旱黃瓜莖基腐病菌鑒定及其生物學特性

金 鴿,閔 康,陳怡銘,曹 蜢,張宇萍,韓亞梅,高玉峰,賀字典,*

(河北科技師范學院 1 農學與生物科技學院 河北省作物逆境生物學重點實驗室,2 學報編輯部,河北 秦皇島,066004)

近幾年,黃瓜莖基腐病在全國各黃瓜產區危害呈現逐年遞增的趨勢[1],田間發病率一般為15%～20%,重者高達50%以上,甚至絕收。上海地區黃瓜莖基腐病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense)[2]。山東聊城黃瓜莖基腐病病菌為瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[3]。目前,旱黃瓜莖基腐病的病原菌并未見到報道。旱黃瓜俗名秋黃瓜、白黃瓜,與常見的密刺黃瓜(俗名黑黃瓜)外觀上有明顯區別。近年來,隨著國家蔬菜產業體系和河北省蔬菜產業體系的推廣,旱黃瓜種植面積逐漸擴大,已在山東、河北、東北三省等地大面積種植。但是,自2018年開始,旱黃瓜莖基部出現黃色水漬狀壞死,病斑逐漸擴大繞莖一周后莖部開始縱向開裂,檢查病株根系未出現腐爛,維管束也未變褐。為了明確旱黃瓜莖基腐病的病原菌種類及其生物學特性,筆者擬采用組織分離法和ITS序列對旱黃瓜莖基腐病的病原菌進行分離與鑒定,并對病原菌的生物學特性進行研究,以期為旱黃瓜莖基腐病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試病樣 2018～2022年從河北省昌黎縣馬坊營旱黃瓜基地發病的大棚內采集病樣27份。

1.1.2供試品種 田嬌8號旱黃瓜和黃籽南瓜,購自河北省昌黎縣當地種子門市部。

1.1.3Richard培養基 KNO310 g,KH2PO45 g,MgSO42.5 g,FeCl30.02 g,蔗糖50 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離 采用組織分離法對病原菌進行分離。在病健交界處切取5 mm×5mm的病組織,置于體積分數75%酒精中消毒45 s,然后于質量濃度為10 g/L的NaClO溶液中消毒1 min,用滅菌水漂洗3次后將病組織放在滅菌濾紙上,完全吸干水分后置于PDA平板上,每皿放置4塊,于25 ℃黑暗恒溫培養,待病組織上長出菌絲后,利用菌絲尖端純化方法,多次純化直至菌落形態一致。4 ℃保存備用。

1.2.2致病性測定 采用針刺法測定病原菌對黃瓜和南瓜的致病性。將直徑7 mm的病原菌菌餅置于PDA平板上,待長滿平板后,分次加入5 mL滅菌水,用滅菌載玻片刮取菌絲于離心管中制成孢子懸浮液。用血球計數板調整分生孢子數量達到107個·mL-1。待黃瓜與南瓜幼苗長到兩葉一心時,用昆蟲針在莖基部由下至上針刺5個孔,兩孔間距0.5 cm。用無菌毛筆蘸取孢子懸浮液涂抹在針刺部位,黃瓜和南瓜各接種10棵。以涂抹清水的為對照。4次重復。接種后用濕脫脂棉包裹在傷口部位保濕,并用白色地膜蓋住育苗盤[4]。將育苗盤置于25 ℃棚膜搭建的保濕室內培養,每天用無菌水浸濕脫脂棉。48 h后撤掉地膜,96 h后移除脫脂棉。7 d后觀察幼苗發病情況,記錄病變形態,并對發病部位分離,鑒定病菌形態與原病菌是否一致。

1.2.3病原菌的形態學鑒定 用直徑7 mm的打孔器從病原菌菌落邊緣打菌餅,接種到PDA平板上。25 ℃恒溫黑暗培養4 d時測量菌落直徑,7 d時觀察病原菌在PDA培養基上的氣生菌絲形狀、色素產生情況等菌落特征,并測量大、小型分生孢子大小及厚垣孢子的形態和產生方式等特征,參照Booth的方法對病原菌的種進行初步鑒定[5,6]。

1.2.4病原菌的分子生物學鑒定 將病原菌菌株在PDA平板上活化后,每個菌株培養20皿,培養至長滿培養皿,刮取菌絲冷凍保存,采用CTAB法提取基因組DNA。分別采用ITS1(5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和NL1(5′-GCATATCA ATAA GCGGAGGAAAAG-3′)/LR3(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3′)對該菌株的ITS區進行PCR擴增[7]。PCR反應程序為:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環;72 ℃延伸7 min。PCR產物送北京生工生物工程公司測序。所得序列用NCBI中的BLAST程序搜索同源序列,下載相似性大于99%及近緣屬序列,用MEGA-X軟件進行多序列比對,以鄰接法構建系統發育樹。

