10℃下米象對糙米揮發性成分及前體物質的影響研究

田雪梅,郝佳容,周國鑫,劉興泉*,張 濤*

(1. 浙江農林大學食品與健康學院,杭州 311300;2. 國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037)

糙米是稻谷經礱谷機脫殼后而得到的全谷物顆粒米,由米糠層、胚、胚乳三部分組成,營養成分保存完好(張文昊等, 2013)。儲運過程中糙米極易受到溫度的影響,并伴隨有蟲害的發生。米象Sitophilusoryzae屬鞘翅目象甲科昆蟲,為世界性重要儲糧害蟲,其寄主范圍廣、繁殖力強、世代重疊和抗逆性強,對多種谷物及其加工品均可造成嚴重危害(楊悅玲等, 2021)。糙米因儲糧害蟲侵染或自身內源酶等作用會發生品質變化,包括脂質氧化和蛋白質降解反應,尤其是香氣會受到影響(崔素萍等, 2008; 張玉榮等, 2019)。糧食揮發性成分大多來自脂肪酸和氨基酸的氧化降解。有研究表明,食品中不飽和脂肪酸的氧化通常與異味有關。糙米脂肪酸會發生自動氧化、酶促氧化、光敏氧化等反應,賦予特殊的香氣,使其感官品質降低、風味劣化等(曹文明等, 2013)。氨基酸通過脫氫、脫羧反應生成酯類、醇類、酸類、醛類等化合物(穆德倫等, 2020)。有文獻報道,谷物中酮類化合物大多源于不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸降解或微生物氧化,通常具有清香氣味(張敏等, 2017)。脂肪酸、氨基酸的變化會直接影響到揮發性成分的變化。小米煮熟后游離脂肪酸含量增加,其中棕櫚酸對揮發物的形成沒有貢獻,而硬脂酸則通過脫羧產生十七烷,不飽和脂肪酸產生的揮發性成分最多(Lietal., 2021)。小麥在儲藏過程中,己醇、辛醇的相對含量與脂肪酸的變化有顯著相關性,十五烷、十六烷的含量與脂肪酸的變化相關性較顯著(趙丹,2012)。水果中異亮氨酸含量的升高可以促進2-甲基丁基類揮發性化合物的合成(Matich and Rowan, 2007)。Porretta等(1995)發現超高壓處理后游離脂肪酸被氧化形成了正己醛和己烯醛。

前人研究發現,10℃條件下害蟲的代謝率、體內水分以及酶活性會降低,儲藏前期仍可以活動,后期慢慢出現冷昏迷、活動受阻、不能取食,直至最終死亡(Jianetal., 2003)。10℃儲藏條件下糙米的脂肪酸值低于準低溫,生理變化過程受到抑制(陳永春等, 2019)。10℃被證實是在自然冷資源稻谷儲藏倉中稻谷的最佳儲藏溫度,可以有效保證稻谷的儲藏品質(施燦璨等, 2018)。曹俊等(2017)等對不同儲藏溫度下稻谷的揮發性成分進行檢測,結果表明在低溫(10℃)儲藏時,檢測到的稻谷揮發性成分最多。在相對濕度為85%、儲藏溫度為10～35℃條件下,稻谷的脂肪酸值、霉菌總數隨著儲藏溫度的增加而逐漸增高(周建新, 2011);儲藏溫度為10℃、20℃、30℃條件下,10℃條件下稻谷的脂肪酸值、霉菌總數最低,有利于保證稻谷的品質(陳銀基, 2016)。

