北京動物園圈養野生動物病原菌分布及耐藥性分析

劉燕，詹同彤，胡昕，盧巖，郝菲兒，由玉巖，崔多英，劉赫，滑榮，張成林

（北京動物園管理處，圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京 100044）

病原菌一直是威脅圈養條件下野生動物健康的重要因素之一（張成林等，2013；侯超鵬，2019）?？股貙θ︷B動物病原細菌感染治療可以起到良好的效果，但是條件性致病細菌的感染仍時有發生。在圈養條件下，不同種類野生動物間以及野生動物與人類包括游人和飼養員等近距離接觸機會大幅增加，人畜共患病原菌和耐藥菌在動物間以及人與動物間傳播的風險也隨之增加（秦春娥等，2007），對動物和人類健康都會造成一定威脅，增加公共衛生風險（張勁碩等，2003）。因此，對圈養條件下動物感染的病原菌分離、監測非常重要。

北京動物園飼養展示珍稀野生動物約400 種5 000余只，發揮著國家動物園功能，平均每年接待游客量近千萬，在圈養野生動物疾病治療方面，多年來一直開展病死動物的病原菌分離鑒定和藥敏試驗，本文統計了2005—2016 年12 年北京動物園圈養的死亡和患病的537 只野生動物的細菌感染情況，并分析了病原菌的分布特點和抗藥性，以期為臨床細菌性疾病治療中的藥物選擇提供參考，避免抗生素濫用和耐藥菌株產生、傳播、流行，并為制定野生動物抗菌藥物應用策略、管理措施及評價干預手段等提供數據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

采集2005—2016 年北京動物園死亡和患病的168 種537 只圈養野生動物的935 份樣本，包括哺乳動物99 種365 只、鳥類54 種143 只和兩棲爬行類15 種29 只，其中，死亡動物424 只803 份樣本，患病動物113 只132 份樣本。死亡動物根據呼吸系統、消化系統等死亡原因取肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、腸道內容物等病變臟器組織；患病動物根據具體病情采集包括膿液、鼻腔分泌物、咽拭子等樣本。所有死亡動物均在死亡5 h 內進行剖檢采樣，盡量減少雜菌污染。病變臟器采集采用75%乙醇溶液擦拭臟器表面后用無菌剪刀剪取3 cm×3 cm 組織，膿液采集使用無菌注射器抽取液體，鼻腔分泌物和咽喉、扁桃體采用無菌棉簽蘸取分泌物，放入無菌袋，立即4 ℃送檢。

1.2 試劑與培養基

MH 培養瓊脂、麥康凱培養瓊脂和普通營養培養瓊脂（青島海博生物技術有限公司）、10%脫纖維羊血營養瓊脂（自制）、API 鑒定試劑條（法國生物梅里埃股份有限公司）、藥敏片（北京天壇藥物生物技術開發公司）等。

1.3 病原菌分離鑒定方法

將臟器樣本置于超凈工作臺，75%乙醇溶液擦拭消毒表面，用無菌剪刀剪去樣本表面組織后，用無菌接種針蘸取組織涂抹接種于10%脫纖維羊血營養瓊脂、MH 等培養基中，37 ℃培養。玻片革蘭氏染色后鏡檢。將鏡檢疑似為鏈球菌屬Streptococcus感染樣本置于CO2培養箱中培養，疑似魏氏梭菌Clostridium welchii感染樣本置于厭氧環境培養。培養24～48 h。分離菌株接種于血液瓊脂上培養，直至純化。將純化好的菌株接種于相關生化反應管或API鑒定試劑條，進行菌株鑒定。綜合鏡檢和培養結果綜合判定樣本中是否存在病原菌。

1.4 藥物敏感試驗

將獲得的大腸桿菌Escherichia coli、葡萄球菌屬Staphylococcus、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae和奇異變形桿菌Proteus mirabilis按北京動物園臨床治療常用的部分抗生素（頭孢克肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、青霉素、磺胺）進行藥敏試驗。采用K-B紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗：用無菌棉簽蘸取待測菌的血清肉湯培養物，均勻涂布于10 cm 鮮血平板，待稍干后，用無菌鑷子將藥敏紙片分別平貼在培養基表面，4 ℃ 2 h 使藥物擴散，然后37 ℃培養24 h，按照NCCLS（1999）標準判斷藥物敏感結果。使用大腸桿菌ATCC 25922菌株進行質控。

