桑黃-昆布雙向發酵菌質化學成分及抗腫瘤活性

劉佳，魏寶紅，，畢旺華，，楊文哲，楊雪，*，李欣，王長云，馬曉青，，胡淑曼

（1.中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室醫藥學院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266071）

腫瘤是目前嚴重威脅人類健康和生命安全的疾病之一。2019年我國癌癥中心數據統計報告顯示，全國每年惡性腫瘤發病約392.9 萬人，死亡約233.8 萬人，而且惡性腫瘤發病率還在持續上升[1]，尋找治療腫瘤的藥物迫在眉睫。目前，臨床上治療腫瘤的辦法主要有手術治療、化療、放療、免疫治療、分子靶向治療等。手術治療主要適用于良性腫瘤和未發生遠處轉移的惡性腫瘤；化療和放療這兩種治療方法都伴隨著藥物毒性，會產生嚴重的不良反應；雖然靶向治療和免疫治療在各種臨床環境中遠遠優于傳統療法，但它們仍然受到先天和后天耐藥機制的困擾，限制了許多患者的治療效果[2]。近些年來，從天然產物中發現越來越多的抗腫瘤成分，合理選用可輔助治療腫瘤的特殊癥狀和并發癥，不僅與西醫放化療配合有效，而且可單獨應用治療腫瘤[3-4]。

昆布是海帶科植物海帶（Laminaria japonicaAresch.）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kuromeOkam.）的干燥葉狀體，是大宗海洋中藥品種，具有軟堅散結、利水退腫、消痰功效[5]。勿日汗等[6]對昆布的應用方劑進行整理發現，含有昆布的方劑約有180 首，其中用于治療癭瘤病的方劑占總方數的40%，治癭瘤方中昆布的使用頻率為63.5%，因此，臨床上常用昆布的軟堅散結之功效對腫瘤進行干預治療[7]。目前昆布抗腫瘤研究主要集中在昆布多糖、巖藻黃質等有效成分，昆布多糖即褐藻膠是昆布發揮抗腫瘤作用的主要成分，褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannur-onic acid，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過1→4 糖苷鍵雜聚在一起組成[8]。研究表明，M 段、G 段是海洋藻類抗腫瘤的有效部位，目前發現褐藻膠寡糖抗腫瘤作用涉及多種機制，包括腫瘤細胞的增殖和轉移、免疫調節等[9]。褐藻膠寡糖具有天然無毒、對機體的副作用小等特點，已經成為目前研究的熱點。昆布利用傳統水提得到的昆布水提物中古洛糖醛酸和甘露糖醛酸得率偏低，其抗腫瘤活性IC50大多在300 μg/mL 以上，甚至達到1 mg/mL[10-11]。為提高昆布的資源利用率，本課題組借鑒槐耳-黃芪菌質、雷靈菌質的開發經驗，采用中藥雙向發酵技術，對昆布進行雙向發酵研究。中藥雙向發酵是指以藥用真菌為發酵菌種，以中藥材作為藥性基質，該基質在為真菌提供營養物質的同時，又與真菌在生長過程中產生的各種代謝產物相互作用、相互影響，使整個發酵具有“雙向性”[12]。

桑黃是銹革孔菌科真菌粗毛纖孔菌[Inonotus hispidus（Bull.）P.Karst.]的干燥子實體，是一種名貴的藥食兩用真菌，具有散結化飲、活血止血、健脾止瀉的功效[13]。在生物抗癌領域，桑黃是國際公認的最具抗癌功效的真菌之一[14]。

本研究利用昆布和桑黃配伍組合的抗腫瘤功效[15-16]，利用雙向發酵技術優化制備桑黃-昆布雙向發酵菌質，闡明菌質中有效成分含量的變化，并采用磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法測定桑黃-昆布雙向發酵菌質對人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞HeLa、人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的影響，初步評價桑黃-昆布雙向發酵菌質的抗腫瘤活性，以期提高昆布的抗腫瘤功效及利用率，為拓展其在藥食同源功能食品的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃：臨清清源正本生物醫藥科技有限公司；昆布：亳州市佰世信中藥飲片有限公司；L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、D-無水葡萄糖、D-半乳糖醛酸（純度均>98%）：中國食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽（純度均≥99%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；D-甘露糖醛酸、L-古羅糖醛酸（純度均為98%）：青島博智匯力生物科技有限公司；人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞HeLa、HUVECs：中科院上海細胞庫；RPMI 1640 培養液、DMEM高糖培養液、Mc-COY’S 5A 培養液：浙江森瑞生物科技有限公司；SRB（S1402）：上海生物工程有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：Merk 公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氯乙酸（tric-hloroacetic acid，TCA）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MQD-B1T 全溫振蕩培養箱：上海旻泉儀器有限公司；ZHJH-C1115B 垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；Aglient 1260Ⅱ型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；ME204E 萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL 冷凍高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HWS-26 水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；101-2AB 型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；N-1100 型旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；SpectraMax-i3 多功能酶標儀：上海艾研生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃-昆布雙向發酵體系的建立

