納米銀對玉米幼苗傅里葉紅外光譜特性的影響

趙海英，劉致遠，袁夢仙，張卿雯，張瓊，曹際玲*

1.通化師范學院歷史與地理學院，吉林 通化 134001；2.江西農業大學國土資源與環境學院/江西省鄱陽湖流域農業資源與生態重點實驗室，江西 南昌 330045

納米銀是指三維空間至少有一維處于1－100 nm的金屬銀單質。由于其優異的抗菌性能和獨特的催化及超導性能，被廣泛應用于醫療、食品、紡織品、涂料及農業等多個領域，據統計納米銀已應用于全球近300種不同類型的產品（Marchi et al.，2019；Zhao et al.，2021）。納米銀產品的大量生產和使用，使其不可避免地進入環境中。納米銀可通過污泥、地表水、農藥噴施和灌溉等不同途徑進入土壤，對植物生長產生一定的威脅（Madanayake et al.，2022）。已有研究發現一定濃度納米銀可引起植物光合色素分解、抑制光合作用、降低對營養元素的吸收，進而導致植物生物量下降（Falco et al.，2020）。還有研究發現納米銀使作物結實率降低，影響籽粒品質，降低精氨酸和組氨酸的比例（Yang et al.，2018；Yan et al.，2022）。納米銀還可進入植物體內并累積，從而通過食物鏈對動物和人體健康造成潛在危害（彭小鳳等，2014）。因此，納米材料暴露的植物生物效應引起廣泛關注。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）是一種基于有機物分子中極性鍵振動分析物質組成和含量的技術，通過吸收峰的高低以及在不同波數吸收峰的走向，準確分析有機物分子的種類、結構及含量的高低。由于它的靈敏度高、操作安全性高、測試方法簡便且時間短等優點，傅里葉變換紅外光譜已被廣泛應用于研究不同環境有機物組成結構和含量響應（胡立新等，2021）。例如，夏鎮卿等（2020）研究發現增溫脅迫下玉米植株內源物質合成受阻，植株多糖、脂類含量下降。還有研究發現高硼脅迫改變了砧木蛋白質和可溶性糖的結構降低了其含量（盧曉佩等，2017）。付川等（2014）研究紫花苜蓿對銅脅迫的生理響應，發現植物化學組分和含量的變化有助于揭示其銅耐性機理，紫花苜?？煞置谟袡C酸和提高油脂化合物含量將吸收的銅大部分積累在根部，阻止銅向植物地上部分運輸，有效地保護植物地上部分。還有研究發現鉛脅迫下博落回植株細胞內羧基和羥基等基團和有機酸、蛋白質含量增加，可鰲合與固定鉛，降低鉛對博落回的毒性效應（蔡斌等，2021）。銅脅迫下沙田柚根系果膠、纖維素和蛋白質等物質含量增加，有助于吸附和固定銅，降低銅的毒害作用（李欣鈺等，2022）。鎘脅迫下龍葵根系羧基和羥基等有機物含量的增加有助于吸附鎘降低鎘毒害（Wang et al.，2020）。Zuverza-Mena et al.（2016）研究發現納米銀改變了蘿卜植株根系和葉片脂肪酸、蛋白質和木質素、纖維素等細胞結構物質含量進而影響植株生長。還有研究發現納米銀增加了黃瓜幼苗酚類化合物含量以抵抗納米銀的氧化脅迫（Zhang et al.，2018）。然而，目前納米銀暴露對玉米植株有機物質組分和結構的影響研究還尚少。

玉米是中國重要的糧食作物之一，是人類和畜禽的重要食物來源，也是重要的工業原料。本研究以玉米為供試植物，以納米銀為供試材料，在盆栽條件下模擬不同納米銀污染水平的土壤，采用傅里葉變換紅外光譜分析玉米幼苗葉片和根系的紅外光譜特征，根據吸收峰的變化探究不同濃度納米銀對玉米幼苗葉片和根系主要代謝物的影響，并結合玉米幼苗生長情況，探究納米銀對玉米幼苗生長的作用機理，為系統評價納米材料的環境生態效應和納米產品的安全使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試盆栽土壤采自河南封丘的中國科學院實驗站內的農田，土壤類型為華北平原典型潮土，作物種植模式為冬小麥-夏玉米輪作。小麥成熟后玉米種植前，采集耕層土壤，風干后去除石塊、植物殘體等，過2 mm篩備用。供試納米銀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，平均粒徑約15 nm，純度為99.8%。

