稻田土壤氮循環與砷形態轉化耦合的研究進展

朱憶雯，尹丹，胡敏，杜衍紅，洪澤彬，程寬，于煥云*

1.廣東工業大學環境科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省科學院生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3.長江大學農學院，湖北 荊州 434000；4.常州大學環境科學與工程學院，江蘇 常州 213164

砷是一種劇毒的類金屬物質，普遍存在于自然環境中，長期接觸會對人類健康產生極大威脅。農業環境中，利用砷污染地下水灌溉農作物是導致土壤與糧食砷含量超標的主要原因之一。與其他農作物相比，水稻更容易吸收土壤中的砷，導致稻米中砷超標，并通過食物鏈進入人體可造成慢性中毒，引發多種疾?。⊿harma et al.，2021）。水稻作為最主要的農作物之一，全球一半的人口以稻米為主食，隨著全球人口不斷增加，水稻的需求也在增長（Bao et al.，2022），因此稻田砷污染問題備受關注。

稻田土壤中砷主要以無機砷（三價砷As(Ⅲ)、五價砷As(Ⅴ)）存在，其次為有機砷（一甲基砷酸（MMA(Ⅴ)）、二甲基砷酸（DMA(Ⅴ)）等）。稻田土壤中砷轉化一般包括砷氧化、砷還原、砷甲基化和脫甲基化等過程，主要是由微生物驅動，且受多種因素影響（Yamaguchi et al.，2011；Yang et al.，2022）。稻田常常施用大量氮肥，但僅有35%氮肥被水稻所吸收利用，過量施用氮肥可造成環境氮污染（朱兆良，2008）。稻田氮循環主要包括了硝化作用（Nitrification）、反硝化作用（Denitrification）、厭氧氨氧化（Anmmox）、鐵氨氧化（Feammox）以及硝酸鹽異化還原成銨（DNRA）等過程。稻田土壤砷轉化與氮循環過程聯系緊密。

稻田淹水條件下，砷氧化微生物可以硝酸鹽為電子受體氧化As(Ⅲ)，從而降低砷移動性（Lin et al.，2018；Li et al.，2019；Wu et al.，2021）。進一步研究發現，硝酸鹽還原耦合砷氧化過程主要由具有完整反硝化基因的砷氧化微生物及硝酸鹽還原微生物驅動（Li et al.，2019）。此外，砷污染稻田土壤施加硝態氮肥可抑制土壤中鐵氧化物的還原溶解，且促進亞鐵氧化過程（劉同旭等，2019），從而有利于砷的吸附固定（Chen et al.，2008）。除硝態氮肥外，施加銨態氮肥對砷的移動性亦具有顯著影響（Liu et al.，2022）。最新的研究發現，厭氧氨氧化可與砷還原過程耦合，該過程的發現為土壤氮、砷元素生物地球化學行為研究提供了新認識（Zhang et al.，2022）。近年來，厭氧氨氧化與Fe(Ⅲ)還原耦合的鐵氨氧化過程對稻田砷地球化學行為的影響也受到廣泛關注（Li et al.，2019；Liu et al.，2022）。砷污染稻田土壤淹水條件下，施加銨態氮肥可促進含砷的氧化鐵礦物的還原溶解并釋放砷，從而導致砷移動性與有效性增強（Chen et al.，2023）。此外，研究發現，在地下水環境條件下，硝酸鹽異化還原成銨可與砷還原過程耦合（Gao et al.，2021；Jiang et al.，2022），但該耦合過程在土壤環境的研究報道目前還較少。

本文基于已有的文獻報道，對稻田土壤微生物氮循環過程、砷的微生物轉化過程及不同氮循環過程對砷遷移轉化的影響等進行系統分析和總結，并提出了稻田土壤氮循環與砷形態轉化耦合研究的發展趨勢。

1 稻田土壤微生物氮循環

氮循環是由微生物驅動的各種氮的氧化還原過程，如圖1所示，包括硝化作用、反硝化作用、厭氧氨氧化、鐵氨氧化和硝酸鹽異化還原成銨等。施加銨態氮肥可促進稻田土壤中銨態氮氧化，如厭氧氨氧化過程、異化Fe(Ⅲ)還原耦合的鐵氨氧化過程等；施加硝態氮肥，稻田土壤中則易發生硝酸鹽異化還原成銨、反硝化過程等。