1.3.1.1 培養基的配制

前期優化的桑黃最佳培養工藝為3%蔗糖、2%酵母浸粉、0.3%硫酸鎂、0.6%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸銅，在此基礎上添加一定量的昆布，進行桑黃-昆布雙向發酵。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，去皮洗凈后切小塊，沸水煮30 min后4 層紗布濾過，濾液加20 g 葡萄糖及15 g 瓊脂，定容至1 L。

液體種子培養基：蔗糖2%、酵母浸粉1%、硫酸鎂0.3%、磷酸二氫鉀0.6%。

基礎培養基：蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸鎂0.3%、磷酸二氫鉀0.6%、硫酸銅0.1%。

1.3.1.2 菌種活化

將保存的桑黃菌株接種于PDA 培養基上，每個平板接入1 塊體積約0.1 cm3的桑黃菌種，置于26 ℃培養箱中恒溫培養14 d，備用。

1.3.1.3 液體培養

于250 mL 錐形瓶裝入液體種子培養基100 mL，接入活化后的桑黃菌種4 塊，每塊約0.1 cm3，于28 ℃、160 r/min 的搖床條件下培養7 d，得桑黃液體菌種子。

1.3.1.4 桑黃-昆布雙向發酵菌質的制備

取粉碎后的昆布粉末4 g 置于250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 基礎培養基，攪拌均勻，放入121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，得雙向發酵培養基；待其冷卻至室溫，接種10 mL 桑黃種子液，在28 ℃，160 r/min的搖床條件下培養9 d，10 000 r/min 離心10 min，沉淀用蒸餾水洗滌2 次，合并上清液，即得桑黃-昆布雙向發酵菌質，濃縮后冷凍干燥，備用。

1.3.1.5 昆布水提物的制備

取4 g 粉碎后的昆布，加100 mL 蒸餾水，100 ℃回流提取1 h，提取2 次，合并兩次提取液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得昆布水提物，濃縮后冷凍干燥，備用。

1.3.2 化學成分含量測定

1.3.2.1 總糖含量測定

采用硫酸-蒽酮比色法測定總糖含量[17]。分別取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質精密稱定，加蒸餾水制成質量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，待測。精密吸取樣品溶液2 mL，迅速精密加入0.1%硫酸-蒽酮溶液6 mL，立即搖勻，沸水浴15 min，立即至冰浴中冷卻15 min，取出，于625 nm 波長處測定吸光度，根據葡萄糖標準溶液曲線計算其總糖含量。

1.3.2.2 單糖組成分析

標準品溶液的制備：取L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、D-無水葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-甘露糖醛酸、L-古羅糖醛酸標準品精密稱定，加水制成質量濃度為0.5 mg/mL 的混合標準品溶液，待測。取100 μL 上述混合標準品溶液，分別加入0.3 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各100 μL，混勻，至70 ℃恒溫水浴90 min，冷卻，加入100 μL、0.3 mol/L 鹽酸溶液中和。繼而加入500 μL氯仿，渦旋30 s，離心去除有機相，重復3 次。取水相，即得對照品溶液[18]。

供試溶液的制備：取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質精密稱定，加水制成質量濃度為5.0 mg/mL的待測樣品溶液，備用。精密吸取樣品溶液200 μL，加入2 mol/L 的TFA 溶液200 μL，封管后，置100 ℃恒溫烘箱5 h；精密吸取水解液200 μL，加入200 μL 甲醇，氮氣吹干，重復2 次。加入100 μL 水溶解，后續反應步驟同標準品溶液制備，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱采用日本半井公司COSMOSIL Packed 5 C18-PAQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）的色譜柱；流動相為0.1 mol/L KH2PO4-NaOH 緩沖溶液（A）和乙腈（B），18%B 等度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