1.2 試驗設計

參照納米銀生態效應研究（He et al.，2022；Noori et al.，2017），設置3個納米銀施加濃度：1.0 mg·kg-1（L）、5.0 mg·kg-1（M）、10.0 mg·kg-1（H），以不施加納米銀（0 mg·kg-1）為對照，每個處理3次重復。稱取過篩土壤200 g，根據不同施加濃度，將相應量納米銀分別加入到相同體積的雙蒸水中，混合均勻后逐滴加入到土壤表面。選取形態相近的玉米種子，首先用0.5%次氯酸鈉將玉米種子表面消毒，再放入恒溫培養箱中催芽2 d。選擇已發芽的玉米種子播種在土壤表層下0.5 cm左右，每盆播種2顆。盆栽試驗在日光溫室進行，不同處理盆栽隨機擺放并定期交換調整位置，定期澆水且每盆澆相同水量，每周每盆澆灌15 mL營養液。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 玉米植株生物量的測定

待玉米種植30 d，將植物地上部分和地下部分分別收獲，取新鮮根系和葉片稱鮮重后用于測定掃描電鏡，其余部分稱鮮重后烘干對玉米幼苗的地上部和地下部稱重，并計算得到地上部和地下部干重。植物地上部和地下部烘干后分別磨碎過0.15 mm篩孔，用于測定FTIR。

1.3.2 玉米植株傅里葉紅外光譜測定

稱取2 mg根系和葉片樣品，溴化鉀200 mg，將兩者混合后研磨均勻，粉末樣品與溴化鉀粉末以1:100（質量比）的比例放入瑪瑙研缽中攪磨均勻并壓片，置于傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS50,Thermo，美國）選用DTGS檢測器測定光譜特性。掃描范圍為4000－400 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數為64次。測試時環境條件：相對濕度為65%±2%，溫度為 (24±1) ℃。

1.4 數據處理

采用Excel 2007軟件計算數據平均值和標準偏差。利用SPSS 18.0進行單因素方差分析，并對同一處理3個重復的光譜數據進行相關分析，相關系數大于0.99，表明光譜重復性較好。采用Omnic 8.0軟件對FTIR圖譜數據進行處理，將透射率數據轉換為吸光度后，進行基線校正，并以根系（葉片）最高吸光度為標準，對光譜數據進行極差標準歸一化處理，以提高不同納米銀濃度處理間光譜數據的可比性，最后通過光譜吸收峰相對吸光度的變化分析納米銀對玉米植株有機物質含量的影響。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 納米銀對玉米幼苗生長的影響

不同濃度納米銀對玉米幼苗地上部和地下部生物量產生了不同程度的影響（圖1）。與對照處理相比，隨著納米銀施加濃度的增加，玉米幼苗地上部和地下部生物量呈下降趨勢，高濃度納米銀處理下玉米幼苗地上部和地下部生物量顯著（P<0.05）下降，降幅分別達16.5%和22.2%，可見納米銀對玉米幼苗地下部的影響程度大于地上部。

圖1 不同濃度納米銀處理下玉米幼苗地上部和地下部生物量Figure 1 Shoot dry biomass and root dry biomass of maize seedlings under different concentrations of AgNPs

2.2 納米銀對玉米幼苗根部紅外光譜特性的影響

FTIR圖譜能夠反映出物質所含的官能團的種類，不同吸收峰波數代表不同的化學成分官能團種類（表1）。通過FTIR測定發現不同濃度納米銀處理下玉米根系的各化學官能團的吸收處于波數4000－400 cm-1的中紅外區（圖2）。

表1 紅外光譜中有機物、官能團及其對應的FTIR特征波長Table 1 Main organic matter,functional groups and their corresponding FTIR characteristic wavelengths

圖2 不同濃度納米銀處理下玉米幼苗根系的傅里葉紅外光譜特征（4000－400 cm-1）Figure 2 FTIR spectra of the roots of maize seedlings under different concentration of AgNPs(4000-400 cm–1)

