牛源TAK1基因慢病毒載體構建及其在MDBK細胞中的表達

張 帆,姜坤生,王禹淳,馬金柱,于立權,宋佰芬,2*

(1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院,中國大慶 163319;2.中國農業大學動物醫學院,中國北京 100093)

轉化生長因子-β激活蛋白1(transforming growth factor-beta activator protein 1,TAK1)是一種絲氨酸/酪氨酸激酶,最初被鑒定為絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶(MAPKKK)家族的成員,因是最早發現的轉化生長因子-β或骨形態發生蛋白4(BMP-4)反應中的信號轉導介質[1]而得名。有研究表明,TAK1在腫瘤壞死因子受體(TNFR)、白介素1受體I(IL-1RI)和Toll樣受體(TLRs)介導的核因子κB (NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活化中起著至關重要的作用[2]。此外,TAK1通過介導T細胞和B細胞受體信號在獲得性免疫中發揮關鍵作用[3-4]。在所有這些途徑中,TAK1被認為是NF-κB和MAPKs的關鍵調節因子,它在將上游信號從所指示的受體復合體傳遞到下游信號小體中起著至關重要的作用[5]。另一方面,TAK1被各種應激激活,包括DNA損傷和滲透沖擊,表明TAK1參與應激反應信號傳導[6-7]。因此,TAK1不僅參與免疫和炎癥反應的發生,還可以通過調控細胞內多種信號轉導從而發揮多種生物學作用[8]。越來越多的證據已經指出了TAK1作為一種多功能激酶的重要性,它可以應對各種刺激。

實驗室前期通過轉錄組測序篩選出一個表達量差異顯著且新組裝的lncRNA-MSTRG.16919.1,為進一步研究lncRNA-MSTRG.16919.1的功能,將其沉默后再行轉錄組測序,結果顯示該lncRNA可能與TAK1介導的信號通路有關,為了進一步確認該結果需要將TAK1基因進行過表達。因此,基于以上研究背景構建TAK1基因過表達慢病毒載體,篩選TAK1基因過表達穩轉細胞株,為深入研究TAK1在lncRNA-MSTRG.16919.1參與的作用中以及BHV-1感染中機制的研究提供有效的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和載體 pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro質粒購自上海漢恒生物科技有限公司,感受態EscherichiacoliDH5α、293T細胞系、MDBK細胞系均由黑龍江八一農墾大學細胞生物學實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 EndoFree Plasmid Mini Kit,Omega公司產品;15 kb DNA Ladder、MiniBEST Agarose Gel Extraction kit Ver.4,Takara公司產品;限制性內切酶BamHI-HF、EcoRI-HF,NEB公司產品;DMEM培養基,美國Gibco公司產品;聚凝胺,中國百?？萍脊井a品;嘌呤霉素,美國MCE公司產品;羊抗兔IgG-HRP抗體、Beta Actin Antibody,中國博奧森公司產品;ECL顯色液,德國默克公司產品;預染蛋白質Marker、BCA定量試劑盒,中國Biosharp公司產品;RIPA裂解液,中國索萊寶公司產品;TAK1抗體,中國親科生物公司產品。

1.1.3 主要儀器 電恒溫水浴鍋,上海博訊公司產品;Nanodrop 2000、高速離心機、低溫恒溫器和熒光顯微鏡,美國Thermo公司產品;PCR擴增儀、蛋白凝膠電泳儀、濕轉轉膜儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、ChemiDoc XRS+紫外凝膠成像系統,美國Bio-Rad公司產品;細菌搖床,華利達實驗設備公司產品;倒置顯微鏡,廣州明美光電技術公司產品。

1.2 方法

1.2.1 pCDH-CMV-TAK1-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體構建 根據GenBank中牛源TAK1基因的全長序列(登錄號:NM-001081595.1),設計并合成引物,序列如下:TAK1-F:GAATTCATGTCTACAGCCTCCGC;TAK1-R:GGATCCTGAAGTGCCTTGTCG。其中EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點分別添加在正向與反向引物的兩端。

