基因工程重組大腸桿菌發酵生物量產出的影響因素評估

鄭婷婷，田竣元，黃娟，吳鴻雪，蔡映蕓，吳玉水

·技術與方法·

基因工程重組大腸桿菌發酵生物量產出的影響因素評估

鄭婷婷，田竣元，黃娟，吳鴻雪，蔡映蕓，吳玉水

351100 莆田，福建基諾厚普生物科技有限公司

大腸桿菌因為生長速度快，易于培養，代謝可塑性強，擁有豐富的遺傳和基因工程工具，成為代謝工程和合成生物學的最佳宿主之一[1]。利用重組大腸桿菌的高密度發酵，可以獲得較高的生物量和顯著提高目的基因表達產物的濃度[2]。但在工業發酵過程中，影響生物量產出的因素非常多，比如培養基的成分（細菌生長所需的營養物質）、發酵過程中生長抑制物的積累、溶氧濃度、培養溫度、發酵液的 pH 值、補料方式以及發酵液流變學特性等[3]。近幾年國內有關大腸桿菌高密度培養的文獻報道表明，發酵32 h 內的菌體密度大概在600為 79 ～ 125[4-6]。

在構建重組大腸桿菌進行高密度發酵生產目的蛋白時，適宜的發酵種齡能縮短發酵的周期[7]，為后期工業化的生產奠定基礎。微量元素的添加有利于發酵[8]，測試三氯化鐵六水合物物料投入對發酵生物量產出是否有著差異，選擇合適的供應商有利于后續發酵的工業化生產。大腸桿菌高密度培養過程，葡萄糖是碳源中最易利用的糖，但很容易產生乙酸并在超過一定濃度之后影響生長和表達[9]。所以在發酵過程中，進行補料流加時，要時刻監測發酵罐中的殘糖量，將其控制在一定水平[10]。

本文應用比濁法[11]，在適宜重組大腸桿菌的發酵條件下測定發酵生物量，探究種齡、微量元素、殘糖含量對重組大腸桿菌菌株 pET(UB41-Smoc)/BL21(DE3) 的發酵生物量的影響。評估重組大腸桿菌高密度發酵生物量產出的影響因素，有利于提高發酵工藝水平以及重組目的蛋白的產出量，為實現重組菌發酵的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

NVT6200ZH 電子天平購自奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；渦旋振蕩儀、磁力攪拌器和迷你型離心機購自美國精騏有限公司；A2S-20-CE-T 超純水機購自美國艾科浦公司；臺式高速冷凍離心機和超大容量冷凍離心機購自長沙湘智離心機儀器有限公司；LDZM-80L-II 立式壓力蒸汽滅菌鍋購自上海申安醫療器械廠；BLBIO-7GJ 發酵罐購自上海百侖生物科技有限公司；IS-A 疊加式恒溫振蕩器購自蘇州捷美電子有限公司；721G紫外-可見分光光度計購自上海儀電；GA-3 血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司。

重組大腸桿菌菌株 pET(UB41-Smoc)/BL21(DE3) 由福建基諾厚普生物科技有限公司構建并保存，表達產品為一種生物類似藥（產品代碼 Smoc）；三氯化鐵六水合物分別為安徽A 公司以及南京 B 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 各種培養基與料液的配制 搖瓶 TB 培養基（g/L）：磷酸氫二鉀 12.5，磷酸二氫鉀 2.3，大豆蛋白胨12，酵母浸粉 24，20% 葡萄糖 10，滅菌后補加 1 ml 的50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液。

發酵鹽類配方（g/L）：一水檸檬酸 30，磷酸氫二鈉 94.3，硫酸銨 40，磷酸二氫鉀 80，無水葡萄糖100。

100 × 微量元素濃縮液（g/L）：四水合二氯化錳 1.5，三氯化鐵六水合物 30，二水氯化鈣 5.36，氯化鋅 6.75，硫酸銅 3.0，硼酸 0.69，氯化鈷六水合物 1.14，鉬酸鈉 0.3。

發酵培養基（g/L）：酵母浸粉 30，滅菌后補加槽體鹽類配方 100，50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液 1，消泡劑 0.1，50% 七水硫酸鎂溶液 2，100 × 微量元素濃縮液 10。

發酵罐補料（g/L）：無水葡萄糖 500，滅菌后補加 20% 鹽酸硫胺溶液 10，50% 硫酸鎂溶液 21，16% 硫酸銨溶液 50，100 × 微量元素濃縮液 10。

