魚類鐵調素生物學功能與體外表達的研究進展

顏 研,李旭東,裴 超,孔祥會

( 1.河南師范大學 水產學院,河南 新鄉 453007; 2.河南省水產技術推廣站,河南 鄭州 450008 )

近年來,細菌性疾病頻發,抗生素不規范使用導致細菌耐藥性問題日益嚴重[1]。研發新的抗菌藥物,替代抗生素是解決細菌耐藥性問題的一個方向?？咕氖蔷哂锌咕饔玫男》肿佣嚯?相比于抗生素,不易產生耐藥性,可作為抗生素耐藥細菌治療的潛在藥物[2-3]。其中魚類鐵調素(Hepcidin)具有廣譜的抗菌活性,抗菌效果明顯,已成為當前抗菌肽研究的熱點。筆者對魚類鐵調素的分子結構、鐵調控作用、抗菌、抗病毒和抗腫瘤功能,以及其在原核、真核及植物表達系統中體外表達的研究進行了綜述,并對鐵調素在食品、醫藥及水產領域中的應用現狀及前景進行了總結與展望,以期為魚類鐵調素抗菌機制及在漁業上的應用提供參考和指導。

2002年,Shike等[4]第一次從雜交條紋鱸(Moronechrysops×M.saxatilis)鰓中分離出鐵調素,它與人類和其他物種的鐵調素序列同源,并研究發現細菌感染可誘導Hepcidin基因的表達。隨后,國內外學者從團頭魴(Megalobramaamblycephala)[5]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[9]、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[10]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[12]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[13]和太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)[14]等多種魚類中分離和鑒定了Hepcidin基因,并進行了分子結構和功能的一系列研究。

1 魚類鐵調素的分子結構

魚類鐵調素屬于肝臟表達抗菌肽LEAP家族,又稱LEAP-1。Shike等[8]研究了鐵調素在幾種不同物種中的序列和分子結構,發現鐵調素的基因組結構在硬骨魚中高度保守,由2個內含子和3個外顯子組成。外顯子編碼氨基酸序列分為3部分,包括信號肽、前體肽和成熟肽。第1個外顯子編碼信號肽和前體肽的一小部分,其他2個外顯子編碼剩余的前體肽和成熟肽。信號肽含有24個氨基酸,具有抗菌功能[15]。鐵調素前體肽含有典型的RX(K/R)R序列,用于招募前肽轉化酶形成由19～31個氨基酸組成的成熟肽,該成熟肽中第1個Cys殘基之前的N-末端6個殘基QSHLSL,對于鐵調節活性至關重要[16]。成熟肽含有較多的堿性氨基酸,使得鐵調素帶正電荷,屬于陽離子抗菌肽。從魚類到哺乳動物的鐵調素成熟肽序列進行比較分析,顯示成熟肽中8個半胱氨酸殘基具有高度保守性,這些半胱氨酸殘基通常形成4個分子內二硫鍵,其中1個相鄰的二硫鍵橋形成發卡結構,有助于鐵調素折疊成親水和疏水側鏈,是鐵調素發揮抗菌活性的關鍵結構[17]。在Hepcidin基因的上游區域,普遍具有TATA框結構及珠蛋白轉錄因子(GATA)、信號轉導及轉錄激活因子(STAT)、CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)、CCAAT增強子結合蛋白β(C/EBPβ)、激活蛋白(AP)、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)和肝細胞核因子4(HNF4)等轉錄因子的結合位點,說明鐵調素可能受這些轉錄因子的調節表達[9]。

大多數魚類有2個或2個以上的同源Hepcidin基因,如斑馬魚、大菱鲆、黑點青鳉(Oryziasmelastigma)、點帶石斑魚、舌齒鱸和大彈涂魚等均有2個基因變體,在尼羅羅非魚中發現了3種類鐵調素的抗菌肽,在大黃魚基因組中發現了6種Hepcidin基因[6-11,13,18]。不同的基因亞型,在表達和功能上具有差異,如舌齒鱸1型Hepcidin基因主要發揮鐵調節的作用,2型Hepcidins基因參與宿主的抗菌防御[9]。大彈涂魚鐵調素-2與鐵調素-1相比具有更強的抗菌活性和更廣的抗菌譜[19]。大黃魚中6種鐵調素亞型,雖然具有相似的分子特征,但每個亞型均具有獨特的表達模式、轉錄調控和生物學功能[13]。