圖1 稻田土壤氮循環過程（Yi et al.，2019）Figure 1 Nitrogen cycling process in paddy soil

1.1 硝化作用

硝化作用由氨氧化（Ammonia oxidation）與亞硝酸鹽氧化（Nitrite oxidation）兩步組成，且硝化作用連接了固氮作用與反硝化作用，所以該過程在土壤-植物系統氮循環中發揮關鍵作用（Li et al.，2018）。硝化作用分為自養型和異養型。微生物將NH4+/NH3氧化成NO3-或NO2-，并從中獲取能量的過程是自養型硝化，而有些微生物不在該過程中獲取能量則為異養型硝化（Hayatsu et al.，2008）。稻田土壤中主要由自養型硝化微生物驅動硝化過程（De Boer et al.，2001）。硝化過程的關鍵微生物有參與氨氧化過程的氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）、氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）和全程氨氧化細菌（Comammox）（De Boer et al.，2001；Li et al.，2018；Dai et al.，2021），以及參與亞硝酸鹽氧化的亞硝酸鹽氧化菌（NOB）（Hayatsu et al.，2008；Hayatsu et al.，2021）。不同生態系統中，氨氧化菌的類型不同。比如在海洋中，AOA是優勢氨氧化菌；而在農田土壤中，AOB氨氧化作用更強（Francis et al.，2007；Jia et al.，2009；Morimoto et al.，2011）。因此，AOB在稻田土壤中發揮的氨氧化作用強于AOA。比如，Li et al.（2006）研究發現，淹水水稻土中AOB的豐度與硝化活性成顯著正相關；Hussain et al.（2011）研究水稻根際土壤氨氧化菌與反硝化菌豐度變化時發現，淹水條件下AOB與反硝化菌豐度增加，而AOA無明顯變化；近期的研究發現，使用有機肥替代礦質肥料可以提高稻田土壤硝化速率，且AOB對硝化作用的貢獻大于AOA（Dai et al.，2021）。

亞硝酸鹽氧化過程主要由亞硝酸鹽氧化菌（NOB）參與，分布在Nitrobacter、Nitrospina、Nitrococcus和Nitrospira等4個屬（Hayatsu et al.，2008）。2009年，Ishii et al.（2009，2011）基于大規模16S rRNA基因測序研究了水稻中亞硝酸鹽氧化菌群落，發現水稻土中Nitrospira屬微生物具有亞硝酸鹽氧化能力。Nahar等報道了孟加拉國水稻土中NOB的相對豐度與硝化速率成正相關（Nahar et al.，2020），證明NOB參與了硝化反應。

1.2 反硝化作用

微生物驅動的反硝化作用是一個呼吸過程，主要發生在厭氧或者缺氧環境中。在該過程中，利用無機碳化合物作為碳源的自養型反硝化微生物（Ma et al.，2020）與利用有機碳源做電子供體的異養反硝化微生物將硝酸鹽（NO3-）逐步還原成亞硝酸鹽（NO2-）、一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N2O）和氮氣（N2）（Ren et al.，2022）。其中，硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）和一氧化二氮還原酶（Nos）發揮了重要作用（Jones et al.，2008；Miralles Robledillo et al.，2021）。研究發現，稻田土壤中反硝化微生物種類多樣（Ishii et al.，2011）。比如，Saito et al.（2008）利用穩定同位素探針（SIP）技術分析了稻田土壤反硝化微生物，鑒定出兩株以琥珀酸為電子供體的反硝化微生物即Burkholderiales和Rhodocyclales菌。Ishii et al.（2009）通過克隆文庫分析，在稻田土壤中發現反硝化微生物在目水平上屬于Burkholderiales、Rhodocyclales和Desulfomonadales。在Burkholderiales目中，Herbaspirillumspp.被確定為進行硝酸鹽呼吸和反硝化的關鍵參與者。在水稻土中分離出屬水平上的反硝化微生物Bradyrhizobium、Dechloromonas、Herbaspirillum和Pseudogulbenkiania（Tago et al.，2011）。近期基于宏基因組學研究發現，在中國沿海潮灘、鹽堿地和內陸水稻土中廣泛存在Alphaproteobacteria-affiliating nosZ clade I和Bacteroidetes-affiliating nosZ clade II反硝化微生物（Han et al.，2021）。其中clade I和clade II是Nos編碼基因nosZ的兩個不同遺傳支系（Domeignoz-Horta et al.，2018）。clade I發現已久，存在于多種細菌和古菌當中。clade II是一個新發現的nosZ基因遺傳支系，其在基因表達、電子傳遞和N2O還原活性方面比clade I具有更加明顯的特征（Duan et al.，2018）。

1.3 厭氧氨氧化

反硝化作用一直被認為是產生N2的唯一途徑，直到厭氧氨氧化的發現。厭氧氨氧化過程是厭氧或缺氧條件下，銨（NH4+）氧化與亞硝酸鹽（NO2-）還原耦合產生N2（Mulder et al.，1995；Zhu et al.，2011；Shan et al.，2018；Shen et al.，2020）。迄今為止，已報道了5個厭氧氨氧化菌屬Candidatus Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus、Jettenia和Scalindua，而在水稻土中占優勢的是Candidatus Brocadia屬（Han et al.，2021）。

厭氧氨氧化過程在稻田土壤中很活躍，也被認為是稻田生態系統中氮損失的重要途徑（Yang et al.，2015）。由于稻田環境復雜，厭氧氨氧化過程在稻田土壤中也受多種因素影響。例如，不同形態氮肥的施加會影響厭氧氨氧化細菌豐度（Shen et al.，2020）。Shen et al.（2020）在水稻土里分別添加了化肥與有機肥，研究厭氧氨氧化菌的活性與豐度。同位素示蹤實驗結果表明，厭氧氨氧化活性及厭氧氨氧化細菌豐度在有機肥處理中最高，且發現淹水稻田土壤中厭氧氨氧化過程可產生大量N2。除氮肥形態的影響，厭氧氨氧化活性還會受到稻田土壤pH和有機碳等影響（Shan et al.，2018），這對稻田氮損失研究具有重要指導意義。