由圖2可以看出，不同濃度納米銀處理下玉米幼苗根系光譜均有典型的共有特征吸收峰，但各處理間在4000－400 cm-1波數范圍內特征吸收峰位置和吸光度大小存在差異。低中濃度納米銀（1.0、5.0 mg·kg-1）處理下特征峰相對吸光度高于對照處理，高濃度納米銀（10.0 mg·kg-1）處理下特征峰的相對吸光度明顯低于對照處理，表明不同濃度納米銀處理下玉米根系有機物組分組成和含量發生了不同程度的改變。波數3405 cm-1附近的特征峰是碳水化合物羥基O-H和N-H伸縮振動引起的。對照處理下玉米根系中該吸收峰位于3405 cm-1，低、中濃度納米銀處理下，玉米根系中該吸收峰位于3396 cm-1和3400 cm-1向低頻方向分別發生了9 cm-1和5 cm-1的位移，且相對吸光度明顯高于對照，而高濃度納米銀下玉米根系該吸收峰的位移變化較?。ū?），相對吸光度降低，說明低中濃度納米銀影響了玉米根系中氫鍵的結合，改變碳水化合物的結構，增加碳水化合物含量，高濃度納米銀未改變碳水化合物的結構但降低了其含量。2925 cm-1附近的吸收峰是脂類化合物中飽和-CH2中的C-H和有機酸類物質的羧酸羧基O-H的伸縮振動產生。與對照處理相比，無論低濃度納米銀還是高濃度納米銀處理下2925 cm-1吸收峰的位置均變化較小，但低中濃度納米銀下該吸收峰的相對吸光度明顯增加，高濃度納米銀處理下相對吸光度降低，表明納米銀對玉米根系脂類化合物的結構未產生顯著影響，但改變了其含量。此外，在1800－800 cm-1波數范圍內特征吸收峰較集中且處理間變化明顯，為提高FTIR譜圖分辨率更好解析有機物的變化規律，進一步分析不同處理下1800－800 cm-1范圍內的FTIR譜圖（圖3）。

表2 不同濃度納米銀處理下玉米根系特征吸收峰波數Table 2 Characteristic peak wave number of FTIR in maize root under different concentration of AgNPs

圖3 不同濃度納米銀處理下玉米幼苗根系的傅里葉紅外光譜圖（1800－800 cm-1）Figure 3 FTIR spectra of the roots of maize seedlings under different concentration of AgNPs(1800-800 cm-1)

由圖3可以看出，與對照處理相比，納米銀處理下玉米根系在1800－800 cm-1范圍內的吸收峰數量和位置無顯著變化，但相對吸光度發生了明顯變化，意味著納米銀對1800－800 cm-1范圍內根系有機物質結構影響較小，但改變了根系有機物質含量。低、中濃度納米銀（1.0、5.0 mg·kg-1）下特征吸收峰吸光度明顯增加，而高濃度納米銀（10.0 mg·kg-1）下吸收峰相對吸光度一定程度的降低。由此可見，低、中濃度納米銀脅迫下根系蛋白質、可溶性糖、纖維素、果膠、酯類等有機大分子物質結構未發生改變，但其含量明顯增多，這可能是低中濃度納米銀脅迫下根系受到氧化脅迫，大分子物質的增多可用于抵抗納米銀脅迫，而在高濃度納米銀脅迫下植物生長發育受到抑制，合成的有機物質減少。1637、1559、1256 cm-1波數左右的特征峰表示蛋白質酰胺?、Ⅱ、Ⅲ帶，其吸光度隨納米銀濃度升高先升高后降低，高濃度納米銀脅迫下玉米根系蛋白質含量減低。在波數1039 cm-1附近的特征峰表征糖類碳水化合物，其吸光度變化幅度較大，表明納米銀對糖類碳水化合物含量的影響較大。

2.3 納米銀對玉米幼苗葉片紅外光譜特性的影響

FTIR圖譜顯示不同濃度納米銀處理下玉米葉片的各有機分子的吸收峰位于中紅外區，即波數4000－400 cm-1范圍內（圖4）。不同處理間的葉片譜圖均包含典型共有吸收峰，但特征峰數目和相對吸光度大小發生了不同程度的變化。低濃度納米銀處理下4000－1500 cm-1波數時特征峰的相對吸光度高于對照處理，在波數1500－800 cm-1附近特征峰的相對吸光度低于對照處理低濃度納米銀葉片吸收峰吸光度變化較小，中、高濃度納米銀條件下葉片4000－400 cm-1波數范圍特征峰的相對吸光度明顯低于對照處理。結合表3進一步分析發現，3405 cm-1波數附近的特征峰在低濃度納米銀處理下該吸收峰向高頻方向發生了10 cm-1的位移，而中、高濃度納米銀下玉米根系該吸收峰的位移變化較?。ū?）。低濃度納米銀處理下1559 cm-1，1517 cm-1處的吸收峰缺失，高濃度納米銀下1517 cm-1的吸收峰缺失，并且1633 cm-1處的吸收峰向高頻方向位移了14 cm-1，其他吸收峰位置變化較小。由此可見，納米銀處理下玉米葉片物質結構和含量發生了不同程度的改變。波數1800－400 cm-1范圍內特征峰數量集中，為減少疊加更高分辨率解析FTIR譜圖，對該范圍內進一步分析譜圖（圖5）。