2 魚類鐵調素的表達調控

在病毒、細菌及其類似物刺激下,魚體Hepcidin基因表達可快速上調,表明魚類鐵調素是一種急性期蛋白,參與類似于哺乳動物中的炎癥反應[20-24]。魚類Hepcidin基因的表達受到許多刺激的單獨調節,感染/炎癥、鐵水平、貧血和缺氧等刺激均能引起Hepcidin基因表達變化[9, 25]。不同刺激誘導魚類產生鐵調素的細胞通路不同,如在炎癥反應中,Hepcidin基因的表達通常是通過酪氨酸激酶/信號轉導和轉錄激活因子途徑介導的[26]。鐵可通過參與骨形態發生蛋白/果蠅MAD相關蛋白通路對Hepcidin基因的表達進行調控[27]。貧血和缺氧分別通過抑制C/EBPα和STAT3與Hepcidin基因啟動子結合,或抑制BMP/SMAD4依賴性信號傳導,從而負調控Hepcidin基因的表達[28-29]。

環境污染物和高溫的刺激也能夠調節Hepcidin基因的表達。黑點青鳉在17α-乙炔基雌二醇(EE2)刺激后,17α-乙炔基雌二醇首先與雌激素受體α(ERα)結合,雌激素受體α識別并與Hepcidin基因啟動子區域上新發現的調控元件雌激素反應元件結合,從而下調Hepcidin基因的表達[30]。大菱鲆皮膚中的Hepcidin基因表達水平較高,并且隨著溫度的升高而升高,在28 ℃時Hepcidin基因的表達量顯著增加[31]。

這些研究結果表明,魚類鐵調素對多種病原和環境脅迫都有響應,這些刺激通過不同的分子途徑來調節Hepcidin基因的表達,因此,鐵調素在魚類先天免疫反應中起著關鍵作用。

3 魚類鐵調素的生物學功能

3.1 魚類鐵調素抗菌功能

魚類鐵調素是一種鐵穩態的調節劑,可以通過細胞鐵轉運蛋白的內化和降解,阻止肝細胞系中鐵釋放,并抑制細胞外細菌對鐵的攝取與利用,從而抑制細菌的生長和繁殖[32]。網箱養殖中,飼糧中添加不同劑量的草魚(Ctenopharyngoaonidellus)重組鐵調素,能夠控制體內鐵的分布,從而防止細菌感染,具有保護作用[33]。

魚類鐵調素除了通過調節鐵代謝以抑制細菌生長外,還具有直接殺傷細菌的作用。在體外,魚類鐵調素能破壞病原菌的細胞膜結構,顯示其廣泛的殺菌活性[15,17,34]。鐵調素可通過非膜裂解機制進入到胞內干擾細菌的正常代謝[35]。舌齒鱸鐵調素通過與某些細胞內靶點結合或與細菌膜結合而對鰻鱺弧菌的復制產生影響[36]。魚類鐵調素還能通過其N-末端的Cu2+和Ni2+結合性(ATCUN)基序,以促進細菌DNA水解[37]。研究顯示,魚類鐵調素在體內具有抗菌活性。體內注射合成的大菱鲆鐵調素,可以大大降低受感染魚腎臟、脾臟和肝臟中的細菌數量[11]。

魚類鐵調素可以作為免疫調節劑,誘導細胞因子和趨化因子產生,從而調節和平衡病原引起的炎癥反應。在創傷弧菌(Vibriovulnificus)感染斑馬魚后,轉入魚體的Hepcidin基因表達可誘導白介素10(IL-10)、白介素26(IL-26)、溶菌酶、Toll樣受體4(TLR-4)和髓樣分化因子88(Myd88)基因的表達,從而有效抑制細菌生長[38]。腹腔注射100 μg合成的中華烏塘鱧(Bostrychussinensis)鐵調素成熟肽,不僅可以提高中華烏塘鱧肝臟中免疫相關基因的表達,還能提高中華烏塘鱧感染副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)的存活率[39]。

以上研究表明,鐵調素功能主要有:(1)在免疫反應期間通過調節鐵代謝,阻隔鐵對細菌的供應,以限制病原菌生長;(2)利用其抗菌活性將病原體直接殺死;(3)利用與宿主免疫系統相互作用來調節宿主免疫。這三者共同作用,最終限制感染性病原菌的增殖和傳播(圖1)。