1.4 鐵氨氧化

稻田土壤富含豐富的Fe與NH4+，周期性淹水與落干使得Fe在水稻土中發生各種轉化，厭氧氨氧化與鐵還原的耦合被稱為“Feammox”反應（Li et al.，2019）。鐵氨氧化過程是在厭氧條件下，微生物將NH4+作為電子供體，氧化Fe(Ⅲ)，最終產物有N2、NO3-或NO2-（程寬等，2022）。鐵與氮循環的耦聯已經被多次報道。2005年，Clément et al.（2005）研究河岸森林沉積物中Fe和氮循環的動力學發現，存在將Fe(Ⅲ)作為電子受體同時氧化NH4+的生物過程，且該過程在熱力學上是可行的，并且指出該過程可能在土壤氮循環中發揮關鍵作用。2006年，“Feammox”過程被首次提出（Sawayama，2006）。Sawayama（2006）在厭氧條件下探討了NH4+氧化與Fe(Ⅲ)-EDTA-Na還原耦合過程，該實驗在玻璃反應器中厭氧運行數天，在特定時間向反應器中加入Fe(Ⅲ)-EDTA-Na時，反應器中銨根濃度不斷降低，同時亞硝酸鹽濃度上升；當反應器中不供給Fe(Ⅲ)-EDTA-Na時，反應器中銨根濃度升高，且亞硝酸鹽濃度降低。該實驗結果證明鐵還原微生物可將Fe(Ⅲ)還原為Fe(Ⅱ)同時將NH4+氧化成NO2-。2012年，Yang et al.（2012）發現Feammox反應在熱帶旱地土壤中可產生N2、NO3-或者NO2-，并認為生成N2是Feammox反應中主要的氮損失途徑。

稻田環境中Feammox反應是氮損失的主要途徑之一。2014年，Ding et al.（2014）首次在水稻土中發現Feammox反應，且證明生成N2是稻田Feammox反應的主要途徑。據估算，稻田土壤中約3.9%－31%的氮肥是通過Feammox反應損失。2020年，Ding et al.（2020）報道稻田土壤中與Feammox相關的微生物包括Geobacter、Candidatus Solibacter、Nitrososphaeraceae、Leptolyngbya、Pseudomonas、Anaeromyxobacter等。Ding et al.（2021）進一步采用15N標記的同位素示蹤技術，研究了Feammox反應在稻田土壤垂直分布的差異及與傳統氮損失途徑的關系。結果表明，Feammox導致的氮損失在20－40 cm的水稻土中高達26.1%。2015年，Huang et al.（2015）首次報道了Acidimicrobiaceaesp.A6菌在Feammox過程起關鍵作用。2018年，Acidimicrobiaceaesp.A6菌首次在美國新澤西州的河岸濕地土壤中被分離出來，該菌株在厭氧條件下能氧化NH4+同時還原Fe(Ⅲ)（Senko et al.，2018）。2019年，Shuai et al.（2019）采集美國新澤西州的河岸濕地沉積物，建造了人工濕地對Acidimicrobiaceaesp.A6菌進行富集培養。接種A6菌，高鐵含量的人工濕地中NH4+去除率為25.0%±7.3%，而低鐵含量的NH4+去除率僅11.0%±9.7%，這表明可以通過促進Feammox反應提高濕地NH4+的去除。Zhang et al.（2021）等采集了不同類型的農田土壤，研究了土壤中自養氨氧化微生物多樣性、豐度及影響這些微生物對土壤氨氧化的相對貢獻。研究發現，Feammox反應中，Acidimicrobiaceaesp.A6具有最高的氨氧化速率，達到了 (1.23±0.98) μmol·g-1·d-1。綜上所述，目前僅分離出一株直接參與Feammox過程的單菌Acidimicrobiaceaesp.A6，參與Feammox反應的微生物仍有待進一步挖掘。

1.5 硝酸鹽異化還原成銨

硝酸鹽異化還原成銨是微生物氮循環的重要過程之一。與反硝化作用不同，DNRA是在厭氧條件下，微生物將NO2-/NO3-作為電子受體生成NH4+的過程，由nrfA基因編碼的硝酸鹽還原酶Nrf催化（Pandey et al.，2018；Zhao et al.，2022）。研究發現，在碳源充足而氮源缺乏的環境條件下，更容易發生DNRA而不是異養反硝化作用（Pandey et al.，2020；Broman et al.，2021）。驅動DNRA的微生物是發酵型細菌而參與反硝化過程的菌是呼吸細菌。反硝化可造成環境的氮損失而DNRA可保留氮素，對喜銨的農作物更有利（周利等，2020）。