以牛全基因組為模板擴增TAK1基因,對擴增產物進行回收。在37℃水浴中用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種酶分別對質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro和PCR回收產物進行雙酶切,將得到的大分子量基因片段與TAK1酶切產物通過DNA ligase進行重組連接。根據文獻制備化學感受態細胞[9],并進行熱激轉化獲取陽性表達載體,提取質粒進行酶切及測序驗證。

1.2.2 慢病毒包裝 轉染24 h前,取生長狀態良好的293 T細胞于15 mL培養皿進行傳代培養,待細胞密度達到70%～80%時進行轉染試驗。在試驗前1～2 h需更換新鮮培養液,以減少對后續試驗的影響。使用無菌的1.5 mL EP管進行試驗,轉染體系如下:A管成分穿梭質粒15 μg,包裝質粒復合物15 μg,P3000 30 μg,Opti-MEM 750 μg; B管成分Lipo3000 45 μg,Opti-MEM 750 μg。將A、B兩管試劑充分混合后轉移至提前準備好的細胞中,放置于培養箱中培養。

培養6 h后,換液繼續培養。48 h后,收集細胞上清液,以4℃、1 600 r/min離心5 min,并通過0.45 μm濾膜過濾上清液,最后再96 000 r/min離心90 min,丟棄上上清液,收集沉淀即為病毒濃縮液。將其分裝保存于-80℃中。

1.2.3 慢病毒滴度測定 將HEK293T細胞在合適的條件下培養至對數生長期,培養結束后對培養皿中的細胞進行計數,并將其轉移到96孔板中,每孔8 000個細胞,在37℃條件下培養12 h左右,當細胞密度達到30%～50%時符合轉染試驗要求。在轉染試驗開始前,將保存在-80℃的病毒液在冰盒上緩慢融化,以減少病毒的損失。將狀態良好的細胞接種在96孔板中,對制備的慢病毒進行滴度測試。將不同梯度病毒稀釋液加至孔板中,過夜培養;培養到第3天,棄去細胞孔板中的細胞培養液,換成100 μL新鮮培養液繼續培養;培養至第5、第6天時,借助熒光顯微鏡觀察96孔板中各病毒梯度處理的細胞熒光含量情況,通過統計表現熒光的細胞數量除以病毒稀釋倍數計算病毒滴度。

1.2.4 TAK1最佳轉染濃度篩選與過表達穩轉細胞株的構建 對MDBK細胞進行傳代培養,為后續試驗準備。過表達試驗分為慢病毒TAK1組、空病毒NC組、MDBK只加轉染試劑組、MDBK不做任何處理組。

感染復數(multiplicity of infection,MOI)是細胞在感染時病毒與細胞數量的比值,通常MOI越高,整合到染色體上的病毒數量越多。MOI過低則達不到過表達效果,而MOI過高則會影響細胞狀態,因此探索合適的MOI對后續試驗是十分重要的。將MDBK細胞接種在96孔板中,過夜培養。當細胞融合率達到50%左右時,換液加入1/2體積預混合適濃度的Polybrene培養基。根據公式MOI值=病毒滴度×病毒體積(mL)/細胞個數,算出應該加多少慢病毒。慢病毒和空載體對照病毒NC按照MOI為0、60、120、180、240、300分別進行添加,慢病毒滴度為1×108TU/mL,加入慢病毒的體積分別為0、24、48、72、96、120 μL;空病毒滴度為5×108TU/mL,加入空病毒的體積分別為0、4.8、9.6、14.4、19.2、24 μL,混合均勻,試驗重復3次,并且在37℃體積分數為5% CO2細胞培養箱中培養,4 h后添加余下培養基繼續培養,從加入病毒的時間開始計算,24 h后換為含有1/2體積(50 μL)含有5 mg/L聚酰胺的培養基。感染病毒72 h后,借助熒光顯微鏡對細胞熒光表達效果進行評判,達到80%比例的樣品對應的MOI為最佳MOI值。