以上各種培養基采用立式壓力蒸汽滅菌鍋 121 ℃高溫滅菌 30 min。

1.2.2 生物量測定 采用操作簡單、誤差概率低的比濁法進行檢測。用紫外-可見分光光度計測量600值，用600值表示樣品菌液濃度。接菌前的發酵培養基作為空白溶液調節透光度 T = 100%。將發酵培養液作適當倍數稀釋后，使其在紫外-可見分光光度計波長 600 nm 處測得的吸光度值在 0.1 ～ 1.0 內（較好的檢測線性范圍）。將測量值與稀釋倍數相乘即為菌體密度600值。

1.2.3 殘糖測定 將發酵培養液作適當倍數稀釋后，以10 μl 的進液量在血糖儀上檢測。將測量值乘以稀釋倍數即為發酵槽體中的殘糖量（血糖儀檢測單位為 mmol/L，依據 2 g/L = 11.2 mmol/L 換算）。

1.2.4 種齡對發酵生物量產出的影響

高壓滅菌：50% 硫酸鎂溶液、20% 葡萄糖溶液、搖瓶 TB 培養基、發酵培養基、發酵罐補料進行121 ℃高溫滅菌 30 min。采用 0.22 μm 濾膜除菌過濾發酵鹽類配方：鹽酸硫胺溶液、硫酸銨溶液、50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液、1 mmol/L IPTG 溶液、100 × 微量元素濃縮液。

種子液制備：從–80 ℃冰箱中取出菌種在生物安全柜中接入裝有 TB 液體培養基的具擋板搖瓶中。于恒溫振蕩器中37 ℃、150 r/min 條件下培養 15 h。

進行 3 瓶搖瓶平行實驗，菌體明顯增長后，每小時取樣一次，測量并記錄600值與 pH 值，監測菌體生長情況并繪制生長曲線。設置兩組不同種齡的菌體進行發酵罐培養。

發酵罐培養：種子液以 4% 的接種量接種于裝有 2.7 L 初始發酵培養基的 7 L 發酵罐中培養。系統控制發酵罐恒溫 37 ℃，通過調節攪拌轉速和空氣流速使溶氧百分數不低于 40。通過系統自動流加氨水，維持培養體系 pH 值在 7.0 左右。當菌體量快速增長，發酵培養基中的葡萄糖無法滿足菌體生長需要時，變指數-恒 pH 流加補料[12]。通過每小時取樣檢測菌體量與殘糖含量，反饋調節補料速度控制發酵液中殘糖含量在較低水平。在菌體生長中后期降溫至 25 ℃，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L 進行誘導。此時的菌體生長速度減慢，相應的降低補料速度。

菌體收集：當一段時間內的菌體量不再增加，停止發酵。收集發酵液用超大容量冷凍離心機進行離心，棄去上清液后保存在–80 ℃冰箱中。

1.2.5 微量元素差異對發酵生物量產出的影響 高壓滅菌、發酵罐培養以及菌體收集等方法同 1.2.4。種子液制備中，選擇培養時間 6 h。選擇安徽 A 公司吸潮和干燥批次以及南京 B 公司的三氯化鐵六水合物配制發酵培養基所需的 100 × 微量元素濃縮液，分別加入發酵罐培養。

1.2.6 發酵液殘糖含量對發酵生物量產出的影響 高壓滅菌和菌體收集等方法同 1.2.4。種子液制備中，選擇培養時間 6 h。接種入發酵罐發酵培養 9 h，600值達到 60 左右。進行降溫 IPTG 誘導后，根據殘糖的含量和菌體量，控制補料的流加速度。調節控制一組發酵罐發酵液的殘糖含量處于低水平（≤11.2 mmol/L），另一組發酵罐發酵液的殘糖含量處于高水平（≥ 11.2 mmol/L）[13]。

2 結果

2.1 種齡與菌體濃度的影響

進行 3 組搖瓶培養 15 h，3 h 后每小時取樣測定菌體生長濃度并繪制生長曲線（圖1）。從生長曲線可見，培養3 ～ 5 h 菌體生長快速，屬于對數生長期。培養 5 h 的600值均達到 3.0 左右。第 6 個小時開始，到培養結束階段的生長速度減慢。故選擇相同菌種分別搖瓶活化培養 6 h 與 12 h 后接入發酵罐進行發酵培養，每小時取樣測量600值，進行菌體生長情況監測，繪制生長曲線。