與大米相比,糙米含有更多的蛋白質和脂質,所以氨基酸、脂肪酸氧化降解與揮發性成分的關系值得深究。有關米象侵染糙米的研究報道大多集中揮發性成分的變化規律,而脂肪酸、氨基酸、揮發性成分之間的聯系研究少有報道。因此,本試驗研究了10℃條件下米象侵染糙米后脂肪酸、氨基酸和揮發性成分的變化,篩選特征揮發性成分,分析了前體物質脂肪酸、氨基酸與揮發性成分變化之間存在的聯系,為進一步探討此過程中揮發性成分的變化機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米來自黑龍江省綏化市農戶2020年晚粳稻,品種為綏粳18號。利用礱谷機將稻谷脫殼得到的糙米樣品,過篩清除雜質,水分含量為13.4%。將該樣品密封于自封袋中,進行-4℃低溫處理一周,以消除樣品中有害生物的影響(牛永浩, 2015)。

米象以全麥為飼料,培養于實驗室恒溫恒濕培養箱30±1℃、RH80%±1%、24 h無光照條件下,連續飼養10代以上。挑選發育處于同一階段的2周齡成蟲作為試驗用蟲。

氫氧化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、石油醚(60～90℃)、濃硫酸、甲醇(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司;正己烷、2-辛醇(均為色譜純),阿拉丁公司;異硫氰酸苯酯(純度>97%)、17種氨基酸標準品(純度>98%)、2-辛醇(純度>99.8%),Sigma公司;甲醇、乙腈,均為色譜純,TEDIA公司;正構烷烴混合標準物質(C7～C40),上海安譜科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀:LC-20AT,配SPD檢測器和自動進樣器,日本島津公司;氣相色譜-質譜聯用儀:GCMS-QP2010PLUS,配AOC-20I自動進樣器,日本島津公司;聚二甲基硅氧烷/碳分子篩/二乙烯苯(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm萃取頭及SPME手動柄,美國Supelco公司;人工氣候箱:MGC-300H,上海一恒科技有限公司;旋渦振蕩器:QZ-866,海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1侵染實驗

根據蟲糧等級劃分及等級指標(GB/T 29890-2013),將200 g糙米裝入玻璃容器中混勻,接入20頭米象(雌雄比14∶1),紗網封口后放入10±1℃,RH80%±1%的培養箱中進行5周的侵染實驗。

1.3.2氨基酸組分的測定

稱取0.1000 g樣品置于水解管中,加入10 mL 6 mol/L鹽酸,振蕩使樣品均勻分布在溶液中,于110±1℃烘箱中水解24 h,水解結束后取出冷卻,取2 mL上清液于蒸發皿中在80±1℃下揮干溶劑,加入2 mL水溶解,過濾待衍生化。取1 mL樣液分別加入14%三乙胺乙腈溶液和1.2%異硫氰酸苯酯乙腈溶液各0.5 mL,混勻,室溫下靜置1 h后,加入0.1 mL 20%乙酸,混勻,再加入2 mL正己烷提取,漩渦混合器震蕩60 s后靜置10 min,萃取反應過剩的異硫氰酸苯酯,取下層清液經0.45 μm有機濾膜過濾后待HPLC分析。

流動相A:乙酸鈉緩沖液;流動相B:乙腈—水(4∶1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:40℃;進樣量:10 μL;洗脫程序如下所示(表1)。

表1 氨基酸洗脫程序

1.3.3脂肪酸組分的測定

參照許光利(2017)方法并適當修改,稱取2.50 g米粉于50 mL離心管中,加入25 mL沸程為60～90℃的石油醚,于42℃、300 W下超聲37 min,4 000 r/min離心10 min,將上清液于50℃旋蒸,分兩次每次加入1 mL正己烷溶解脂肪以及20 μL的1 mg/mL十一酸(內標),合并至具塞試管中,加入0.5 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL,漩渦30 s,70℃水浴20 min,再加入0.5 mol/L H2SO4-CH3OH溶液4 mL,漩渦30 s,70℃水浴10 min,最后加入0.2 g NaCl促進分層,加入2 mL蒸餾水、正己烷,漩渦均勻進行萃取,靜置分層,取上清液進行分析。