1.2.5pH對病原菌生長的影響 用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl將PDA培養基的pH調為4,5,6,7,8,9,10,11和12共9個梯度,接種菌餅后置于培養箱中25 ℃黑暗培養5 d,采用十字交叉法測量菌落直徑。取培養7 d的病原菌,用打孔器在菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養基上,28 ℃培養,第5天采用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數板測產孢量,3次重復。

1.2.6溫度對病原菌生長的影響 取培養7 d的病原菌,用打孔器在菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養基上,分別置于溫度為15,20,25,30,35,40,45 ℃培養箱中培養,第5天采用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數板測產孢量,3次重復。

1.2.7碳源對病原菌生長的影響 用Richard培養基作基礎培養基,分別以等量的果糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖、淀粉代替蔗糖作為碳源。將直徑為7 mm的菌餅接種到不同碳源的培養基上,25 ℃培養。第5天用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數板測產孢量,3次重復。

1.2.8氮源對病原菌生長的影響 以Richard培養基為基礎,分別以NH4NO3,(NH4)2SO4,NaNO3,尿素和蛋白胨代替KNO3作為氮源。將直徑7 mm的菌餅接種到含不同氮源的培養基上,25 ℃培養。第5天用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數板測產孢量,3次重復。

1.2.9菌絲致死溫度測定 將直徑7 mm的病原菌菌餅置于裝有10 mL無菌水的試管中,將試管分別置于40,50,60,70,80 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻,將菌餅取出后接種于PDA平板上,于28 ℃培養箱中進行恒溫培養,3次重復,4 d后測量菌落直徑,統計出致死溫度范圍。再次將溫度設置間隔5 ℃梯度,重復上述操作,最后設置間隔1 ℃溫度梯度最終確定病原菌的致死溫度。

2 結果與分析

2.1 黃瓜莖腐病原菌的分離培養

采集黃瓜病株樣品進行分離培養,共獲得鐮孢菌29株,青霉菌10株,鏈格孢8株。其中,菌株CL0307在PDA上25 ℃培養5 d的菌落直徑為7.5～8.2 cm,菌落羊絨狀,菌絲無色,產生紫紅色色素。顯微觀察有大型分生孢子和小型分生孢子,初步確定為鐮孢菌(圖1)。

注:A,菌落正面特征;B,菌落背面特征 圖1 菌株CL0307的菌落特征

2.2 病原菌的致病性

2.2.1田間發病癥狀 用南瓜嫁接的旱黃瓜田間發病后莖基部表皮變成黃色,似開水浸過,表皮逐漸變得粗糙,縱向開裂,隨著裂口加大,植株失水,萎蔫死亡(圖2)。

注:A,表皮呈黃色;B,表皮粗糙;C,縱向開裂圖2 黃瓜莖基腐病田間發病癥狀

2.2.2人工接種發病癥狀 其他菌株接種黃瓜和南瓜后均未發病。用菌株CL0307接種黃瓜后,在莖基部出現黃色水浸狀病斑,繞頸一周后,黃瓜倒伏,干枯,死亡,發病率為75%,死亡率60%(圖3A)。將該菌株接種到南瓜莖基部,病情發展比黃瓜緩慢,初期南瓜葉片葉尖和葉緣呈現黃色,莖基部逐漸變色,干枯,死亡,發病率為80%,死亡率20%(圖3B)。清水對照均未發病,因此確定CL0307為黃瓜莖基腐病的致病菌。

注:A,南瓜發病癥狀;B,黃瓜發病癥狀;C,黃瓜和南瓜清水對照圖3 人工接種后南瓜和黃瓜的發病癥狀

2.3 病原菌的鑒定

在PDA培養基上25 ℃黑暗條件下培養4 d,白色菌落,菌絲層致密,菌落直徑為38～45 mm,后期培養基呈淡紫色。大型分生孢子數量少,細長,鐮刀型,向兩端漸尖,稍彎曲,足細胞有或無,具2～5個真隔膜,多數為3個,大小為22.5～40.0 μm × 2.5～4.0 μm。PDA上產生大量的小型分生孢子,在產孢細胞頂端串生或假頭生,大小為5.0～17.5 μm × 2.0～3.0 μm。未見到有厚垣孢子(圖4)。ITS序列比對結果顯示,菌株CL0307與Fusariumverticillioide(登錄號KF031434.1和LN482457.1)序列相似性為100%(圖5)。結合菌株形態及分子鑒定結果,黃瓜莖基腐病的病原菌確定為輪狀鐮孢菌(Fusariumverticillioide)。

