香葉木素抑制多酚氧化酶的分子機制

洪鑫月,張國文

(南昌大學食品科學資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌 330047)

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO),也被稱為酪氨酸酶,廣泛存在于蔬菜、水果和許多其他生物體中[1]。如圖1A所示,多酚氧化酶通常以四聚體形式存在[2]。作為一種金屬氧化酶,其雙核銅活性中心的兩個銅離子分別與3個組氨酸配位(圖1B)[3]。PPO催化氧化酚類物質形成黑色素:在氧分子存在下,PPO將單酚鄰羥基化,隨后將鄰二酚氧化為多巴醌,并最終形成黑色素,這個過程通常伴隨著體系顏色的加深[4]。在食品工業中,由PPO導致的褐變會降低食品的營養價值,不良的顏色變化也使消費者難以接受,使食品喪失其商業價值,造成巨大的經濟損失[5]。目前,人們對典型的PPO抑制劑如對苯二酚、熊果苷和曲酸等使用的安全性仍存在一些爭論[6]。因此,從天然產物中發掘高效、安全的PPO抑制劑已成為食品和醫藥領域的研究熱點之一。

圖1 (A) 四聚體形式的多酚氧化酶;(B) 多酚氧化酶的雙核銅活性中心Fig.1 (A) PPO in the form of tetramer;(B) The binuclear copper active center of PPO

香葉木素(Diosmetin)是一種常見于各種柑橘類果實中的膳食黃酮,具有抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多重生物活性[7,8],其作為酶抑制劑也有較大潛力。Liu等[9]報道香葉木素以可逆競爭的方式抑制黃嘌呤氧化酶的活性,抑制機制可能是香葉木素能夠與酶結合并改變酶的構象從而降低酶的催化活性。同時,許多黃酮類化合物已被證實具有PPO抑制能力。桑色素[10]和槲皮素[11]是可逆競爭型的PPO抑制劑,二氫楊梅素[12]和芹菜素[13]對PPO表現出較強的混合型抑制活性,柚皮素是一種非競爭型PPO抑制劑[14]。Si等[15]運用分子模擬發現橙皮素可以螯合活性中心的銅離子并推測這可能是其具有抑制活性的原因之一。Jeong等[16]報道黃芩苷可能通過控制細胞中酪氨酸酶的含量從而抑制黑色素的合成。然而,有關香葉木素對PPO的抑制效果及抑制機制的研究卻十分有限。因此,本文運用多種光譜學方法聯合計算機模擬技術,系統研究了香葉木素對PPO的抑制作用及機制,以期為香葉木素作為新型PPO抑制劑的應用提供實驗依據和理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(UV-2450型,島津公司,日本);熒光分光光度計(F-7000型,日立公司,日本);圓二光譜儀(MOS-450型,Bio-Logic公司,法國);電子天平(BSA224S型,Sartorius公司,德國);酸度計(pHS-3C型,雷磁公司,上海);恒溫水浴鍋(HH-6型,上海騰林)。

PPO(EC 1.14.18.1,128 kDa,Worthington公司,美國);香葉木素(純度≥98%)和左旋多巴(純度≥98%)均購自阿拉丁生化科技有限公司(中國上海);曲酸(純度≥99%)購自奧德福尼生物技術有限公司(中國南京)。用DMSO配制香葉木素溶液(40.0 mmol·L-1);PPO儲備液(20.0 μmol·L-1)和左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)用PBS(50.0 mmol·L-1,pH 6.8)配制,底物現用現配。其他藥品試劑的純度均為分析純,實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 香葉木素對PPO的抑制活性測定

采用Li等[17]的方法,對香葉木素的抑制能力進行測定。在總體積為2 mL的PBS(50.0 mmol·L-1,pH 6.8)反應體系中,分別加入20 μL PPO儲備液(20.0 μmol·L-1)和不同體積(2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 μL)的香葉木素(40.0 mmol·L-1),置于30℃水浴中孵化1 h。隨后加入200 μL左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開啟反應。使用紫外-可見分光光度計中的時間-動力學程序,每5 s測定一次475 nm處的吸光度,測定41次,共200 s。使用相對酶活來表示樣品的抑制能力。不加抑制劑時PPO的活性定義為100%。陽性對照為曲酸。