色譜柱為RXI-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);以高純氦氣為載氣;流速為1.0 mL/min,分流比:50∶1;進樣量1 μL;色譜柱升溫程序:柱溫100℃、以10℃/min升溫至170℃,保持1 min;以3℃/min升溫至230℃,保持12 min。離子源溫度200℃,接口溫度250℃,電離電壓70 eV,溶劑切除時間3 min,全掃描模式,掃描速度1 666 amu/s,掃描離子范圍45～500 amu。

1.3.4揮發性成分的測定

參照牛永浩(2015)方法并加以優化,稱取8 g糙米樣品于20 mL頂空瓶中并加入10 μL內標(2-辛醇,0.1 mg/mL)密封,于70℃水浴平衡30 min,萃取頭萃取吸附70 min,進樣口250℃條件下解析3 min。

色譜柱為RXI-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);以高純氦氣為載氣,流速為1.0 mL/min,不分流;色譜柱升溫程序:柱初溫為45℃,保持5 min,以5℃/min升溫至250℃,在250℃保持5 min。離子源溫度200℃,接口溫度250℃,電離電壓70 eV,溶劑切除時間2 min,全掃描模式,掃描速度1 666 amu/s,掃描離子范圍50～550 amu。

1.4 數據分析

所有指標均測定3次,結果用平均值±標準偏差表示。根據化合物保留時間計算保留指數,通過NIST08和NIST08s標準譜庫以及正構烷烴標準品對化合物進行定性分析,檢測出揮發性物質的峰面積與內標2-辛醇峰面積之比求得揮發性物質的絕對含量。按照檢測出脂肪酸的峰面積與內標物十一烷酸的峰面積之比求得各脂肪酸絕對含量。根據氨基酸標準曲線求得氨基酸的絕對含量。使用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA),以變量投影重要性值(Variable importance for the projection, VIP)大于1為指標篩選特征揮發性成分。使用SPSS 22.0 軟件進行Pearson相關性分析,并用TB tools軟件對相關性數據進行熱圖可視化。

2 結果與分析

2.1 不同侵染時間內米象侵染后糙米氨基酸、脂肪酸組分的變化

不同侵染時間內的糙米樣品中共檢測出17種氨基酸(表2),其中差異顯著的氨基酸有8種。氨基酸不僅影響了米飯的口感、味道,還可以通過脫氨反應、脫羧反應等酶促反應產生醇類、醛類等香氣物質(Zhaoetal., 2020)。糙米樣品含量較高的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸,半胱氨酸含量較低,這與曹志洋等人的研究結果一致(曹志洋等, 2009)。隨著侵染時間的延長,氨基酸含量呈現波動下降趨勢,說明米象蛀蝕糙米造成了質量的損失(Belloetal., 2000)。但是丙氨酸和脯氨酸等個別氨基酸在某個時間點,含量較侵染初期顯著上升,一方面是因為低溫脅迫誘導蛋白質發生水解,氨基酸合成增強,從而促進了部分氨基酸含量的增加,另一方面是因為害蟲產生的排泄物含有氨基酸(Thomsonetal., 2002),黏附在糙米表面,隨著磨粉進入,促進了氨基酸含量的增加。

不同侵染時間內的糙米樣品中共檢測出11種脂肪酸(表3),其中包括6種飽和脂肪酸、5種不飽和脂肪酸。糙米中含有豐富的油酸和亞油酸,這兩種不飽和脂肪酸的含量約占總含量75%,這與孫輝等人研究發現糙米含有豐富的不飽和脂肪酸結果一致(孫輝等, 2014)。隨著侵染時間的延長,脂肪酸含量呈現先上升后下降的趨勢,促進了糙米脂質氧化,同時脂肪酸發生氧化分解產生醇類、醛類、烴類等小分子物質(陶淑華等, 2020),導致風味品質及營養價值的降低。從第1周到第2周,糙米的脂肪酸含量均有所上升,其中亞油酸、油酸含量變化尤為明顯,較初始增加了約44%,說明前兩周米象尚未死亡,這與霍鳴飛等人(2017)的研究結果相似。隨著侵染時間的延長,第3周時米象蛀蝕程度達到頂峰,造成糙米數量損失,脂肪酸含量有所下降。侵染后期米象活動受阻、不能取食,逐漸死亡,糙米脂肪酸含量趨于平穩。