菌體搖瓶活化培養 12 h，接菌時菌體濃度600值為 3.8，菌體搖瓶活化培養 6 h，接菌時菌體濃度600值為 3.1。將此不同種子液接入發酵罐培養，所測菌體生物量產出有明顯差異。第 2 和 3 小時時，種齡為 6 h 的發酵生物量產出幾乎是種齡為 12 h 的兩倍。第 3 小時以后的生物量產出仍存在差距，但差距在減小。到 9 h，種齡為 12 h 的發酵600值達到 55.8，種齡為 6 h 的重組大腸桿菌發酵600值達到 64.4，差異較大。進行降溫 IPTG 誘導后，兩發酵罐均培養 29 h，種齡為 12 h 的發酵收菌600值為 137.6，種齡為 6 h 的發酵收菌600值達到 161.8，差異較大（圖2）。

2.2 微量元素差異的影響

為測試發生吸潮現象的三氯化鐵六水合物對重組大腸桿菌發酵生物量的產出是否有影響，選擇安徽A 公司從外觀性狀上觀測發生吸潮現象的 2021 年批次三氯化鐵六水合物和 2022 年批次的干燥三氯化鐵六水合物。將這兩批次的三氯化鐵六水合物分別配制發酵培養基，進行發酵罐發酵并繪制生長曲線（圖3A、3B）。為測試不同廠家的三氯化鐵六水合物對重組大腸桿菌發酵生物量的產出是否有影響，另選擇南京 B 公司的三氯化鐵六水合物配制發酵培養基，進行發酵罐發酵并繪制生長曲線（圖3C）。

三組氯化鐵六水合物配制時，溶解后從顏色外觀上觀測，無明顯差異。進行 0.22 μm 濾膜過濾時，用吸潮的三氯化鐵六水合物所配制的溶液，濾膜上過濾出更多的紅褐色雜質。過濾后的顏色外觀不存在明顯差異。

圖1 搖瓶培養重組大腸桿菌生長曲線

圖2 接種種齡分別為 12 h（A）和 6 h（B）的重組大腸桿菌發酵的生長曲線

三組發酵的生長曲線對比，每小時的生物量產出差距不大。培養 9 h，用吸潮批次發酵的600值達到 67，用干燥批次發酵的600值產出達到 64.4，用南京 B 公司批次發酵的600值達到 65，差距不大。IPTG 誘導后，吸潮批次的發酵收菌600值為 162.8，干燥批次的發酵收菌600值為 161.8。南京 B 公司批次的發酵收菌600值達到 184.8，高于安徽 A 公司的吸潮和干燥批次發酵600值。

2.3 發酵液殘糖含量的影響

調節控制一組發酵罐發酵液的殘糖含量處于低水平，另一組發酵罐發酵液的殘糖含量處于高水平。發酵結束，進行數據收集并繪制生長曲線（圖4）。

低水平和高水平殘糖含量的發酵生長曲線比對，兩者培養到 9 h 階段的生物量產出相近。第 9 小時，低水平組的發酵液600值為 59.8，高水平組的發酵液600值達到 59.9。

IPTG 誘導后根據殘糖的含量和菌體量，控制補料的流加速度。調節控制一組發酵液的殘糖含量處于較低的水平，另一組發酵液的殘糖含量處于較高的水平。發酵結束時，低水平組（≤ 11.2 mmol/L）收菌600值達到 141.4，高水平組（≥ 11.2 mmol/L）收菌600值為 84，差異較大。

3 討論

冀成法等[3]優化發酵工藝后發酵結果的穩定性和重復性較好，最終菌體密度600值均能達 79 以上。晏星辰等[5]采用變指數-恒 pH 法的策略發酵重組大腸桿菌，600值達到 97。遲雷等[6]基于人工神經網絡和遺傳算法，對重組大腸桿菌高密度發酵工藝進行優化，600值達到 125。本研究探究種齡、微量元素、殘糖含量 3 種因素對重組大腸桿菌發酵生物量產出的影響。

發酵前對種子預培養是為了獲得大量活力旺盛的對數生長期重組菌以縮短發酵延滯期，增加生產強度，并且可確立重組菌的生長優勢以減少染菌的可能性[14]。適宜的種齡應是菌體處于對數生長期的中后期[15]。將對數生長中后期的種子培養液接入發酵培養基可以保持很高的細胞活力，縮短發酵時間，并減少染菌的可能性。分析菌體搖瓶活化培養 15 h 繪制的生長曲線，第 6 小時是菌體生長的對數中后期，是所測菌體適宜的種齡。在發酵罐培養中，種齡為 12 h 和種齡為 6 h 的重組大腸桿菌生長速度差異明顯。在發酵周期為 29 h，收菌時菌體生物量600值差距 20 左右。在不存在發酵中其他未知影響因素干擾，通過實驗發酵對比，種齡對于發酵生物量產出存在影響，選擇合適的菌體活化時間有利于發酵生物量的提高。