純培養下的DNRA現象早在1938年已被發現，隨著研究的不斷深入，驅動該過程的其他功能微生物也逐步被發現（Woods，1938；Pandey et al.，2020）。由于水稻是喜銨作物，而DNRA過程能為水稻提供銨，因此DNRA在稻田環境中具有重要作用（Nojiri et al.，2020）。2020年，Nojiri et al.（2020）研究發現，參與DNRA的相關功能微生物主要是Anaeromyxobacter和Geobacter，并發現驅動DNRA和反硝化作用的微生物有所不同，但二者的反應速率相近。稻田土壤中，DNRA可以有效得降低因反硝化及硝酸鹽淋失造成的氮損失，有利于稻田氮損失的控制與農作物的低施肥管理，同時緩解環境氮素污染（Nojiri et al.，2020）。

2 稻田土壤砷的微生物轉化

砷(As)是一種有毒且致癌的類金屬物質，對人體健康可產生極大的威脅（Hussain et al.，2021；Rokonuzzaman et al.，2022）。世界上很多地區都存在砷污染的困擾。例如，孟加拉國地下水砷污染嚴重，灌溉含砷污染的地下水導致水稻與土壤中富集大量的砷，人體攝入砷超標大米可造成嚴重的健康問題（Islam et al.，2017）。此外，長期暴露在砷污染的環境中可導致人體的神經系統、呼吸系統、皮膚等病變（Shahid et al.，2018；Hussain et al.，2019）。水稻-土壤系統中淹水-落干交替條件下，砷的生物地球化學行為發生周期性的變化（Hussain et al.，2021）。如圖2所示，當稻田處于淹水條件時，鐵氧化物還原溶解并釋放As至孔隙水中，且砷以亞砷酸鹽（As(Ⅲ)）的形式存在（Herath et al.，2016；Beiyuan et al.，2017；Lin et al.，2018）；當稻田處于落干環境時，砷主要以砷酸鹽（As(Ⅴ)）的形式存在且生物利用度降低（Dixit et al.，2003；Oremland et al.，2005）。水稻-土壤系統中砷的形態受各種因素的影響，例如pH、Eh、天然有機物（DOM）、鐵（錳）氧化物和微生物等，特別是稻田土壤微生物對砷的遷移與生物轉化有著重要的影響（Upadhyay et al.，2018）。

圖2 稻田土壤砷微生物轉化過程Figure 2 Microbial transformation process of arsenic in paddy soil

2.1 砷還原

微生物介導的As(Ⅴ)還原有兩種機制，一種是微生物介導細胞質As(Ⅴ)還原的解毒機制，另一種是微生物介導異化As(Ⅴ)還原的呼吸機制。微生物對砷解毒機制主要通過自帶的砷抗性編碼酶和外排泵將細胞質中的砷排出，這種機制主要存在于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中（Mateos et al.，2017）。解毒過程主要通過磷酸鹽轉運蛋白以砷酸鹽的形式吸收As(Ⅴ)，再通過砷酸鹽還原酶將As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)排出（Rosen，2002；Zhang et al.，2015；Qiao et al.，2018）。該過程與arsC基因相關，且普遍存在于好養、厭氧微生物中（鐘松雄等，2018）。呼吸作用通過砷酸鹽呼吸還原酶（arrA）進行，厭氧條件下將As(Ⅴ)作為微生物呼吸的末端電子，并通過呼吸還原作用為自身提供能量（Zhang et al.，2015；Kumarathilaka et al.，2018）。例如，很早被分離出來的異化砷酸鹽還原菌Bacillussp.SF-1具有強烈的砷酸鹽還原能力（Soda et al.，2006）。

微生物介導的異化As(Ⅴ)還原可直接影響砷在稻田土壤中的移動性，并影響As與碳（C）、氮（N）、鐵（Fe）、硫（S）等元素循環的耦合過程（Zhu et al.，2017）。淹水稻田中有效態砷濃度升高，一方面由于異化砷還原微生物將吸附在氧化鐵礦物上的As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)導致土壤溶液中的砷濃度升高；另一方面與異化鐵還原菌（DIRB）驅動的鐵還原過程密切相關。異化鐵還原菌可將Fe(Ⅲ)氧化物還原成Fe(Ⅱ)，從而導致吸附在鐵氧化物上的As(Ⅴ)釋放到孔隙水中（Qiao et al.，2018）。例如，Wang et al.（2016）利用ShewanellaoneidensisMR-1和ShewanellaoneidensisMR-4兩株典型的DIRB菌，研究它們對砷還原釋放的影響，研究發現在這兩種菌存在條件下，砷可快速的從氧化鐵礦物上釋放。厭氧條件下將乳酸加入富含鐵還原微生物的沉積物中，在第1天內As(Ⅴ)開始還原且在第2天就到達高峰。因此，厭氧環境下（如淹水稻田），吸附在鐵氧化物上的As(Ⅴ)可以被異化鐵還原過程釋放（Ko et al.，2019）。