表3 不同侵染時間內米象侵染后糙米脂肪酸組分的變化(mg/100g)

2.2 不同侵染時間內米象侵染后糙米揮發性成分的變化

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用技術對不同侵染時間內米象侵染后的糙米揮發性成分進行對比分析,檢測到56種揮發性成分(表4),其中差異顯著的揮發性成分有29種。

表4 不同侵染時間內米象侵染后糙米揮發性成分的變化(μg/g)

檢測出的醛類化合物中,己醛和壬醛這兩種直鏈醛的含量最高,分別衍生自亞油酸和油酸(Sonetal., 2020),在10℃條件下,脂肪酸組分變化不明顯,這兩種醛類化合物差異不顯著。庚醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-癸烯醛、2-十一烯醛、十二醛存在顯著差異。庚醛是亞油酸氫過氧化物(LOOH)的分解產物以及脂氧合酶變化所引發的反應產物(Mathureetal., 2014),僅在侵染第5周時被檢測到,1-戊醇和二氫-5-十四烷基-2(3H)-呋喃酮衍生自亞油酸氧化,也僅在第5周時被檢測到(Choietal., 2019),說明侵染5周后糙米中的亞油酸發生氧化分解,產生特定的揮發性成分。(E,E)-2,4-壬二烯、(E)-2-癸烯醛、2-十一烯醛都是油酸的降解產物,通過脂肪酸的RO鍵的溶血裂變引起(Subramanian and Nakajima, 1997)。隨著侵染時間的延長,油酸降解程度的加深,其含量先增加后減少,在侵染第4周均達到最大。

醇類化合物是糙米中的第二大揮發性成分,僅次于醛類,被認為是不飽和脂肪酸氧化的副產物,是由醛進一步分解形成的(Concepcionetal., 2018)。在整個侵染周期內,1-己醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、壬醇一直被檢出,其中1-己醇含量最高,1-己醇是亞油酸的二次氧化產物,在侵染期間具有波動性,含量先下降后上升,庚醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、壬醇的含量無顯著性差異。庚醇、1-辛醇、壬醇分別呈現綠色香氣、蠟狀醛香、花香,10℃條件下的糙米保留了原有的香氣,變化不顯著。1-辛烯-3-醇是通過亞油酸首先通過酶催化轉化為10-氫過氧化物,然后通過內在裂解酶將10-羥基過氧化物分解得到(Lam and Proctor, 2003; Zhouetal., 2003),10℃條件下代謝途徑的酶活性變化不大,因此侵染期間內差異不顯著。

酮類化合物具有水果、草本香氣,是糙米香氣的重要貢獻者。3,5-辛二烯-2-酮是不飽和脂肪酸的主要脂質氧化產物之一,曾被認為是脂質氧化的指示劑(Sonetal., 2020),隨著侵染時間的延長,含量顯著上升再下降,其它酮類化合物無顯著差異。香葉基丙酮具有花香,是合成維生素E和異植物醇的重要中間體(劉先章, 1997)。6-甲基-5-庚烯-2-酮是糙米中有效的芳香活性化合物,曾被鑒定為發黃大米中的特征揮發物,與糖酵解途徑的丙酮酸有關(Liuetal., 2021),這兩種化合物在整個侵染周期內差異不顯著,說明了在10℃條件下糙米自身代謝活動受到抑制,導致揮發性成分變化不顯著。

糙米的大部分酯類化合物在不同侵染時間內差異顯著,其中棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯是高級脂肪酸的乙酯衍生物,其含量的變化可能與脂氧合酶途徑有關。根據文獻報道,酯類化合物是通過醇和?；o酶A之間的酯化反應產生,來自脂肪酸脂氧合酶途徑和氨基酸代謝,或者通過醛的酯化反應生成(Zhouetal., 2003),因此脂肪酸和氨基酸的變化導致酯類化合物差異顯著,但究其每個化合物產生的途徑還未明確。