圖3 不同三氯化鐵六水合物配制發酵培養基的重組大腸桿菌發酵的生長曲線（A：安徽 A 公司吸潮批次；B：安徽 A 公司干燥批次；C：南京 B 公司干燥批次）

大腸桿菌高密度發酵需要添加能促進重組菌生長及代謝產物形成的物質，三氯化鐵六水合物是發酵培養基中需要加入的微量元素[16]。測試三氯化鐵六水合物物料投入對發酵生物量產出是否有差異，選擇合適的供應商有利于后續發酵的工業化生產。吸潮批次的三氯化鐵六水合物所配制的溶液，濾膜上過濾出更多的紅褐色雜質。但與同廠家的該物料干燥批次所配制的發酵液比較，其每小時以及最終收菌時的生物量產出均差異不大（600值達到 160 左右）。選擇不同廠家的該微量元素所配制的發酵液，IPTG 誘導前菌體的生長曲線相似，每小時的生物量產出差距不大。但是，誘導后的生長曲線開始出現差距，在發酵收菌時南京 B 公司的微量元素組批次的發酵收菌600值達到 184.8，比安徽 A 公司的吸潮和干燥批次發酵600值高 20 左右。雖然本次發酵實驗中吸潮與干燥的三氯化鐵六水合物投入發酵的生物量產出沒有差距，但在藥品工藝中，吸潮問題仍是物料質量控制問題。在物料供應商的選擇時應注意物料批次間的穩定性，避免因物料吸潮的質量問題影響發酵結果[17]。不同廠家的三氯化鐵六水合物的質量存在差異，對發酵的生物量產出有一定的影響，選擇合適廠家的物料有利于后續發酵的工業化生產。

乙酸對細胞的生長和蛋白的表達有很大影響，超過一定濃度之后會抑制重組菌的生長，影響生物量產出和目的蛋白表達[18]。當發酵液殘糖含量長時間大于 11.2 mmol/L 時，菌體的生長速度較正常發酵速度慢，且最終收菌時生物量600值只達到 84，與正常發酵600值 141.4 存在較大差距。本研究對比發酵實驗表明，殘糖抑制作用會影響發酵生物量的產出，保證發酵液中殘糖含量處于低水平的狀態（≤ 11.2 mmol/L）有利于生物量的產出。

圖4 發酵液殘糖含量控制在不同水平的重組大腸桿菌發酵的生長曲線（A：殘糖含量控制在低水平，≤ 11.2 mmol/L；B：殘糖含量控制在高水平，≥ 11.2 mmol/L）

通過研究種齡、微量元素、殘糖含量 3 種因素對重組大腸桿菌發酵生物量產出的影響，優化小試工藝后的結果表明重組菌發酵周期 30 h 的600值可達到 160 左右。所以，改善影響條件和優化工藝后可顯著提高工程菌發酵的生物量產出，對將來提高生物類似藥產品的生產效率和經濟效益具有重要的實用價值。

[1] Zhang YH, Gao XL, Huang K, et al. Research progress in fermentation expression and metabolic regulation of recombinant. Food Drug, 2021, 23(1):85-91. (in Chinese)

張言慧, 高先嶺, 黃魁, 等. 重組大腸桿菌發酵表達及代謝調控研究進展. 食品與藥品, 2021, 23(1):85-91.

[2] Cheng JW, Wang SY, Yang Z, et al. Construction of N-acetylglucosamine-producing fermentation engineering bacteria based on Red homologous recombination technology. Pharm Biotechnol, 2020, 27(3):195-200. (in Chinese)

成珺瑋, 王蘇妍, 楊哲, 等. 基于Red同源重組技術構建N-乙酰葡萄糖胺發酵工程菌. 藥物生物技術, 2020, 27(3):195-200.

[3] Ji CF, Ma LN, Liu CQ, et al. High cell density fermentation of engineered E.coli expressing recombinant neutrophil inhibitory factor and hirulog hybrid. Chin J Bioprocess Eng, 2021, 19(3):250-255. (in Chinese)

冀成法, 馬魯南, 柳常青, 等. 重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌的高密度發酵. 生物加工過程, 2021, 19(3):250-255.

[4] Zhang H, Lin JL, Hu DX, et al. High-density fermentation ofto express 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase and efficient biosynthesis of caffeic acid. Chin J Biotechnol, 2022, 38(9): 3466-3477. (in Chinese)

張紅, 林金連, 胡定行, 等. 大腸桿菌高密度發酵表達4-羥基苯乙酸酯3-羥化酶及咖啡酸的高效生物合成. 生物工程學報, 2022, 38(9):3466-3477.