注:A,菌落形態;B,分生孢子座上大型分生孢子;C,小型分生孢子;D,鏈生小孢子;E,假頭生小孢子;F-～H,復瓶梗圖4 菌株CL0307的特征

圖5 擬輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)的系統發育樹

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1pH對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 擬輪枝鐮孢菌菌落直徑在pH為4.0和12.0時分別為4.58 cm和4.18 cm,顯著低于pH為5.0和6.0時的菌落直徑(表1)。擬輪枝鐮孢菌只在pH為5.0和6.0時產生大型分生孢子,數量分別為0.83×107個·mL-1和0.33×107個·mL-1。小型分生孢子數量以pH為5.0時最多,顯著高于其他pH的數量。

表1 pH對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.2溫度對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 擬輪枝鐮孢菌在15～30 ℃范圍內隨著溫度升高,菌絲生長速度加快,菌落直徑逐漸增大;30 ℃菌落直徑為8.08 cm(表2);35 ℃以上菌絲生長開始受到抑制,35 ℃時菌落直徑僅2.08 cm;40 ℃菌絲停止生長。擬輪枝鐮孢菌的大型分生孢子生長最適溫度為25 ℃,數量達到1.25×106個·mL-1,其次是30 ℃,數量為1.08×106個·mL-1,二者差異顯著。小型分生孢子生長的適宜溫度為30 ℃,數量達到17.33×107個·mL-1,顯著高于其他溫度的小型分生孢子數量。

表2 溫度對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.3碳源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 碳源為淀粉時菌落直徑為5.65 cm,顯著低于其他碳源培養基生長速度,所有碳源上擬輪枝鐮孢菌的菌落直徑差異均不顯著(表3)。擬輪枝鐮孢菌大型分生孢子和小型分生孢子的數量均以蔗糖為碳源的培養基上最多,分別為10.00×106個·mL-1和70.83×107個·mL-1,均顯著高于其他碳源的分生孢子數量。

表3 碳源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.4氮源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 NH4NO4和(NH4)2SO4有利于擬輪枝鐮孢菌菌絲生長,菌落直徑分別為7.08 cm和6.62 cm,顯著高于其他氮源菌絲生長速度(表4)。NH4NO4均適合于擬輪枝鐮孢菌大型分生孢子和小型分生孢子生長,產孢量分別為16.67×106個·mL-1和11.67×107個·mL-1,顯著高于其他氮源的分生孢子數量。

表4 氮源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.5擬輪枝鐮孢菌的致死溫度 擬輪枝鐮孢菌菌絲在69 ℃水浴鍋中處理10 min后不再生長,因此確定擬輪枝鐮孢菌的致死溫度為69 ℃(表5)。

表5 擬輪枝鐮孢菌菌絲致死溫度

3 結論與討論

鐮孢菌是引起枯萎病、根腐病、莖腐病、頂腐病等根、莖、葉部病害的重要病原菌[8～16],造成作物、蔬菜、果樹、中藥材的產量下降和品質降低,其中擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)不僅是黃瓜莖基腐病的病原菌,也是甜瓜枯萎病[17]和番木瓜根腐莖腐病[18]的一種新的致病菌。擬輪枝鐮孢菌是由串珠鐮孢菌(Fusariummoniliforme)更名過來的,與藤倉鐮孢菌也有密切關系[19],串珠鐮孢菌侵染玉米莖稈后,隨著體外氣流傳播到玉米穗后引起穗腐病[20]。劉樹森等[21]報道,引起黃淮海夏玉米主產區玉米穗腐病的主要致病菌包括擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)及藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi),其中擬輪枝鐮孢是主要致病菌。昌黎旱黃瓜莖腐病的病原菌與玉米莖腐病和穗腐病的病原菌相同,可能與該地區普遍采用玉米地土壤育苗有關。

生物學特性表明擬輪枝鐮孢菌絲最適生長溫度為30 ℃,最適pH為6.0,最適碳源為葡萄糖,最適氮源為NH4NO3,致死溫度為69 ℃,這與郭成等[22]報道基本一致。因鐮孢菌形態變化較大,且土壤環境因素復雜,連作也會造成病原菌菌源積累[23]。因此,關注擬輪枝鐮孢與其他種類鐮孢菌的種群動態變化是防治該病害的關鍵因素之一,還需要進一步研究。