相對酶活性(100%)=(K1/K0)×100%

(1)

K0和K1分別表示未加入和加入抑制劑后反應體系的吸光度隨時間變化的斜率。

1.2.2 香葉木素對PPO的抑制動力學

抑制可逆性的測定:在不同濃度(0、200、400、700 μmol·L-1)的香葉木素存在下,加入不同體積(10、15、20、25、30 μL)的PPO儲備液(20.0 μmol·L-1),于30 ℃水浴中孵化1 h后加入200 μL左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開啟反應。吸光度的測定同1.2.1。以酶促反應速率(v=ΔOD/min)對酶濃度作圖,根據曲線特性判定香葉木素的抑制可逆性。

抑制類型的判斷:在不同濃度(0、200、400、700 μmol·L-1)的香葉木素存在下,加入20 μL的PPO溶液(20.0 μmol·L-1),于30 ℃水浴中孵化1 h后加入不同體積(100、150、200、250、300 μL)的左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開啟反應。吸光度的測定同1.2.1。以酶促反應速率(v=ΔOD/min)對底物濃度作圖并結合Lineweaver-Burk雙倒數方程對香葉木素的抑制類型進行判斷。

1.2.3 熒光光譜法

熒光猝滅實驗:不同溫度(298、301、310 K)下,在2 mL PPO溶液(2.0 μmol·L-1)中,逐次加入5 μL的香葉木素(1.0 mmol·L-1),共10次。每次加入香葉木素,溶液需混勻并靜置3 min,然后掃描290～500 nm范圍內的熒光發射光譜。激發波長280 nm,狹縫寬度2.5 nm。

同步熒光實驗:將激發波長和發射波長始終保持在15 nm(60 nm)的差值條件下,掃描酪氨酸(或色氨酸)的同步熒光光譜,分析香葉木素的加入對PPO中這兩種氨基酸殘基的影響。在298 K,發射波長掃描范圍為200～400 nm,其他實驗條件同熒光猝滅實驗。

三維熒光實驗:在2 mL實驗體系中,PPO和香葉木素濃度分別為2.0 μmol·L-1和15.0 μmol·L-1,分別掃描PPO和香葉木素-PPO體系的三維熒光光譜。激發波長和發射波長的掃描范圍均為200～600 nm,步長為5 nm。Matlab軟件繪制三維熒光圖。

香葉木素的紫外吸收可能會產生“內濾光效應”,因此,實驗測得的熒光數據用下式進行校正[18]:

(2)

FM和FC分別是熒光的測量值和校正值。A1和A2分別是香葉木素在280和340 nm處的紫外吸收值。

1.2.4 CD光譜法

掃描不同反應體系(c香葉木素:c多酚氧化酶=0：1、1：1和4：1)的CD光譜,掃描范圍設置為190～250 nm。CD光譜儀在室溫下運行,氮氣流保持在5 MPa左右。掃描光譜時應扣除背景吸收(PBS,50.0 mmol·L-1,pH 6.8)。利用SELCON3程序對數據進行處理后獲得多酚氧化酶各二級結構的含量。

1.2.5 分子對接及分子動力學模擬

應用分子對接軟件(Discovery Studio 2016 v16.1.0)預測香葉木素與PPO的結合位點。PPO(PDB ID:2Y9X)的晶體結構來自RCSB PDB蛋白質數據庫,香葉木素的3D結構(Compound CID:5281612)來自PubChem數據庫。PPO進行預處理(去水,加氫,加極性)后被定義為受體,與配體香葉木素進行100次的分子對接模擬。選取最優構象(最低的CDOCKER結合能和最低的CDOCKER相互作用能量)進行結果分析[19]。

使用GROMACS 5.1軟件進行分子動力學模擬,采用Acpype Server程序對香葉木素的拓撲文件進行預處理。香葉木素與PPO分別使用AMBER和AMBER99SB-ILDN protein力場。加入Na+和Cl-中和電荷后進行能量最小化操作,隨后在300 K溫度下分別進行100 ps的NVT和NPT平衡。分子動力學模擬時間為150 ns[20]。