3.2 魚類鐵調素在鐵代謝中的功能

魚類鐵調素在機體鐵穩態調節、感染后降低宿主血鐵含量、抵御入侵病原等方面發揮關鍵性作用。與哺乳動物類似,魚類鐵調素通過抑制膜鐵轉運蛋白1(FPN1)調節體內鐵離子的動態平衡。在試驗性鐵超載情況下,斑馬魚肝臟中Hepcidin基因的表達顯著增加[40]。Hepcidin mRNA水平增高后,可以使血清鐵含量降低。大菱鲆肝臟中Hepcidin基因表達水平增加,可以降低FPN1基因的表達水平,表明鐵調素在鐵代謝中具有重要作用[41]。鱖(Sinipercachuatsi)注射硫酸亞鐵后,肝臟中Hepcidin基因的表達顯著增加,同時白介素1β(IL-1β)、白介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和Toll樣受體22(TLR22)基因的表達增加,FPN1基因表達減少,表明鐵調素除了參與鐵平衡的調節,還在免疫系統中具有重要作用[42]。魚類鐵調素通過調節鐵代謝,導致鐵重新分布,降低血清鐵水平,增加肝胰腺中的鐵積累,并調節免疫基因的表達,從而保護魚體免受病原菌的感染[33]。

3.3 魚類鐵調素抗病毒功能

魚體感染傳染性脾腎壞死病毒、神經壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒后,宿主通過上調體內Hepcidin基因的表達,以抑制病毒感染[42-44]。尼羅羅非魚鐵調素1-5對神經壞死病毒和日本腦炎病毒具有抗病毒活性,還能夠提高感染傳染性胰腺壞死病毒的大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細胞的存活率[45-47]。魚類鐵調素對鱖魚彈狀病毒、大口黑鱸呼腸孤病毒和腫大細胞病毒也具有抗病毒活性[11,48]。鐵調素還可顯著抑制新加坡石斑魚虹彩病毒和白斑綜合征病毒的復制[10,13,18]。最近研究發現,包括冠狀病毒在內的病毒,需要含鐵酶參與才能完成其復制過程,通過操縱鐵調節的關鍵因子鐵調素,以限制鐵的利用,已成為治療病毒感染的一種輔助策略[49]。魚類鐵調素可作為病毒感染治療的一種新型藥物,這將拓展現有的抗病毒藥物。魚類鐵調素的抗病毒活性及其作用機制見表1。

表1 魚類鐵調素抗病毒活性及作用機制

3.4 魚類鐵調素抗腫瘤功能

魚類鐵調素的抗腫瘤活性已有較多報道。在軟瓊脂試驗中,尼羅羅非魚鐵調素有效抑制了人纖維肉瘤細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的生長并減少了集落生成[50]。黑點青鳉鐵調素對培養的人肝癌細胞也同樣具有抗腫瘤活性,大約有40%的腫瘤細胞受到了明顯抑制[18]。這些研究表明,魚類鐵調素對人類腫瘤細胞表現出較好的抑制活性,這為開發新型抗癌抗腫瘤藥物指明了新途徑。

3.5 魚類鐵調素抗寄生蟲功能

卡氏錐蟲(Trypanosomacarassii)、卵圓鞭毛蟲(Amyloodiniumocellatum)、魚虱(Argulussiamensis)和刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)通常黏附在魚體表面,引起持續的炎癥反應,誘導Hepcidin基因表達顯著上調[22,51-53]。研究發現,重組大黃魚鐵調素可導致刺激隱核蟲膜破裂和內容物泄漏[34]。以上研究表明,魚類鐵調素在抗寄生蟲感染時發揮了重要作用。

4 魚類Hepcidin基因的體外表達

4.1 原核表達系統

大腸桿菌(Escherichiacoli)原核表達系統可利用多種表達載體表達魚類Hepcidin基因,如利用pGEX-KG載體,在16 ℃下,用1 mmol/L IPTG誘導,可表達黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)Hepcidin基因,并通過谷胱甘肽轉移酶融合系統進行純化,可獲得較高純度的鐵調素,并證實鐵調素可以通過鐵調節有效地抵抗細菌感染[54]。利用pET系列載體,可原核表達黑點青鳉、南亞野鯪(Labeorohita)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大黃魚重組鐵調素,對主要魚類病原體均顯示有抗菌活性[18,22,34,55](表2)。

表2 魚類鐵調素的體外表達和抗菌譜

原核表達系統中,表達菌株為大腸桿菌,細菌中表達的蛋白不能進行轉錄和翻譯后的修飾,包括糖基化、磷酸化和形成二硫鍵,但這些修飾有利于蛋白質的正確折疊和組裝[56]。原核表達系統表達的鐵調素由于不能夠正確折疊,從而會導致其失去直接殺菌活性。因此,采用真核表達系統表達Hepcidin基因,或合成鐵調素多肽,更易于研究鐵調素的生物學功能。