將MDBK細胞按照1×106個/孔接種至6孔板,待匯合率達到30%～50%時,更換1/2體積含有5 μg/mL聚酰胺的完全培養基,按照MOI為180加入病毒進行培養,4 h后加入另一半培養基,24 h后對培養的細胞進行換液。感染72 h后,通過熒光顯微鏡統計熒光表達率,衡量目的基因的表達情況。確定熒光表達后,向穩定表達目的基因的試驗組和未作任何處理的對照組細胞株中添加3 μg/mL的嘌呤霉素,觀察到對照組細胞裂解完畢后,用含有3 μg/mL嘌呤霉素的培養基對試驗組細胞進行篩選。培養1～2周后,細胞幾乎無死亡現象,且在熒光顯微鏡下可觀察到試驗組與對照組均有紅色熒光表達,對其進行擴大培養并保藏。隨后對保存的細胞進行再次復蘇進行培養,傳至3～5代后,對細胞進行熒光觀察。重復上述試驗3～5次,依舊在顯微鏡下可觀察到明顯的熒光表達,且細胞生長狀態良好,無明顯的形態學變化,則表明TAK1過表達穩轉細胞株制備成功。

1.2.5 Western blot檢測TAK1蛋白表達情況 對細胞進行處理,制備蛋白樣品。通過高效RIPA細胞裂解液對樣品進行裂解,樣品在冰上裂解30 min,每5 min輕輕敲打一次,將處理的樣品收集到無菌離心管中。經離心后,對樣品分裝保存,同時進行蛋白濃度測定。根據文獻[10]使用標簽蛋白MYC抗體及TAK1蛋白抗體分別對TAK1表達量進行Western blot檢測,通過AI600成像系統拍攝圖像,并用Image J圖像分析軟件對蛋白進行定量分析。

2 結果

2.1 pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體表達的構建

將連接產物進行轉化后,挑取單克隆在37℃以220 r/min的條件下培養14 h后,提取質粒,用BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定(圖1),構建的重組質粒雙酶切結果有兩個條帶,一條為1 790 bp,另一條為8 101 bp,與預計片段大小一致。然后將雙酶切驗證正確的質粒進行測序(圖2),測序結果與參考序列一致,證明重組過表達載體pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro構建成功。

圖2 目的基因測序結果

2.2 慢病毒制備及病毒滴度測定

將pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A- Puro質粒轉染293T細胞,24 h后收集樣品,收獲含有TAK1基因的慢病毒。通過逐孔稀釋法對所獲得的病毒進行滴度檢測。根據公式:病毒滴度=熒光細胞數目/相應稀釋倍數,計算得到TAK1過表達陽性病毒滴度為1.0×108TU/mL,陰性對照病毒的滴度5.0×108TU/mL。

2.3 TAK1過表達最佳轉染濃度確定及MDBK穩轉細胞株制備

TAK1過表達慢病毒和陰性對照慢病毒分別以MOI量為60、120、180、240和300的劑量轉染MDBK細胞,72 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光的強度,結果顯示(圖3),MOI劑量為180時有較強的紅色熒光表達,轉染效率可達80%以上,而當MOI為240時,熒光強度變弱,可能是由于病毒量過大對細胞產生一定影響。因此,選擇MOI為180的劑量作為轉染劑量,進而篩選穩定過表達TAK1的細胞株。用慢病毒感染狀態良好的MDBK細胞,病毒感染72 h后,加嘌呤霉素進行篩選,以空白對照組所有細胞死亡為準。經嘌呤霉素篩選且反復凍存復蘇3～5次后,細胞生長良好,無明顯形態學改變,能穩定持續表達紅色熒光的細胞則為TAK1穩轉細胞株(圖4)。

圖3 不同MOI病毒轉染MDBK細胞后熒光圖片(100×)