表3 不同濃度納米銀處理下玉米葉片特征吸收峰波數Table 3 Characteristic peak wave number of FTIR in maize leaves under different concentration of AgNPs

圖4 不同濃度納米銀處理下玉米幼苗葉片的傅里葉紅外光譜圖（4000－400 cm-1）Figure 4 FTIR spectra of the leaves of maize seedlings under different concentration of AgNPs(4000-400 cm-1)

圖5 不同濃度納米銀處理下玉米幼苗葉片的傅里葉紅外光譜圖（1800－800 cm-1）Figure 5 FTIR spectra of the leaves of maize seedlings under different concentration of AgNPs(1800-800 cm-1)

由圖5可以看出，與對照處理相比，低濃度納米銀下1559、1517、1490 cm-1處的吸收峰缺失，1559、1517、1490 cm-1吸收峰分布代表蛋白質酰胺II帶、酚類物質的苯環骨架振動吸收及細胞壁多糖中碳氫鍵發生不對稱變形表明低濃度納米銀破壞了酰胺II帶、酚類物質的化學結構、葉片細胞的細胞壁中多糖類物質。高濃度納米銀下1517 cm-1的吸收峰缺失，且1633 cm-1處的吸收峰向高頻方向位移了14 cm-1，其他吸收峰位置變化較小，表明高濃度納米銀改變了酚類物質和蛋白質酰胺I帶結構。從特征峰吸光度來看，1633 cm-1處的吸收峰吸光度在中高濃度納米銀下明顯降低，且高濃度納米銀的降幅更大，說明高濃度降低了蛋白質含量。此外1600－400 cm-1范圍內的1384、1258、1202、1160、1104和1056 cm-1特征峰吸光度均隨著納米銀濃度的增加而下降，意味著納米銀脅迫顯著降低了膜和胞壁含油脂化合物、核酸、蛋白質分子氨基酸殘基、纖維素糖苷和多糖、果膠類等物質含量。而在低濃度納米銀下3405、1633 cm-1波數特征峰吸光度高于對照，說明低濃度納米銀增加了葉片碳水化合物和蛋白質含量。

3 討論

納米銀的尺寸效應和銀離子的強氧化性對植物生長和代謝產生一定程度的脅迫或抑制作用，且影響程度與納米銀濃度密切相關（黃德超等，2016）。本研究發現低濃度納米銀（1.0 mg·kg-1）對玉米幼苗生長的影響較小，但隨著納米銀濃度的增加玉米幼苗生物量呈下降趨勢，高濃度納米銀（10.0 mg·kg-1）顯著抑制了玉米幼苗生長，這與以往的研究結果類似（Zhang et al.，2020；王榮等，2015）。例如，Linares et al.（2020）研究發現納米銀（3.9－394 mg·kg-1）對大麥幼苗生長的影響表現為濃度劑量效應，隨著納米銀濃度的增加，大麥幼苗地上部和地下部生物量的降幅均顯著增加。還有研究發現10.0 mg·kg-1的納米銀未對黑麥草生長產生明顯影響，但20－200 mg·kg-1納米銀顯著抑制了植物生長（王榮等，2015）。因此，同一濃度納米銀在不同條件下對不同植物生長的影響不同，這表明納米銀的植物生物效應不僅與其濃度有關，還受其他因素的影響。已有研究證實土壤有機質、礦物組分等可影響納米銀在土壤中的有效性進而改變納米銀的植物生物效應（Wang et al.，2015）。例如，土壤有機質可吸附和固定納米材料，有機質含量不同的土壤納米材料的生物毒性效應也不同（Ge et al.，2014；Watson et al.，2015）。此外，還有一些研究發現高濃度納米銀抑制植物生長，低濃度納米銀促進了植物生長（Acharya et al.，2020；Yan et al.，2022）。目前大量研究證實納米銀可進入植物體內產生氧化脅迫進而抑制植物生長（Madanayake et al.，2022；Xu et al.，2020），但低濃度納米銀促進植物生長的機制尚不清楚。這種“低促高抑”的現象類似于重金屬污染的hormesis效應，即低劑量脅迫對生物體的刺激作用，也是生物體對脅迫的過激響應（Calabrese et al.，2003）。研究發現，納米銀脅迫可促進活性氧的產生，一定量的活性氧可作為信號分子和信號轉導通道誘導植物抗性途徑進而促進植物生長（Tripathy et al.，2012；Yan et al.，2022）。低濃度納米銀還可能通過促進植物有益細菌的生長，提高土壤碳氮循環進而間接促進植物生長（Yan et al.，2022）。隨著納米銀濃度的增加，活性氧產生量增加，植物抗性系統不能夠清除活性氧，進而產生氧化脅迫抑制植物生長（Qian et al.，2013）。

