩染色顯示,隨著藥物濃度的梯度上升,蟲體由輕度腫脹到破裂,內部結構從輪廓模糊到深染固縮,該結果從形態學角度驗證了藥物的殺蟲效果。

本實驗結果表明,Art在體外具有較強的抗弓形蟲作用,Art 與Azm聯合用藥亦有較佳效果,這為其作為弓形蟲病治療藥物提供了實驗依據。Art殺傷速殖子的機制以及對組織內包囊的效果有待進一步研究。