姜黃素聯合5-氨基水楊酸介導Notch信號通路治療潰瘍性結腸炎大鼠的分子機制研究

薛永舉,楊 麗,柯希權,朱 玉,王 猛

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是以非特異性炎癥病變為主的腸道疾病,病變位置可累及直腸和結腸黏膜層[1],其病因主要為遺傳傾向、環境觸發因素、腸道微生物作用和免疫失調[2]。UC的臨床特征為持續性或復發性腹瀉、大便伴黏液血或化膿、腹痛和各種全身癥狀[3]。這種疾病很難治愈,目前治療主要針對癥狀緩解[1]。UC的并發癥包括貧血、低蛋白血癥、中毒性巨結腸、腸穿孔和下消化道出血,嚴重威脅病人的健康[4]。近年來,隨著飲食習慣的改變,UC的患病率急劇上升。

5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)在治療輕中度UC的臨床試驗中起重要作用[5],主要以抑制環氧合酶和脂加氧酶的活性在臨床治療中起作用[6]。但近段時間內也有研究[7]報道,5-ASA 可以影響腸道微生物群的生長環境,從而改變腸道微生物的黏附力和持久性[7],導致UC病人在治療后腸道黏膜細菌減少。因此,需要一種更可靠、風險更低有抗炎治療作用的藥用植物或其活性成分,尤其是含食物驅動成分。姜黃素(二阿魏酰甲烷)就是這樣一種具有廣泛治療應用的化合物。已證明具有廣泛的生物和藥理活性,大量研究證據支持姜黃素的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和傷口愈合作用[8-12]。有Meta分析顯示,姜黃素輔助療法可有效緩解UC病人的臨床病情,而不會引起嚴重不良反應[13]。由于其溶解性和生物利用度較差,天然姜黃素無法發揮其治療功效的全部潛力。因此,為了提高姜黃素的生物利用度,將其與5-ASA進行復合。本研究將探究姜黃素與5-ASA聯合使用是否能夠在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導UC大鼠中發揮更顯著的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本實驗所使用的動物均為SD大鼠,采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號:SCXK(湘)2019-0004)。飼養和繁殖均在湖南斯萊克景達實驗動物有限公司醫藥實驗動物中心恒溫室(24±2)℃中,每日光照/黑暗循環各12 h,用常規標準飼料喂養,自由獲取食物和水。SD大鼠為雄性,體質量180～220 g,飼養于溫度20～26 ℃,濕度40%～70%的條件下。所有動物實驗嚴格遵照動物護理和使用委員會的指南進行。

1.2 實驗試劑 姜黃素(貨號:C7090,廠家:索來寶);5-ASA(貨號:14055,廠家:MCE);TNBS(貨號:SLCK4178,廠家:Sigma);蘇木素染液(貨號:ZLI-9610,廠家:中衫金橋);伊紅染色液(貨號:G1100,廠家:索來寶);Mouse Monoclonal Anti-Actin(貨號:TA-09,廠家:中杉金橋);辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)(貨號:ZB-2305,廠家:中杉金橋);目的一抗:Rabbit Anti Notch1(貨號:af5037,廠家:affinify);目的一抗:Rabbit Anti HESL (貨號:df7569,廠家:affinify);目的一抗:Rabbit Anti Jagged1(貨號:bs-1448R,廠家:Bioss);Trizon Reagent(貨號:CW0580S)和超純RNA提取試劑盒(貨號:CW0581M)北京康為世紀生物科技有限公司;HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(貨號:R223-01)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號:Q711-02)采購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司 。

1.3 實驗儀器 顯微鏡(型號:CX43)采購于奧林巴斯(中國)有限公司;切片機(型號:2235)采購于徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司;全自動酶標儀(型號:WD-2102B)和蛋白垂直電泳儀(型號:DYY-6C)采購于北京市六一儀器廠;高速臺式冷凍離心機(型號:H1750R)采購于湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;熒光PCR儀(型號:CFX Connect 實時)采購于伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠UC模型制備 大鼠經禁食不禁水48 h,麻醉后由肛門輕緩插入直徑為2 mm的橡膠輸液管,深度為7 cm,輸液管內裝有TNBS(按照2 mL/kg溶入0.25 mL的50%乙醇中)。使用注射器來推動橡膠輸液管中的TNBS,使之注入大鼠結腸,隨后將大鼠持續倒置60 s。隨后讓大鼠平躺在籠中,等待自然清醒,任其自由飲食。48 h后取2只模型組大鼠的結腸組織觀察及HE染色,肉眼可見模型組結腸黏膜充血水腫,伴壞死及潰瘍形成,HE染色見結腸組織炎細胞浸潤及隱窩炎甚至隱窩膿腫形成,證明模型制備成功(見圖1)。