2 結果與分析

2.1 不同種類動物病原菌分離情況

307 只動物樣本檢出病原菌，檢出率57.17%，其中，哺乳動物56.16%，鳥類61.52%，兩棲爬行動物48.27%。

2.2 不同病變臟器病原菌分離情況

病原菌檢出樣本共515份，占55.08%，其中，肝臟、肺臟的樣本比例較高，分別為31.33% 和22.46%；從標本病原菌檢出率來看，肺臟（62.38%）最高，并高于肝臟（43.69%）（表1）。

表1 2005—2016年北京動物園圈養野生動物病/死動物的樣本種類、數量和病原菌檢出率Table 1 Sample type，number and detection rate of bacterial pathogens from captive sick/dead animalsin Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.3 病原菌分布

935份樣本共分離到580株細菌，其中，革蘭氏陰性菌372 株，占64.14%，主要是腸桿菌科Enterobacteriaceae；革蘭氏陽性菌208 株，占35.86%（表2），主要是鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬Clostridium和葡萄球菌屬。條件性致病菌占絕大多數，包括大腸桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa和魏氏梭菌等。

表2 2005—2016年北京動物園圈養野生動物病/死動物病原菌信息Table 2 Pathogenic bacteria of captive sick/dead animals in Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.4 耐藥性分析

藥敏試驗結果顯示（表3），4 種菌株對磺胺耐藥性最高（44.44%～78.57%），其次是對青霉素的耐藥性（25.00%～50.00%）。其他耐藥性較高的還有：葡萄球菌屬對頭孢克肟的耐藥性達到44.44%，大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸的耐藥性達到36.36%。

表3 4種主要病原菌對抗生素的耐藥結果Table 3 Drug resistance result of four kinds of pathogenic bacteria

3 討論

本文總結了2005—2016 年北京動物園患病和死亡動物的病原菌檢出率和耐藥情況，在待檢樣本數量上，哺乳動物數量較多，鳥類較少，兩棲爬行類最少?？偛≡鷻z出率為57.17%，略低于杭州動物園的65.19%（黃淑芳等，2017）?？傮w反映出細菌性感染疾病是北京動物園圈養野生動物發病和死亡的重要原因。

從病原菌分離的臟器類型來看，肺臟最高，說明呼吸道發生細菌性感染疾病幾率較高，這與尹秀云等（2014）的研究結果一致。從致病細菌類型來看，條件性致病菌占多數，如大腸桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌和魏氏梭菌等。其中，61.52%鳥類樣本檢出的致病菌80%以上是大腸桿菌，說明圈養條件下，鳥類應重點預防大腸桿菌的感染?？梢酝ㄟ^提供最適營養配比的飼料、提高圈養環境條件、減少應激反應等提升動物福利，最大限度減少致病菌大腸桿菌感染的幾率，保障圈養鳥類健康。

580 株菌株中，最多的革蘭氏陰性菌是腸桿菌科，而占比較高的是鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，其中，魏氏梭菌的分離率達到9.14%。從藥敏試驗結果看，大腸桿菌對磺胺、青霉素的耐藥性高達44.44%～78.57%，與已有報道（周萬蓉，2007；黃淑芳等，2011；劉青等，2020）相比，低于家畜源，而高于野生動物源（梁冰等，2020；李運莉等，2022；王東陽等，2022）。葡萄球菌對8 種抗生素普遍具有一定的耐藥性，但對諾氟沙星、慶大霉素較敏感，與已有研究結果（馬小萍等，2016；張志忠等，2017；王光鋒，李航，2020；吳勝等，2020）基本相同。肺炎克雷伯氏菌菌株對磺胺、青霉素等耐藥率非常高，對頭孢曲松、阿莫西林等較敏感，與此前報道的梅花鹿Cervus nippon源和東非黑白疣猴Colobus guereza源肺炎克雷伯氏菌對阿莫西林普遍耐藥（王艷君等，2018a；張召興等，2019；郭蕊等，2021；王煒強等，2022；燕霞等，2022）有一定差異。奇異變形桿菌菌株對8 種抗生素普遍較敏感，但對磺胺耐藥，與已有研究結果（龐卓等，2010；王麗萍等，2016；王艷君等，2018b；朱洪軍等，2019）較為一致。

綜上所述，圈養條件下細菌性疾病治療應根據藥敏結果選用窄譜抗生素，避免耐藥菌株的出現。針對病原菌株進行藥敏試驗非常必要，能反映圈養野生動物源致病菌的抗生素耐藥情況，指導臨床用藥，可以避免耐藥菌株甚至超級菌的出現，減少人畜共患病發生的幾率。