植物體內有機物質是植物生長和代謝的主要能量來源，其在植物體內組成和含量的變化能反映植物的生理狀況，也能反映植物對環境變化的動態響應。本研究通過FTIR技術分析植物代謝物對納米銀脅迫的響應，發現低濃度納米銀導致植物根系羥基、羧基等官能團和脂類化合物、碳水化合物、可溶性糖和蛋白質等有機物含量增加。羥基和羧基等官能團能與金屬離子結合，其含量的增加可固定納米銀從而降低其植物的毒性作用（Meychik et al.，2014；Jia et al.，2019）。重金屬脅迫下的研究利用FTIR技術也發現重金屬脅迫增加了植物體內羥基和羧基含量，進而降低重金屬對植物的脅迫作用（Wang et al.，2020；蔡斌等，2021）。此外，可溶性糖是植物光合作用的同化產物，同時也是重要的滲透調節物質，在逆境脅迫中發揮著重要作用（Imaji et al.，2010）。近年來有研究發現在氧化脅迫下植物通過促進可溶性糖的合成來調節滲透壓，抵抗氧化脅迫（周慧敏等，2019）。Zhang et al.（2018）研究發現納米銀增加了植物酚類化合物含量以抵抗納米銀的氧化脅迫?；诘鞍踪|組學的研究也發現納米銀處理下植物可通過調節有機物質代謝循環為細胞提供能量以響應納米銀脅迫（Jhanzab et al.，2019；Mustafa et al.，2015）。但低濃度納米銀處理下植物葉片代謝物含量的變化程度較地下部分小，這可能是由于土壤中納米銀直接與植物根系作用，吸附在植物根系表面、進入根系細胞，再從根系進入植物地上部分，對植物地下部分的作用更大（Dimkpa et al.，2015）。無論植物根系還是葉片，高濃度納米銀處理下由于脅迫程度的增大植物代謝物吸收峰吸光度均下降，表明高濃度納米銀抑制了植物地上部和地下部有機物合成。這與納米銀處理下蘿卜植株脂肪酸和碳水化合物等有機物質的變化趨勢一致，這些有機分子含量的下降和組成的變化將不利于植物生長發育，導致生物量降低（Zuverza-Mena et al.，2016）?；诠夂蠀档臏y定證實高濃度納米銀抑制了植物光合作用和二氧化碳同化，進而影響碳水化合物的合成（Falco et al.，2020）。還有研究發現納米銀處理下植物氮同化基因表達水平下調，抑制蛋白質的合成（Das et al.，2018）。高硼脅迫下的研究也發現植物碳水化合物和蛋白質的含量下降（盧曉佩等，2017）。

4 結論

通過盆栽試驗模擬不同納米銀污染水平的土壤，發現低濃度（1.0、5.0 mg·kg-1）納米銀對玉米幼苗生物量的影響較小，高濃度（10.0 mg·kg-1）的納米銀可對玉米幼苗產生一定的毒性效應，降低了玉米幼苗地上部和地下部生物量。低濃度納米銀增加了玉米幼苗根系羧基、羥基等官能團、有機酸、蛋白質和碳水化合物等有機物質含量，可能是納米銀脅迫下玉米通過調節蛋白質、碳水化合物等有機物含量抵抗納米銀的脅迫作用，從而降低納米銀對玉米幼苗生長的影響。高濃度納米銀對玉米幼苗根系和葉片的脅迫作用增大，降低了玉米幼苗根系和葉片蛋白質、碳水化合物和脂質等有機物質含量，抑制了玉米幼苗生長。本研究結果有助于深入認識納米材料的植物生物效應，為納米材料對植物生長和生理代謝作用機理的闡釋提供依據。