1.4.2 藥物治療處理 將18只UC大鼠隨機分組進行藥物治療,分為5-ASA組、姜黃素中劑量組和姜黃素中劑量+5-ASA 組,每組各6只。對模型組UC大鼠每天以5 mL/kg的5-ASA進行灌胃,對姜黃素中劑量組UC大鼠每天以5 mL/kg的姜黃素溶液進行灌胃,對姜黃素中劑量+5-ASA聯用組UC大鼠每天以5 mL/kg的姜黃素溶液和5-ASA進行灌胃,模型組和正常組大鼠以溶劑對照按相同方式灌胃處理,共灌胃10 d。

1.4.3 疾病活動指數(DAI)評分 各組大鼠注藥后每日觀察它們的一般情況,如精神狀態、進食、活動和大便情況等,并每天使用聯苯胺法測大便隱血,根據觀察結果進行DAI評價。DAI 評分標準見表1。

表1 DAI評分標準

1.4.4 結腸黏膜損傷指數(CMDI) 處死動物觀察大體標本并評價CMDI。CMDI評分標準見表2。

表2 CMDI評分標準

1.4.5 HE染色和組織學評分 大鼠結腸黏膜石蠟切片,先進行烤片、脫蠟、水化,再用蘇木素染液染色3～5 min,經流水沖洗后,用1%鹽酸乙醇分化,反藍液反藍,伊紅染色3～5 min后,切片脫水,封片,在顯微鏡(BX43,Olympus)下觀察,進行組織學評分。組織學指標包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、病變深度及纖維化,按有無及輕重分別記0、1、2分,病變深度達黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分,各項相加得總分。

1.4.6 免疫組織化學 免疫組織化學可以檢測大鼠結腸黏膜內Notch信號通路中Notch1、jaggled1、Hes1的蛋白表達情況。大鼠結腸黏膜切片,烤片、脫蠟、水化后,用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。經5% BSA抗原封閉2 h后,用Notch1(1∶100,兔抗)、jaggled1(1∶100兔抗)、Hesl(1∶100兔抗)進行一抗孵育,4 ℃過夜后,進行辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶100)孵育,經DAB適當時間顯色,再用蘇木精復染反藍,用梯度乙醇和二甲苯脫水透明后,用中性樹脂進行封片,最后在顯微鏡(BX43,Olympus)下進行觀察,拍片記錄。

1.4.7 Western blotting 取大鼠結腸黏膜組織適當重量,加入磷酸酶蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液的混合物,用組織研磨儀進行研磨,提取組織總蛋白(對于細胞:取細胞,棄去培養基,用RIPA裂解液提取總蛋白)。在4 ℃、16 000 g的設定條件下,高速離心機離心15 min,仔細吸取上清液避免吸取到EP管底沉淀物質,用BCA蛋白測定法來進行蛋白定量。對蛋白樣品進行變性后,進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE),后用300 mA恒流轉膜。將蛋白轉移至PVDF膜(millipore)后用脫脂奶粉室溫搖床上封閉2 h后,用TBST清洗3×10min,隨后在4 ℃條件下過夜孵育一抗,次日用TBST清洗3×10 min,室溫搖床上孵育二抗2 h,漂洗3×10 min。用ECL顯影液浸濕PVDF膜,置于超高靈敏度化學發光成像系統(Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)中進行顯影。

1.4.8 RT-PCR 采用Trizol試劑提取結腸黏膜組織中的總RNA,采用RNA 超純提取試劑盒提取mRNA,利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純度(OD260/OD280),通過RNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,采用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應步驟如下:預變性 95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個循環。以GAPDH作為內參,基因的相對表達量根據2-△△Ct法計算。引物序列見表3。