2 結果與討論

2.1 香葉木素對PPO的抑制作用分析

圖2A顯示香葉木素和曲酸均具有PPO抑制能力,隨著體系內二者濃度的增加,PPO的相對酶活性不斷下降。香葉木素的濃度從50.0 μmol·L-1增加至1 000.0 μmol·L-1時,PPO的相對活性從85.24%降至21.5%,而50.0 μmol·L-1的曲酸使PPO的活性降低至27.50%。香葉木素和曲酸的IC50值分別為(302.9±1.82) μmol·L-1和(15.0±0.24) μmol·L-1,盡管香葉木素對PPO的抑制活性要弱于經典抑制劑曲酸,但也顯示出較好的PPO抑制能力。

圖2B顯示,在不同濃度的香葉木素體系中,PPO濃度與酶促反應速率的擬合直線都經過原點,且香葉木素濃度增大,擬合直線斜率下降。以上結果表明香葉木素可逆地抑制PPO的催化活性,而不是使酶完全失活[21]。

利用雙倒數曲線判斷香葉木素對PPO的抑制類型。圖3A中四條擬合直線均有良好的線性關系且相交于第二象限。香葉木素濃度增加,Km值增加而Vmax值減小。由此判斷香葉木素為PPO的混合型抑制劑。下列公式通常用以描述混合型抑制[22]:

(3)

(4)

(5)

計算得到抑制常數Ki為327.9±2.46 μmol·L-1,表觀系數α為2.78,α>1意味著香葉木素與單獨PPO的結合親和力強于香葉木素與PPO-底物復合物的結合,即香葉木素更傾向于與游離酶結合[3,12]。圖3B和C中斜率和截距分別對香葉木素濃度作圖,曲線均顯示出良好的線性關系,表明香葉木素在PPO上只有一個或一類抑制位點。

[Diosmetin]/(μmol·L-1) [PPO]/(μmol·L-1)

1/[L-DOPA/(μmol·L-1)] [Diosmetin]/(μmol·L-1) [Diosmetin]/(μmol·L-1)c(PPO)=0.2 μmol·L-1;c(diosmetin)=0、200、400、700 μmol·L-1 for curves a→d。

2.2 香葉木素對PPO熒光光譜的影響

2.2.1 熒光猝滅機制分析

當λex=280 nm時,由于PPO含有色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳香族氨基酸,其在340 nm處有一個特征熒光發射峰。圖4A中香葉木素的加入令酶的熒光強度從570.2下降至323.1,這意味著香葉木素能夠通過影響PPO中的Trp和Tyr殘基而猝滅PPO內源熒光。

香葉木素對PPO的猝滅方式可利用Stern-Volmer方程[23]進行描述:

(5)

F0、F分別表示PPO和PPO-香葉木素體系的熒光強度,[Q]為香葉木素濃度。計算得到的熒光猝滅常數Ksv和生物分子猝滅常數Kq均列與表1中。在未添加猝滅劑時,熒光團平均壽命τ0約為10-8s[11]。

圖4B所示,不同溫度下F0/F對[Q]作圖,三條擬合直線都表現出很好的線性關系。溫度升高,Ksv值增大,但Kq值遠大于2.0 1010L·mol-1·s-1,表明香葉木素對PPO的猝滅方式為單一的靜態猝滅[24]。

aR為Ksv的相關系數,bR為Ka的相關系數。

λ/nm >[Diosmetin]/(μmol·L-1)

2.2.2 結合常數和結合位點數

用下列方程求得不同溫度下香葉木素與PPO的結合常數Ka與結合位點數n[10]:

(6)

[Qt]和[Pt]分別是香葉木素和PPO的濃度。在實驗溫度(298、304和310 K)下,Ka值分別為1.20×104、1.80×104和2.28×104L·mol-1(表1),即香葉木素和PPO顯示出中等強度的結合親和力。溫度升高,Ka值增加,意味著PPO-香葉木素復合物的形成與溫度正相關。實驗溫度下的n值均接近1,表明PPO中僅存在一個或一類香葉木素的結合位點,這些結果與酶促動力學結論一致。