各單糖組分相對含量分析：采用外標一點法進行計算，求得各單糖組分含量[19]。

1.3.2.3 總酚含量測定

采用福林酚比色法測定總酚含量[20]。分別取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質精密稱定，加蒸餾水制成質量濃度為5 mg/mL 的溶液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測。精密量取樣品溶液0.5 mL，加1.4 mol/L 的福林酚試劑0.5 mL，在1～8 min 內加入30 g/L 的Na2CO3溶液4 mL，45 ℃水浴中避光顯色112 min，在765 nm 處測溶液的吸光度，根據沒食子酸標準溶液曲線計算其總酚含量。

1.3.3 體外抑制腫瘤細胞增殖活性試驗

1.3.3.1 細胞培養

分別將人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞HeLa 用DMEM 高糖培養液培養，人乳腺癌細胞MCF-7 和HUVECs 用RPMI 1640 培養液培養，人結腸癌細胞HCT-116 用McCOY’S 5A 培養液培養，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，胰酶消化，傳代，保持細胞在良好的對數生長期。

1.3.3.2 檢測方法

處于對數生長期的人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞HeLa、HUVECs 分別以5 000 個/孔（180 μL/孔）接種于96 孔板，培養24 h 后，加入待測樣品20 μL，待測樣品分為溶劑對照組，陽性藥組（阿霉素），昆布水提物組和桑黃-昆布雙向發酵菌質組，陽性藥的終濃度為1 μmol/L，所有待測樣品終濃度100 μg/mL，每個濃度設3 個復孔，溶劑對照組加入等體積的無菌水。藥物作用72 h 后，每孔加入50%冰冷的三氯乙酸固定細胞，SRB 染色后，加入150 μL/孔的Tris 溶液，于540 nm 測定其吸光度。

腫瘤細胞增殖抑制率（I，%）按下列公式計算。

I＝[（A1－A2）/A1]×100

式中：A1為對照品在540 nm 處的吸光度；A2為給藥孔樣品在540 nm 處的吸光度。

1.4 數據統計及分析

所有結果以用平均值±標準差表示，并采用Excel和SPSS 軟件進行分析。采用T-test 統計分析，以P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總糖含量檢測結果

以葡萄糖為標準品，以吸光度對質量進行線性回歸，得回歸方程為y=0.010 6x+0.041 7（R2=0.999 9），曲線擬合性較好。測得昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質中總糖含量分別為（30.00±1.51）、（645.00±18.55）mg/g，表明在相同的昆布生藥量條件下，與昆布水提物相比，桑黃-昆布雙向發酵菌質總糖含量顯著升高（P<0.01）。推測原因可能為桑黃在發酵過程中不斷代謝產生的纖維素酶類、淀粉酶類物質分解昆布的細胞壁，促進昆布細胞中褐藻膠、褐藻淀粉、褐藻糖膠等物質的溶出，此外，昆布也促進了桑黃的生長、分裂和發育，從而提高了菌質中總糖的含量[21]。

2.2 單糖組成分析結果

混合標準品、昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）圖見圖1～圖3。

圖1 混合標準品單糖的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards of monosaccharides

圖2 昆布水提物的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Eckloniae Thallus water extract

圖3 桑黃-昆布發酵菌質的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product

由圖1～圖3 可知，昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質均含有甘露糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸和巖藻糖。

根據外標一點法計算得到昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質中單糖的含量，見表1。

表1 昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質單糖含量測定結果Table 1 Content of monosaccharides in Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product mg/g

由表1 可知，在相同的昆布生藥量條件下，昆布經桑黃發酵后，古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖含量顯著增加（P<0.01），分別達到（15.46±0.25）、（50.66±0.14）、（16.37±0.26）、（22.64±0.11）mg/g，推測原因可能為桑黃在昆布提供能量的情況下進行分裂、生長、繁殖和代謝，它可以針對昆布不同的成分構成的細胞壁結構，分泌各種胞外酶，如纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等使昆布中的有效成分如褐藻膠、褐藻淀粉、褐藻糖膠溶出，從而提高了菌質中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖的含量[22]。