除了上述異化砷還原微生物，水稻土中已有很多與arsC基因相關的砷還原微生物被鑒定出。2015年，Zhang et al.（2015）在全國范圍內采集了13個砷污染的水稻土，利用T-RFLP和克隆文庫方法研究水稻土中參與砷轉化的微生物，研究發現細胞質砷還原微生物主要屬于變形菌門包括Hoeflea、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Polymorphum、Enterobacter等微生物，而arrA基因相關的微生物主要為Geobacteruraniireducens，且arrA基因豐度明顯低于arsC基因。這可能是因為arrA基因只存在厭氧微生物中，而arsC基因則可以存在厭氧或好氧微生物中。

2.2 砷氧化

環境中微生物砷氧化是影響砷遷移轉化的重要因素。通常認為As(Ⅲ)比As(Ⅴ)移動性更強，毒性更大（Zhang et al.，2022）。微生物氧化As(Ⅲ)由AioA和AioB亞基組成的As(Ⅲ)氧化酶催化（Zhang et al.，2017；Li et al.，2019）。除此之外，學者還發現亞砷酸鹽氧化酶ArxA能催化As(Ⅲ)氧化與硝酸鹽還原耦合 （Zhang et al.，2015）。驅動砷氧化的微生物包括化能自養型和異養型?；茏责B型砷氧化微生物能利用氧氣（有氧條件下）或硝酸鹽（厭氧條件下）等作為電子受體將As(Ⅲ)氧化并為自身提供能量（Slyemi et al.，2012）。異養型砷氧化被認為是一種細胞解毒的機制，不能為自身供能（Muller et al.，2003）。

在稻田土壤中，砷氧化微生物被廣泛研究。在非淹水條件下，空氣進入土壤形成有氧條件，此時Fe(Ⅱ)與As(Ⅲ)會被生物或非生物氧化；在淹水條件下，As(Ⅲ)會在特定條件下被微生物氧化，添加硝酸鹽可激活一些砷氧化微生物氧化Fe(Ⅱ)或As(Ⅲ)（Lin et al.，2018）。2015年，Zhang et al.（2015）在砷污染水稻土中分離出一株自養型砷氧化菌Paracoccussp.SY，該菌株在厭氧條件下，利用硝酸鹽作為電子受體，將As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)，且在好氧與厭氧條件下都具有氧化亞砷酸鹽功能。該研究對降低稻田砷的移動性及水稻生長過程中砷積累具有重要意義。Lin et al.（2018）在淹水條件下向砷污染稻田土壤中加入不同濃度硝酸鹽，硝酸鹽的添加促進了孔隙水中As(Ⅲ)氧化，As(Ⅴ)濃度也隨之升高，且高濃度硝酸鹽處理組As(Ⅲ)氧化酶基因aioA的豐度增加了1.6－4.2倍。除上述淹水水稻土中的砷氧化微生物，許多根際微生物例如Rhizobiales和Burkholderials等均能在好氧和厭氧條件下驅動土壤中的砷氧化（Zhang et al.，2015）。

2.3 砷甲基化

稻田土壤砷的形態轉化除As(Ⅴ)還原和As(Ⅲ)氧化外，還包括無機砷轉化為有機砷。有機砷主要包括一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）和三甲基胂氧化物（TMAO）（Zhu et al.，2017）。砷甲基化被認為是一種解毒過程，土壤微生物砷甲基化由亞砷酸鹽甲基轉移酶（arsM）催化（Zhao et al.，2013）。在淹水稻田中砷甲基化很容易發生，并容易產生氣態砷揮發到大氣中（Mestrot et al.，2011）。

砷甲基化基因（arsM）廣泛分布在稻田土壤微生物中，并與甲基砷濃度成正相關（Wang et al.，2018）。2020年，Hashmi et al.（2020）采集了15個水稻土樣品研究土壤中砷形態及濃度水平、砷代謝基因及其與土壤理化性質的相關性。研究發現，15個水稻土中不同砷形態及arsM基因豐度具有顯著差異，且總砷濃度與arsM基因豐度呈顯著負相關。水稻土中參與砷甲基化的微生物種類多樣，比如Proteobacteria、Gemmatimonadales和Firmicutes等水稻根際微生物（Zhang et al.，2015）以及Desulfovibrio、Terrisporobacter和Clostridium等厭氧內生菌（Chen et al.，2022）。2015年，Wang et al.（2015）從水稻土中分離出一株硫酸鹽還原菌Clostridiumsp.BXM，該菌株普遍存在于厭氧水稻土中，具有砷甲基化能力。2016年，Huang et al.（2016）在水稻土中分離出一株Cytophagaceae科的菌株SM-1，其在稻田土壤中含量豐富，具有砷甲基化和砷揮發能力，接種該菌株可顯著促進土壤中砷甲基化及砷揮發。SM-1菌株的發現對于砷污染土壤生物修復具有重要意義。