2.2.3 熱力學分析

通過van’t Hoff方程[3]計算香葉木素與PPO結合過程中的熱力學參數值,并列于表1:

(7)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(8)

R是氣體常數(8.314 J·mol-1·K-1)。吉布斯自由能(ΔG°)為負值,表明香葉木素與PPO是自發結合;熵變(ΔS°)和焓變(ΔH°)均為正值,表示疏水相互作用是二者結合的主要驅動力[25]。

2.3 香葉木素對PPO結構的影響

2.3.1 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜是檢測PPO中Tyr和Trp殘基微環境變化的常用手段。向PPO溶液中不斷加入香葉木素,Tyr和Trp殘基的熒光強度分別從108.8降至70.26,和435.4減少到233.2,二者的特征峰無顯著改變,表明香葉木素對這兩種氨基酸殘基微環境的極性和疏水性基本沒有影響(圖5A和B)[18]。圖5C所示,Trp殘基的同步熒光猝滅比率(RSFQ=1-F/F0)高于Tyr殘基,表明在香葉木素猝滅PPO時Trp殘基的貢獻更大。

2.3.2 三維熒光光譜分析

通過三維熒光光譜分析了PPO與香葉木素相互作用引起的構象變化。圖6A是PPO的三維熒光光譜。峰a(λex=λem)是瑞利散射峰,峰b(2λex=λem)是二階散射峰。峰1(λex=280 nm,λem=340 nm)為Tyr和Trp殘基的特征峰,峰2(λex=230 nm,λem=340 nm)主要反映多肽鏈骨架結構的熒光特征吸收峰。表2中,香葉木素的加入使得峰1的熒光強度下降28.87%,但不改變其峰位置,表明香葉木素幾乎不影響Tyr和Trp殘基的微環境,這與同步熒光結果一致。峰2的熒光強度降低了66.60%,且其峰位也發生變化,意味著香葉木素與PPO的相互作用影響了酶的結構[22]。

λ/nm λ/nm [Diosmetin]/(μmol·L-1)(A) Δλ=15 nm (B) Δλ=60 nm (C) 同步熒光猝滅百分比(RSFQ)

c(PPO)=2.0 μmol·L-1,c(diosmetin)=15.0 μmol·L-1。

表2 PPO和PPO-香葉木素體系的三維熒光光譜特征峰Tab.2 haracteristic peaks in 3D fluorescence spectra of PPO and PPO-diosmetin systems

2.3.3 圓二色譜分析

CD光譜對蛋白質二級結構的變化非常敏感,是檢測香葉木素對PPO構象影響的有力手段。210和220 nm處的兩個負峰被認為是α-螺旋結構的特征峰[18]。當香葉木素與PPO的濃度比增加時(0：1→1：1→4：1),圖7A中負峰強度增強峰形改變暗示著香葉木素與PPO的相互作用影響了酶的二級結構。PPO的α-螺旋含量增加(32.81%→36.00%→42.38%),β-折疊(19.11%→18.10%→13.82%)和無規則卷曲(27.28%→26.50%→23.78%)含量降低(圖7B),表明香葉木素可能誘導PPO的結構部分緊縮,使底物更難進入活性中心,從而降低了PPO的催化活性。

λ/nm The molar ratio of [diosmetin]vs.[PPO]

2.4 香葉木素與PPO的結合模式

2.4.1 分子對接

分子對接可以直觀地觀察香葉木素與PPO的結合,通過分析二者結合的優勢構象得到結合位點、結合方式和作用力類型等信息。結果顯示,香葉木素插入PPO的疏水空腔(圖8A),結合在酶的雙核銅活性中心附近(圖8B),并與周圍的氨基酸殘基His244、Asn260、His85、Val248、Phe264、Val283及His263等發生疏水相互作用(圖8C),且香葉木素的A環C-7位OH還能與Met280形成一個氫鍵,結合距離為4.82 ?。另外兩個氫鍵在香葉木素C環的羰基與His85和His259之間形成,結合距離