表3 引物序列

1.5 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 姜黃素對UC大鼠疾病活動和結腸黏膜損傷的影響 各組大鼠結腸組織對比,可以看出除對照組外,其余各組結腸黏膜均有不同程度損傷,模型組損傷最嚴重,藥物干預后略有下降(見圖2A)。在造模后第1天與對照組相比,其他4組大鼠出現松散大便和稀便,大便肉眼可見隱血,且DAI顯著高于對照組。隨著時間的推移,5-ASA組、姜黃素中劑量組和聯合給藥組大便隱血消退,消退所需要的時間短于模型組(見圖2B)。與對照組相比,模型組CMDI評分明顯上升(P<0.01),其他給藥組較模型組CMDI下降(P<0.05～P<0.01),且聯合給藥治療組CMDI評分下降最為明顯(P<0.01)(見表4)。

表4 各組CMDI評分比較分)

2.2 姜黃素對UC大鼠結腸黏膜病理的影響 與對照組比較,模型組的結腸黏膜組織肉眼明顯可觀察到出血糜爛和潰瘍,顯微鏡下觀察發S現杯狀細胞消失,腸壁增厚,黏膜下層有大量的炎性細胞深入浸潤(見圖3)。與模型組相比,5-ASA組、姜黃素中劑量組和聯合用藥組結腸組織學損傷評分明顯下降(P<0.01);且聯合用藥組結腸組織學損傷評分下降更為明顯(P<0.01)(見表5)。

表5 各組大鼠結腸黏膜病理情況分)

2.3 姜黃素對UC大鼠結腸黏膜組織中Notch1通路蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組Notch1、jaggledl、Hes1蛋白水平表達量明顯升高(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組、聯合用藥組Notch1、jaggledl、Hes1蛋白均明顯表達下降(P<0.01)(見表6～8)。大鼠結腸黏膜中Hes1、jaggledl、Notch1免疫組織化學示意圖見圖4。

表6 各組大鼠結腸黏膜中Hes1表達情況

表7 各組大鼠結腸黏膜中jaggledl表達情況

表8 各組大鼠結腸黏膜中Notch1表達情況

2.4 姜黃素對UC大鼠結腸黏膜Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達明顯上升(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組、聯合用藥組Hes1、jaggledl、Notch1蛋白表達水平均明顯下降(P<0.01),下降幅度:聯合用藥組>姜黃素中劑量組>5-ASA組>模型組(見表9～11、圖5)。

表9 大鼠結腸黏膜中Hes1蛋白表達情況

表10 大鼠結腸黏膜中jaggledl蛋白表達情況

表11 大鼠結腸黏膜中Notch1蛋白表達情況

2.5 姜黃素對UC大鼠結腸黏膜Notch1、jaggledl、Hes1 mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組Notch1、jaggled1、Hes1mRNA表達水平明顯升高(P<0.01);與模型組相比,5-ASA組和姜黃素中劑量組Notch1、jaggled1、Hes1mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)(見表12～14)。

表12 大鼠結腸黏膜中Hes1的mRNA表達情況

表13 大鼠結腸黏膜中jaggledl的mRNA表達情況

表14 大鼠結腸黏膜中Notch1的mRNA表達情況

3 討論

UC是一種慢性及復發性炎癥[14],結腸黏膜的炎性反應是其主要病理特征[15],且病因復雜,臨床發現可能與遺傳因素、免疫缺陷、環境刺激等多種因素有關[16-19],其最突出的表現是血性腹瀉,其他癥狀有腹痛、消瘦、直腸緊迫感、里急后重等。UC發病機制較復雜,研究[20]發現腸黏膜屏障功能障礙在UC發病中起極重要作用[20],而結腸黏膜屏障損傷的主要原因是結腸上皮細胞增殖、分化失常[21]。已知構成結腸上皮的主要細胞是杯狀細胞,而當杯狀細胞缺失時,黏膜會發生一定的缺損、腸道的通透性也會升高、免疫功能發生改變以及腸源性感染也時有發生。本研究通過將100 mg/kg TNBS肛門給藥構建大鼠UC模型[22],HE染色結果表明UC模型組的大鼠結腸黏膜部位發生出血,糜爛和潰瘍,杯狀細胞消失,腸壁增厚,黏膜下層炎性細胞浸潤。