4.2 真核表達系統

真核表達系統中,最常用的表達菌株為畢赤酵母(Pichiapastoris),由于它自身集合了原核表達系統和真核表達系統的諸多優點,成為當前真核表達系統中最為理想的一種宿主菌。魚類鐵調素含有4對二硫鍵,由于特殊的結構,難以正確折疊其構型。采用畢赤酵母真核表達系統更有利于二硫鍵橋的形成,更容易獲得大量具有活性的鐵調素[57]。畢赤酵母真核表達的松江鱸(Trachidermusfasciatus)鐵調素,具有模式識別功能和對多種細菌的凝集活性[58]。為進行尼羅羅非魚鐵調素的大規模生產,將小體積重組畢赤酵母的過夜培養物轉移到發酵罐,甲醇誘導發酵1 d,就能產生大量的鐵調素,這些蛋白可作為石斑魚養殖的膳食補充劑,通過飼料添加可提高石斑魚免疫力[59](表2)。

真核表達系統雖然解決了原核表達系統表達蛋白活性較低問題,但重組蛋白質通常是高糖基化的,這會改變免疫原性表位,并且在此類系統中的高甘露糖基化會導致蛋白質在體內的半衰期較低,這兩個因素都會影響產品的治療活性[60]。

4.3 植物表達系統

植物表達系統具有許多優勢,主要優勢為:低生產成本、低運輸成本(無需冷藏運輸)、快速擴大規模、簡單的種子分發、易于基因操作、口服遞送以及低健康風險等[61]。He等[62]將大黃魚Hepcidin基因與擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)性腺素(Scy)基因進行融合表達,獲得能穩定高效表達Scy-hepcidin融合基因的小球藻(Chlorella),其產生的重組性腺素-鐵調素融合蛋白在體外具有較強的殺菌活性。喂食轉基因的小球藻后,可以有效保護魚類免受嗜水氣單胞菌的感染(表2)。魚類和對蝦的幼體階段,其主要以微藻(如小球藻)等為開口飼料,所以,在養殖中可根據養殖品種或生長階段的不同,采取不同的飼料制備技術來取得更經濟、更高效的健康養殖模式。

5 魚類鐵調素在食品、醫藥及水產領域中的應用

魚類鐵調素在食品、醫藥及水產領域中都有較大的實際應用價值。外源重組表達的大黃魚鐵調素,可用于食品添加劑,這種添加劑能夠影響腸道微生物群落而不引起炎癥[68]。尼羅羅非魚鐵調素對人纖維肉瘤細胞有較好的殺傷力,并且可特異性抑制人纖維肉瘤細胞的增殖和遷移,這表明鐵調素是一種應用前景較好的抗人纖維肉瘤細胞的化療藥物[50,69]。魚類鐵調素還可作為口腔癌治療的輔助或主要化療藥物,將尼羅羅非魚鐵調素納入脂質體制劑中,并增強了“表阿霉素”對人類舌鱗狀細胞癌、人類胚胎癌細胞和人宮頸癌細胞的治療效果[70,71]。水產養殖中,鐵調素可作為一種潛在的免疫調節劑和抗菌治療劑。星斑川鰈(Platichthysstellatus)鐵調素,無論是單獨使用還是與常規抗生素聯合應用,對大部分菌株均有協同作用[72]。表達鐵調素的魚卵可作為一種新型飼料補充劑,能夠提高斑馬魚對病原感染的免疫力[73]。Ting等[59]研究了尼羅羅非魚鐵調素在石斑魚養殖中的應用效果,結果發現,在飼料中添加1%的鐵調素,可提高石斑魚的免疫力,從而保護石斑魚免受細菌感染。盡管鐵調素具有替代抗生素的潛力,但在實際應用中仍面臨較多挑戰,如溶血和蛋白水解的不穩定性[74]。今后,還需要不斷深入研究鐵調素功能,并不斷優化其表達體系,以獲得更易于應用的抗菌肽。

6 總結與展望

魚類鐵調素是一個富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,也是鐵代謝的關鍵調節因子,具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲等多種功能。魚類鐵調素不僅可作為飼料添加劑應用于水產養殖業,而且也可作為抗生素的替代藥物,以用于疾病防控。多種魚類中存在鐵調素,但魚體內含量較少。由于化學合成鐵調素價格高昂,因此,采用基因工程技術,選擇適宜的表達體系,高效表達Hepcidin基因,通過優化發酵工藝,以進行工業化生產,從而獲得大量具有生物活性的鐵調素。目前魚類鐵調素的基礎研究還有待深入,關于魚類Hepcidin基因表達的信號調控、鐵代謝調節和殺菌機理的研究還需開展更多試驗,以弄清相關機制。魚類鐵調素在臨床應用方面還不夠成熟和完善,其在體內的穩定性、毒性等方面研究還不全面,有效性及安全性的研究需要進一步加強。水產養殖上鐵調素的應用還需不斷優化,以系統評價其免疫防控效果,從而使鐵調素作為抗生素替代藥物或免疫增強劑在漁業生產上更好地應用,以確保生態養殖和漁業可持續發展。