2.3 總酚含量檢測結果

以沒食子酸為標準品，以吸光度（A）對質量進行線性回歸，得回歸方程為y=33.21x-0.094 9（R2=0.999 2），曲線擬合性較好。計算昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質中總酚的含量分別為（2.24±0.19）、（9.94±0.57）mg/g。結果顯示在相同的昆布生藥量條件下，與昆布水提物比較，桑黃-昆布雙向發酵菌質總酚的含量顯著升高（P<0.01）。推測原因可能與總糖含量升高的原因一致。

2.4 體外抑制腫瘤細胞增殖活性實驗結果

昆布水提物、桑黃-昆布雙向發酵菌質對A549、HCT-116、HeLa、HUVECs、HepG2、MCF-7 細胞增殖抑制率結果如表2所示。

表2 昆布水提物和桑黃-昆布雙向發酵菌質對細胞的增殖抑制率（n=3）Table 2 Inhibition rates of cell proliferation by Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product（n=3）%

如表2所示，昆布水提物、桑黃-昆布雙向發酵菌質和阿霉素對HUVECs、A549、HCT-116、HeLa 細胞增殖均表現出不同程度的抑制作用；對于HepG2 細胞增殖，只有昆布水提物和阿霉素表現出了抑制作用；而對于MCF-7 細胞增殖除阿霉素外，昆布水提物和雙向發酵菌質均未表現抑制作用，說明桑黃-昆布雙向發酵菌質具有一定的抗腫瘤作用。相同的昆布生藥量條件下，桑黃-昆布雙向發酵菌質較昆布水提物的抗腫瘤活性明顯提高，推測可能與桑黃-昆布雙向發酵菌質中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、巖藻糖等功能單糖含量升高有關。古洛糖醛酸、甘露糖醛酸是昆布中的特征性單糖，分子量低，水溶性強，穩定性高，本身無細胞毒性，對正常細胞無損傷；古洛糖醛酸、甘露糖醛酸與一般的抗腫瘤劑不同，是通過提高生物體對腫瘤細胞的防御能力和增強宿主免疫系統的功能來實現抗腫瘤作用而非直接作用于腫瘤細胞[23-25]；甘露糖則是通過干擾葡萄糖代謝阻斷腫瘤的能量來源，從而抑制腫瘤細胞的生長[26-28]，另外還可調控免疫檢查點分子PD-L1，達到抗癌作用[29]；巖藻糖可以參與細胞的識別與黏附、糖鏈的合成、腫瘤的發生與轉移等[30]。桑黃-昆布雙向發酵菌質在100 μg/mL 的濃度條件下，對HUVECs 的增殖抑制作用最強，達到了49.35%，HUVECs 來源于人臍靜脈，是一種具有干細胞潛能的內皮細胞，可以通過抑制HUVECs 增殖，減少或阻止新血管的生成，從而抑制腫瘤生長和轉移[31]。

3 結論

本研究以桑黃作為發酵菌株，昆布作為藥性基質，采用雙向液體發酵技術，在一定的優化條件下制備桑黃-昆布雙向發酵菌質，其中兩類活性成分總量分析結果表明，在相同的昆布生藥量情況下，發酵處理后的菌質中總糖及總酚含量均顯著增加，總糖含量由30.00 mg/g 升高到645.00 mg/g；總酚含量由2.24 mg/g升高到9.94 mg/g。發酵處理后的菌質中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖含量顯著增加，分別由2.64、8.96、1.13、17.76 mg/g 升高到15.46、50.66、16.37、22.64 mg/g。除此之外還進行了桑黃-昆布雙向發酵菌質對6 種細胞株增殖的影響研究，結果表明桑黃-昆布雙向發酵菌質在100 μg/mL 的濃度條件下，對HUVECs的增殖顯示出顯著的抑制作用，抑制率為49.35%，同時對A549、HCT-116、HeLa 細胞增殖也表現出不同程度的抑制作用，抑制率分別為21.88%、21.33%、7.67%，說明桑黃-昆布雙向發酵菌質具有一定的抗腫瘤作用。本研究為將桑黃-昆布發酵菌質開發功能食品提供了參考，后續還將進行桑黃-昆布雙向發酵菌質對HUVECs 增殖抑制是否呈劑量依賴性以及對HUVECs 抑制效果的穩定性等進行深入研究。