姜黃素是一種源自姜黃的多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎和免疫抑制作用,并下調腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ、轉化生長因子-β、白細胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-12和IL-17的表達[23-25]。姜黃素還具有抗菌和抗腫瘤的潛力,可以改善與UC相關的癥狀[26-27]。本研究按照姜黃素(100 mg/kg)和5-ASA(100 mg/kg)單獨和聯合對UC大鼠給藥進行灌胃治療,結果顯示,姜黃素和5-ASA單獨或聯合使用均能夠顯著降低 TNBS 誘導的 UC 大鼠CMDI評分和DAI評分。HE病理染色結果顯示姜黃素和5-ASA單獨給藥組炎性細胞有所減少,結腸黏膜出血糜爛潰瘍情況緩解,且姜黃素-5-ASA聯合給藥組不見出血潰瘍情況,只有少量炎性細胞,效果最顯著。說明姜黃素聯合5-ASA給藥可有效緩解腸黏膜的損傷,發揮治療UC的作用。

研究人員最初是在果蠅中發現的Notch信號通路。隨后有大量的研究證明,在許多哺乳動物中Notch信號通路也廣泛存在。胚胎干細胞、造血干細胞、淋巴細胞、腸上皮細胞和各種腫瘤細胞是Notch信號通路主要表達的位置。此通路在跨膜受體蛋白家族進化中是相對保守的信號通路。有研究[28]稱,Notch通路靶基因Hes1和Math1以及配體Dll1可能是治療UC的新的治療靶點,其作用可能為進一步研究提供理論基礎。事實上,Notch信號通路是腸內穩態過程中細胞命運決定的主要調節器,在維持結腸上皮細胞增殖和分化中起著重要作用,治療UC最關鍵的信號通路之一[29]。據報道[29-30],DSS結腸炎小鼠炎癥腸細胞的增生性隱窩中存在Notch信號通路基因的過度表達。Notch受體、Notch配體、CSLDNA結合蛋白、靶基因、效應分子等是Notch信號通路的主要組成成分。而在哺乳動物中,Notch受體之一的Notch1 在腸道中存在[31],當Notch受體與配體結合時,就會使Notch信號通路被激活,從而使下游靶基因 Hesl等發生轉錄調節,隨后使腸上皮細胞增殖分化,靶基因Hesl的表達促使結腸上皮細胞向吸收系細胞分化[32]。研究[33]表明,當把小鼠的Hesl基因敲除后,發現杯狀細胞等分泌細胞在小鼠結腸增多,而腸細胞卻發生減少[34]。而一些實驗結果發現,在UC小鼠結腸上皮組織中,Notch1、Hesl mRNA水平和蛋白水平表達量均較正常小鼠有顯著升高的趨勢,在經過特定藥物干預后,可以顯著降低小鼠結腸上皮組織 Notch1、Hesl mRNA和蛋白水平的表達。值得注意的是,Notch信號通路基因的異常表達和失調與幾種疾病的發病機制密切相關,Notch1、Notch2、Hes1和Jagged1等Notch基因的表達在隱窩中富集[35]。在研究人員[36]對UC研究過程中發現,人類結腸細胞系中,Notch信號通路的異常表達導致了轉錄因子HES1的表達也隨之增加,并抑制腸上皮細胞分化為杯狀細胞從而減弱黏液屏障。那么在姜黃素治療大鼠UC中是否有Notch信號通路的調控呢?DEY等[37]研究發現姜黃素可以抑制Notch1/Hes1信號通路進而減輕氧化應激對內皮細胞的損傷。也有研究發現姜黃素可下調 Notch1 通路從而改善氣道炎癥[38]。在本研究通過免疫組織化學、Western blotting、qPCR檢測姜黃素、5-ASA單獨和聯合對UC大鼠給藥后的結腸黏膜中Notch1、jaggledl、Hes1 蛋白和mRNA表達發現,UC模型組中Notch1、jaggled1、Hes1表達上升,而與模型組相比,姜黃素中劑量組和5-ASA Notch1、jaggled1、Hes1表達下降,且姜黃素中劑量+5-ASA聯合用藥組Notch1、jaggled1、Hes1基因下降趨勢最明顯。

綜上所述,姜黃素與5-ASA聯合應用能有效抑制UC大鼠結腸黏膜炎性反應的病理改變,并且加快恢復腸黏膜組織損傷的修復,而本研究中發現下調結腸黏膜組織中Notch1、jaggled1、Hes1蛋白和mRNA表達水平是其可能存在的作用機制。因此,可以通過抑制Notch信號通路的過度活化來抑制其發揮作用,并且促進結腸黏膜上皮細胞正常分化,黏液層結構和功能完整來最終實現對UC的治療作用。