稻田土壤砷甲基化過程受土壤理化性質等多種因素影響，如pH、DOC等。2013年，Zhao et al.（2013）在6個不同采樣點采集6個不同的水稻土，研究稻田土壤淹水條件下，砷甲基化過程的影響因子。研究發現arsM基因豐度與土壤pH正相關，土壤孔隙水中甲基砷與pH和arsM基因豐度負相關，與溶解性有機碳正相關。因此，相比arsM基因豐度，可顯著影響砷甲基化微生物活性的土壤條件比如pH、溶解性有機碳等對土壤砷甲基化過程影響更大。已有研究表明，水稻土中硫酸鹽還原菌及 產甲烷古菌分別參與了砷甲基化及脫甲基化過程，并共同控制土壤中甲基砷的動態變化（Chen et al.，2019）。

2.4 脫甲基化

稻田土壤微生物介導砷甲基化以生成一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）為主，土壤中部分微生物比如產甲烷古菌也能將甲基砷進行脫甲基化（Chen et al.，2019）。2011年，Yoshinaga et al.（2011）采集MAs(Ⅴ)污染的高爾夫球場土壤研究了MAs(Ⅴ)脫甲基化，研究發現MAs(Ⅴ)脫甲基化過程首先由Burkhoderia菌將MAs(Ⅴ)還原成MAs(Ⅲ)，然后由Streptomyces將MAs(Ⅲ)脫甲基化成As(Ⅲ)，這是首次報道甲基砷的脫甲基過程。

淹水稻田中，MMA與DMA也可被脫甲基。向水稻土中外源加入二甲基砷并在厭氧條件下淹水培養，研究砷甲基化與脫甲基化的主要功能微生物。隨著甲烷的生成，孔隙水中DMAs迅速降低，研究發現硫酸鹽還原菌與產甲烷菌分別參與了砷的甲基化與脫甲基過程（Chen et al.，2019）。Chen et al.（2021）從土壤中分離出一株厭氧菌Bacillussp.CZDM1。該菌基因組中含有C-As裂解酶基因arsI，在厭氧硝酸鹽還原條件下具有MMAs(Ⅲ)脫甲基化功能。據研究，C-As裂解酶基因BcarsI在反硝化細菌中普遍存在，可實現MMAs(Ⅲ)的脫甲基化與反硝化過程的耦合，且該耦合過程在稻田土壤十分常見。除此之外，一些好氧內生菌也能將MMAs(Ⅲ)脫甲基化（Chen et al.，2022），可見，在復雜的稻田土壤環境中，砷脫甲基化的過程并不依賴于某個單一的物種，而是存在多種微生物共同參與。

3 稻田土壤氮循環過程對砷形態轉化的影響

在土壤環境中，鐵（Fe）、碳（C）、氮（N）循環對砷的形態轉化均具有重要影響。例如，淹水稻田中微生物驅動的硝酸鹽還原耦合As(Ⅲ)的氧化可固定砷（Lin et al.，2018）；NH4+與Fe(Ⅲ)共存的稻田土壤中可發生Feammox反應，從而提高砷的移動性（Ding et al.，2014；Zhang et al.，2021）。如圖3所示，稻田氮循環耦合砷形態的轉化在砷的生物地球化學循環中發揮著重要作用，解析氮、砷耦合機制可為土壤砷污染控制提供科學依據。

圖3 稻田土壤中氮砷耦合過程Figure 3 The coupling process of nitrogen and arsenic in paddy soil

3.1 硝化過程

稻田土壤具有干濕交替的周期性變化特征，其中氮循環過程與砷形態轉化存相互耦合。氮循環通過參與鐵氧化物和溶解Fe(Ⅱ)之間的動態轉化，可以影響土壤中As的富集（Smith et al.，2017）。在有氧條件下，稻田土壤硝化作用產生NO3-（Devkota et al.，2013；Verhoeven et al.，2018），NO3-可抑制土壤中氧化鐵礦物的還原溶解，從而減緩砷的釋放（Liu et al.，2019）。Weng et al.（2017）采集了砷污染的淺層地下水，利用穩定同位素技術發現含氧地下水中砷的遷移轉化與氮循環中的硝化作用密切相關。在含氧的近端水層中硝化作用提高了NO3-濃度，高濃度的NO3-降低了含氧地下水中砷的移動性。因此，稻田土壤中硝化作用有利于砷吸附在氧化鐵礦物上，從而降低砷的移動性（Zhu et al.，2017；Wang et al.，2019）。此外，不同酸、堿性及好、厭氧條件的稻田土壤中，硝化微生物活性與豐度具有顯著差異。弱堿性稻田土壤中AOA活性明顯優于AOB，而AOB在中性和酸性土壤中活性更高（Zhang et al.，2019）。綜合以上研究可知，一方面，在砷污染的環境下硝化作用會直接與砷耦合影響砷的遷移轉化。另一方面，砷污染稻田土壤淹水和落干的周期性變化造成土壤pH、Eh等理化性質的變化，會影響土壤硝化微生物驅動的硝化反應過程，從而間接影響吸附在氧化鐵礦物上砷的還原釋放。也會對硝化作用和砷形態轉化的耦合產生間接影響。