[5] Yan XC, Huang P, Wang XY, et al. High cell density cultivation offor the production of trehalose synthase. Chin J Bioprocess Eng, 2019, 17(4):385-391. (in Chinese)

晏星辰, 黃璞, 王鑫沂, 等. 高密度發酵重組大腸桿菌產海藻糖合成酶. 生物加工過程, 2019, 17(4):385-391.

[6] Chi L, Wang JY, Hou JC, et al. Artificial neural network-genetic algorithm-based optimization of high cell density cultivation of recombinantfor producing pullulanase. Food Sci, 2021, 42(10):73-78. (in Chinese)

遲雷, 王靜雨, 侯俊超, 等. 基于人工神經網絡和遺傳算法的普魯蘭酶重組大腸桿菌高密度發酵工藝優化. 食品科學, 2021, 42(10): 73-78.

[7] Chen WJ. Preliminary report on screening of liquid strain culture medium of lentinus edodes and its suitable inoculation period. Edible Fungi, 2020, 42(3):29-30, 55. (in Chinese)

陳文杰. 香菇液體菌種培養基篩選及適宜接種期試驗初報. 食用菌, 2020, 42(3):29-30, 55.

[8] Jagadabhi PS, Kaparaju P, V?is?nen A, et al. Effect of macro- and micro-nutrients addition during anaerobic mono-digestion of grass silage in leach-bed reactors. Environ Technol, 2019, 40(4):418-429.

[9] Wu SB. Study on the control method of acetic acid in the fermentation process of recombinant. Electronic J Clin Med Lit, 2019, 6(31):197. (in Chinese)

吳首標. 重組大腸桿菌發酵過程中乙酸的控制方法研究. 臨床醫藥文獻電子雜志, 2019, 6(31):197.

[10] Kole MM, Ward D, Gerson DF. Simultaneous control of ammonium and glucose concentrations infermentation.J Fermentation Technol, 1986, 64(3):233-238.

[11] Dorofeev DA, Artemenko EN, Devyatkina GA. Optimizing the method of determining Fusarium spp. biomass based on ergosterol content. Russian Agric Sci, 2002, (1):10-13.

[12] Yuan XF. Production of astaxanthin by high density fermentation of. Baoding: Hebei University, 2020. (in Chinese)

袁雪峰. 大腸桿菌工程菌高密度發酵生產蝦青素. 保定: 河北大學, 2020.

[13] Meng G, Wei AY, Jia HP, et al. Construction of a tdcD gene deletion strain ofand the study of its application in L-tryptophan fermentation process with high glucose tolerance. Bull Fermentation Sci Technol, 2015, 44(2):12-16. (in Chinese)

孟剛, 魏愛英, 賈慧萍, 等. 大腸桿菌tdcD基因缺失株的構建及其用于耐高糖L-色氨酸發酵的研究. 發酵科技通訊, 2015, 44(2):12-16.

[14] Cao XZ, Zhao YQ, Yang JG, et al. Screening of inoculum age and fermentation dynamics analysis of Agaricus blazei Murill. China Brewing, 2017, 36(4):114-117. (in Chinese)

曹新志, 趙迎慶, 楊建剛, 等. 姬松茸發酵種齡篩選及發酵動力學分析. 中國釀造, 2017, 36(4):114-117.

[15] Zhu XW, Wang ZJ, Li L, et al. Optimization of medium and feeding process for L-tryptophan production fermented by. Sci Technol Food Industry, 2020, 41(2):146-153. (in Chinese)

朱曉雯, 王澤建, 黎亮, 等. 大腸桿菌發酵產L-色氨酸培養基及補料優化. 食品工業科技, 2020, 41(2):146-153.

[16] Chen ZC, Wang JD, Xu QY, et al. Effects of trace elements and growth factors on L-phenylalanine fermentation. Food Fermentation Industries, 2022, 48(8):82-89. (in Chinese)

陳志超, 王金多, 徐慶陽, 等. 微量元素與生長因子對L-苯丙氨酸發酵的影響. 食品與發酵工業, 2022, 48(8):82-89.

[17] Sun XJ. Practice and improvement of API raw materials in drug registration. Chem Eng Des Commun, 2020, 46(7):212-213. (in Chinese)

孫小杰. 原料藥起始物料在藥品注冊中的實踐與改進. 化工設計通訊, 2020, 46(7):212-213.

[18] Noguer MC, Escudié R, Bernet N, et al. Populational and metabolic shifts induced by acetate, butyrate and lactate in dark fermentation. Int J Hydrogen Energy, 2022, 47(66):28385-28398.

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.012

吳玉水，Email：yswu@genohopebio.com

2023-02-27