圖4 TAK1穩轉細胞株熒光圖片(100×)

2.4 TAK1蛋白表達檢測

用Western blot方法對3組細胞樣本進行TAK1蛋白水平檢測(圖5),MYC標簽抗體檢測TAK1蛋白(a)顯示過表達組在70 ku有一目的條帶,而陰性對照組與空白對照組中未檢測到該蛋白的表達。TAK1多克隆抗體檢測結果(b)顯示陰性對照組與空白組TAK1蛋白表達水平基本一致,而過表達組中TAK1蛋白表達量顯著上調,由此表明TAK1過表達穩轉株構建成功,且表達的蛋白能與購買的多克隆抗體結合,說明該蛋白具有良好的活性。

TAK1-MYC為TAK1基因過表達組,TAK1-NC為過表達陰性對照組;Blank為未作任何處理的MDBK細胞組;(a).MYC標簽抗體檢測結果;(b).TAK1多克隆抗體檢測結果;(c).圖(b)的定量分析圖

3 討論

TAK1是一種高度保守的MAPK激酶,受到多種水平的修飾[11]。多種病毒都可以激活TAK1。如HIV1的VPR蛋白和糖蛋白gp41與TAK1結合并誘導TAK1磷酸化和激活[12]。在艾滋病患者體內,人類免疫缺陷病毒1型激活TAK1是NF-κB和有效復制病毒所必需的[13]。TAK1是EB病毒蛋白潛伏膜蛋白1(LMP1)誘導的JNK1激活所必需的,但對于NF-κB的激活是必不可少的[14]。人參皂苷Rg3通過降解TRAF6和TAK1以及通過阻斷HepG2細胞中JNK的激活來抑制乙型肝炎病毒復制[15]。其他研究表明,TAK1在單純皰疹病毒、仙臺病毒和RSV37-39激活NF-κB、p38和JNK過程中是必不可少的[16]。

另一方面,TAK1可以介導促炎癥細胞因子的多種細胞內作用,如腫瘤壞死因子-α和白介素1-β(IL-1β)[17]。TAK1在上游信號從受體復合體到下游信號分子的通訊中是必不可少的[18]。如IL-1β與其受體IL-1R的結合導致與接頭蛋白MyD88的相互作用[19]。MyD88招募IRAK家族成員,進而激活泛素E3連接酶TRAF6。泛素化的TRAF6與TAB和TAK1結合形成復合體,導致TAK1的激活。一旦激活,TAK1啟動了一系列信號轉導,包括IKK復合體的激活,IκB的磷酸化和泛素化,以及NF-κB到核的移位[20]。

LncRNA-MSTRG.16919.1是在BHV-1感染MDBK細胞中經轉錄組測序篩選出的新組裝的lncRNA,關于它的功能還知之甚少,并且在lncRNA-MSTRG.16919.1功能發揮的過程中TAK1是否參與其中也未見報道。為了探究TAK1在這一過程中發揮的作用,通過過表達TAK1基因的方式進行探究。本文采用的pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體為慢病毒載體,其優點是轉染效率較高,對細胞損傷較小,更有利于下游的試驗,在載體上選擇了帶有turboRFP紅色熒光標簽和嘌呤霉素抗性雙重標記的載體,通過紅色熒光的表達情況,在熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光表達情況判斷轉染是否成功,然后又通過嘌呤霉素抗性進一步篩選表達有TAK1蛋白的穩定轉染細胞株,達到最終的試驗目的。在驗證TAK1是否表達方面,采用MYC標簽抗體和TAK1抗體雙重驗證TAK1蛋白的表達,結果均顯示TAK1蛋白被成功表達。

綜上所述,TAK1慢病毒載體的構建成功,篩選出TAK1穩轉細胞系,并且TAK1蛋白成功表達,為后續研究lncRNA-MSTRG.16919.1在BHV-1感染MDBK過程中的機制提供基礎,并且為進一步探究lncRNA、病毒及宿主之間的關系奠定基礎。