3.2 反硝化過程

已有研究表明，厭氧環境中亞砷酸鹽氧化與硝酸鹽還原過程耦合可降低砷的移動性（Zhang et al.，2015；Zhang et al.，2017）。Senn et al.（2002）報道硝酸鹽可以在厭氧條件下通過微生物可以對As(Ⅲ)進行氧化。硝酸鹽耗盡情況下，一般有As(Ⅲ)存在；但硝酸鹽豐富且厭氧情況下，As(Ⅴ)則為主要產物。Oremland et al.（2002）研究發現，一些依賴硝酸鹽的氧化細菌（如MLHE-1等）能將As(Ⅲ)氧化與部分反硝化相耦合。而Rhine團隊（Rhine et al.，2006）則分離了兩種自養As(Ⅲ)氧化菌株DAO1和DAO10，發現其能夠將As(Ⅲ)氧化與完全反硝化相耦合的同時來固定二氧化碳。Zhang et al.（2015）在砷污染水稻土中分離出一株化學自養型砷氧化菌SY，該菌株可以在好/厭氧條件下分別以氧氣或硝酸鹽為電子受體氧化三價砷，并從中獲取能量。在淹水土壤中接種該菌株，可顯著促進三價砷的氧化過程。Li et al.（2019）采集未污染的水稻土，在厭氧條件下添加As(Ⅲ)及NO3-進行微宇宙實驗。研究發現，添加了NO3-后，As(Ⅲ)氧化速率顯著升高，宏基因組分析發現硝酸鹽還原菌主要為Pseudogulbenkiania，砷氧化菌主要為Azoarcus spp.。該研究表明硝酸鹽還原菌和砷氧化菌共同驅動硝酸鹽還原耦合砷氧化過程。

此外，最近的研究發現，反硝化作用也可耦合MAs(Ⅲ)脫甲基化。Chen et al.（2021）分離出反硝化細菌Bacillussp.CZDM1，能夠在厭氧條件下將MAs(Ⅲ)脫甲基化。因此，反硝化作用在砷污染土壤中對砷的遷移轉化也具有重要影響，對以上耦合過程的主要影響因子還有待進一步研究。除以上微生物因素，在砷污染稻田中不同土壤理化條件也可影響反硝化速率，從而影響砷的固定釋放。Liang et al.（2021）研究發現，反硝化微生物活性受氣候因子、土壤pH和nirS基因生物多樣性影響，且反硝化基因nirS和nirK豐度與土壤碳/氮比成顯著負相關。綜上所述，砷污染的稻田中，反硝化作用不僅可直接耦合砷轉化，還可以通過土壤的碳/氮比等理化條件影響反硝化微生物的豐度和活性，從而間接將反硝化作用與砷進行耦合。

3.3 厭氧氨氧化過程

最近的研究發現厭氧氨氧化可以與As(Ⅴ)還原過程耦合。Zhang et al.（2022）采集砷污染的稻田土壤，外源加入15N-尿素及As(Ⅴ)厭氧培養，研究發現同時加入15N-尿素和As(Ⅴ)可顯著提高砷還原基因arrA及厭氧氨氧化基因hzsB的豐度。穩定同位素示蹤技術和高通量測序技術進一步揭示水稻土中驅動厭氧氨氧化與砷還原耦合的關鍵微生物主要包括Halomonas，Pelagibacterium和Chelativorans。研究還發現，水稻土中還同時存在傳統厭氧氨氧化過程，Ca.Brocadia是水稻土中優勢的厭氧氨氧化菌。該研究拓展了稻田土壤中氮砷循環耦合過程的認識。此外，與之前描述的過程類似，土壤pH、有機碳等土壤理化性質均可影響厭氧氨氧化活性（Shan et al.，2018）。其厭氧氨氧化主要發生在NO3-或NO2-與NH4+共存的還原環境中，在高濃度的NO3-或NO2-條件下，Fe(Ⅱ)易被氧化為鐵氧化物，從而吸附固定砷，降低砷的移動性。目前在稻田砷污染環境中，厭氧氨氧化耦合砷轉化過程的研究報道較少，需要進一步關注該過程。

3.4 鐵氨氧化過程

稻田土壤通常施加銨態氮肥作為農用氮肥。厭氧條件下，Feammox過程可促進氧化鐵還原溶解從而導致吸附態砷釋放（Xue et al.，2020；Chen et al.，2023），因此，Feammox過程在砷污染的環境中能夠提高砷移動性。Weng et al.（2017）基于氮、氧、氫同位素及氮、鐵、砷形態與價態分析，研究了臺灣濁水溪沖積扇砷污染地下水中氮素轉化過程及其對砷移動性的影響。研究發現，Feammox反應促進鐵還原釋放砷可能是造成扇央區地下水中高濃度砷的主要原因。Chen et al.（2023）基于大田試驗研究了施加不同形態氮肥對稻田土壤中砷移動性與有效性的影響。研究發現施加銨態氮降低土壤Eh，有利于促進含砷的氧化鐵礦物還原溶解釋放砷。厭氧條件下，氨氧化可耦合砷還原過程，促進As(Ⅴ)被還原為移動性較強的As(Ⅲ)；此外，厭氧氨氧化可耦合鐵還原過程，促進砷從氧化鐵礦物上被釋放。