圖8 (A)香葉木素結合于PPO的疏水空腔(藍色和橙色分別代表酶的親水和疏水部分);(B)香葉木素與PPO的最佳結合構象;(C)香葉木素與PPO結合的2D圖Fig.8 Diosmetin binds in the hydrophobic cavity of PPO.Blue and orange represent the hydrophilic and hydrophobic parts of the enzyme surface,respectively;(B) Optimal binding conformation of diosmetin and PPO;(C) 2D image of diosmetin binding to PPO

分別為4.39 ?和5.64 ?。香葉木素還能與His244、Asn260、Glu256、Phe90、His61、Phe292、Phe264、Gly281及Ser282等通過范德華力發生相互作用。此外,香葉木素的A環與氨基酸殘基Val283和Ala286,B環與殘基Val248以及C環與殘基Val283之間均存在π-烷基鍵,其A環還與His263形成酰胺-π堆積(圖8C)。因此,氫鍵、疏水相互作用和范德華力在香葉木素與PPO的結合過程中都發揮著重要作用。由此推斷,香葉木素結合于酶的疏水空腔,與酶活性中心周圍的氨基酸相互作用,誘導酶的構象發生改變,阻礙底物進入酶的活性中心,因而降低PPO的催化活性[3]。

2.4.2 分子動力學模擬

分子動力學模擬直觀展示了PPO及PPO-香葉木素復合物結構的動態變化。均方根偏差(RMSD)可以用來評估體系的穩定性,其值波動越小體系越穩定[26]。圖9A顯示PPO-香葉木素復合物的RMSD值波動較大,其值最終穩定在約0.25 nm處,整體上略高于單獨酶體系,這表示復合體系更不穩定。均方根波動(RMSF)有助于了解結合過程中蛋白質的局部構象變化,其值越高表示氨基酸殘基的靈活性越好[27]。圖9B中氨基酸殘基65～75,180～185,245～253,320～330,354～360的RMSF值波動較大,表明這些殘基積極參與了香葉木素與PPO的結合過程,并通過調整自身構象來形成PPO-香葉木素復合物?；匦霃?Rg)的值與酶的結構致密性呈負相關[28]。圖9C顯示,PPO-香葉木素復合物的Rg值在前20 ns內高于PPO,表明這t/ns Residues

t/nst/ns

Tyr Trp

段時間內PPO的結構伸展以容納香葉木素。在20 ns后,復合物的Rg值整體上低于PPO表明酶與香葉木素的結合令酶的結構更加緊密,與圓二結果具有一致性。溶劑可及表面積(SASA)反映了體系與溶劑接觸表面積的變化,其值增大酶的疏水性降低[29]。圖9D中PPO-香葉木素復合物的SASA值整體上低于PPO,表明PPO與香葉木素結合后親水性降低疏水性增加,香葉木素誘導了酶結構緊縮。圖9E和F中Tyr和Trp殘基的SASA值整體上沒有顯著改變,說明與香葉木素結合對PPO中Tyr和Trp殘基的極性和疏水性的影響不明顯,分子動力學模擬驗證了同步熒光的實驗結果。

3 結論

香葉木素可逆混合地抑制PPO的催化活性,并能以靜態方式猝滅PPO的內源熒光,疏水相互作用是穩定PPO-香葉木素復合物結構的主要作用力,兩者之間只有一個結合位點。香葉木素進入PPO的疏水空腔,結合在PPO的雙核銅活性中心附近,并與其周圍的氨基酸殘基主要通過氫鍵、疏水作用力和范德華力相互作用,使得PPO的穩定性和親水性下降,結構的致密性增加。香葉木素抑制PPO活性的機制可能主要是由于該黃酮化合物結合在PPO活性中心附近,與其周圍的一些氨基酸殘基相互作用,占據了底物進入酶活性中心的通道,誘導了PPO二級結構發生變化,阻止了底物被酶催化,從而降低了PPO的活性。研究結果為香葉木素作為新型PPO抑制劑應用于食品工業提供科學依據。