Huang et al.（2016）研究發現，土壤pH、Fe(Ⅲ)及NH4+是影響Feammox反應活性的關鍵環境因子且Feammox反應更易發生在低溶解氧或者缺氧條件下。最近的研究發現秸稈和銨態氮共施條件下有利于砷的固定（Liu et al.，2022）。其原因主要有兩方面：一是外源加入秸稈可提高土壤中溶解性有機質（DOM）含量，DOM的增加使得Feammox反應微生物更易以DOM而不是Fe(Ⅲ)為電子受體。因此，DOM的增加抑制了Feammox反應，從而不利于吸附態砷的還原釋放；二是施加的銨態氮水解降低土壤pH，增加了鐵氧化物表面的正電荷從而更易于吸附固定砷。由此可見，Feammox反應受多種環境因子的影響，可以通過調控Feammox反應過程來影響砷的移動性與有效性。

3.5 硝酸鹽異化還原成銨

厭氧條件下，DNRA過程普遍存在于水稻土中，特別在硝酸鹽濃度較低、DOC濃度高的稻田土壤中更容易發生DNRA過程（Robertson et al.，2016），該過程提升了稻田肥力，有利于水稻植株的生長。但另一方面，在這樣的環境中能夠促進砷從鐵氧化物上解吸導致孔隙水中游離態的砷濃度升高。學者（Jiang et al.，2022）從河套平原高砷地下水中分離出一株異化硝酸鹽還原菌Citrobactersp.G-C1，該菌可在DNRA過程中同時還原As(Ⅴ)，且該菌也具有有機砷脫甲基化功能。以上結果表明，DNRA可與砷還原過程耦合從而提高砷的移動性。

已有研究表明DNRA與（Cheng et al.，2022）稻田土壤中砷相耦合的同時，也受土壤pH、有機碳及總氮等理化性質影響（Liu et al.，2022；Yang et al.，2022），但目前關于DNRA與砷轉化的耦合過程研究還比較少，有待進一步研究探討。

4 結論與展望

4.1 結論

（1）水稻生產施用大量的尿素或銨態氮，稻田氮素循環為土壤生態系統元素循環的核心過程之一。砷污染的稻田土壤中銨態氮與砷共存是普遍的現象。氮循環可以顯著影響土壤中砷的形態轉化過程，從而影響其移動性與生物有效性。

（2）稻田土壤中氮的循環過程可以與砷形態轉化的多個過程耦合從而對砷的移動性造成不同影響。其中，硝化和反硝化作用有利于砷的吸附固定；而厭氧氨氧化、鐵氨氧化及硝酸鹽異化還原成銨可促進砷的還原釋放。此外，反硝化作用也可以耦合砷脫甲基化過程，從而提高砷毒性。

4.2 展望

綜上所述，氮循環與水稻土砷的形態轉化密切相關。在砷污染的稻田土壤中，氮循環耦合砷轉化的過程也逐步被發現，并得到深入研究?；诒疚牡木C述，筆者認為以下3個方面可作為今后研究的重點：

（1）稻田土壤具有干濕交替特征，在不同的水分條件下，土壤中pH、Eh等差異明顯，且不同的土壤深度氧氣含量也有差異。如何區分不同的水分條件和不同土壤深度下硝化、反硝化、厭氧氨氧化、鐵氨氧化，以及硝酸鹽異化還原成銨等氮循環過程；不同氧化還原條件下，驅動氮循環耦合砷轉化的關鍵功能微生物和影響這些耦合過程的關鍵環境因子，以及這些耦合過程對砷移動性的貢獻等，是需要重點關注的科學問題。

（2）鐵氧化物在稻田土壤中含量豐富，鐵循環在砷的遷移轉化過程中發揮著重要作用。Feammox反應可促進鐵氧化物的還原溶解并提高砷的移動性，但目前驅動該過程的功能微生物仍有待進一步挖掘。Feammox反應在砷污染稻田土壤中對砷移動性的貢獻有多大也仍然不清楚。

（3）已知有機砷毒性小于無機砷，促進砷甲基化過程一定程度上可以降低稻米中無機砷的積累，從而降低人們食用稻米的風險。氮循環耦合砷甲基化或脫甲基化的研究還處于起步階段，特別是如何調控氮循環耦合砷轉化過程以實現降低稻米中總砷含量及無機砷的比例，有待進一步探討。

（4）雖然目前已發現氮循環的多個過程可以與砷轉化耦合，但其耦合機理仍有待進一步研究。特別是影響這些耦合過程的關鍵環境因子不明確，這些耦合過程對稻田土壤砷移動性的貢獻程度不清晰，以及如何通過對這些耦合過程的定向調控實現對砷的固定，有待進一步研究。