米象侵染后糙米的部分烴類化合物存在顯著差異,正十三烷、正十六烷、正十七烷這類烷烴化合物屬于脂質降解產物(Verma and Srivastav, 2020),侵染周期內十七烷差異顯著,說明10℃條件下米象侵染對脂質影響不大。此外害蟲侵染過程中脫落的表皮脂質,被人證實含有正構烷烴,直鏈烯烴(Howard, 2001; Prasanthaetal., 2015),也是造成烴類化合物含量差異顯著的潛在原因。

2.3 特征揮發性成分的篩選

根據揮發性成分組成和含量,對不同侵染時間內糙米揮發性成分進行偏最小二乘法-判別分析,得到PLS-DA模型得分圖(圖1-a),不同侵染時間的各樣本分別聚集在5個不同區域,聚類趨勢良好,不同侵染時間的樣品明顯區分。所有樣品的相似度均在95%的置信區間內(圖1-b),存在聚類趨勢,未發現離群樣品點。本實驗建立的PLS-DA模型有良好的擬合參數,其中R2(X)=0.894、R2(Y)=0.976、Q2=0.833,說明模型的解釋性和預測性好,無過度擬合。

圖1 不同儲藏時間內米象侵染后糙米揮發性成分的PLS-DA模型得分圖(a)和Hotelling T2分布圖(b)Fig.1 PLS-DA scores of volatile components of brown rice after Sitophilus oryzae infestation at different storage times(a)and Hotelling T2 distribution diagram(b)

通過PLS-DA分析,共篩選到18種VIP值大于1的揮發性成分,可以作為低溫儲藏期間米象侵染糙米的特征揮發性成分(表5)。1-十一醇、1-戊醇、二氫-5-十四烷基-2(3H)-呋喃酮和庚醛均是脂質氧化的產物,它們的含量與侵染時間呈正相關,庚醇含量與之呈負相關。一般認為,糙米的陳化劣變過程,主要就是糙米中的脂類水解為脂肪酸,脂肪酸再進一步氧化為醛、酮類物質的過程(賀梅等, 2007)。因此,隨著侵染時間的延長,糙米中的脂肪酸開始氧化分解,促進了這些產物的生成或減少。

2.4 相關性分析

本研究表明,十七烷酸和木蠟酸分別與6種特征揮發性成分顯著相關(圖2)。庚醇與油酸呈顯著正相關(P<0.05),與硬脂酸、山俞酸呈顯著負相關(P<0.05),與木蠟酸呈極顯著負相關(P<0.01)。丙氨酸和脯氨酸是與特征揮發性成分相關性最高的氨基酸組分,分別與4種、5種特征揮發性成分顯著相關。鄰苯二甲酸二異丁酯與丙氨酸極顯著負相關(P<0.01),與亮氨酸顯著負相關(P<0.05),與脯氨酸顯著正相關(P<0.05)。十五烷酸甲酯與脯氨酸極顯著負相關(P<0.01),與蘇氨酸顯著負相關(P<0.05),與丙氨酸顯著正相關(P<0.05)。

圖2 糙米特征揮發性成分與脂肪酸(a)、氨基酸(b)含量的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of characteristic volatile components with fatty acids(a) and amino acids(b) contents in brown rice注:*顯著相關(P<0.05);**極顯著相關(P<0.01)。Note: * meant significant correlation (P<0.05); ** meant extremely significant correlation (P<0.01).

3 結論與討論

脂肪酸的氧化降解是揮發性成分產生的關鍵,脂肪酸合成揮發性成分的途徑有3種:α-氧化、β-氧化和脂氧合酶途徑,其中不飽和脂肪酸氧化分解生成氫過氧化物,氫過氧化物繼續氧化分解生成醛類、酮類、醇類、烴類等揮發性成分(吳娜, 2017)。本研究發現,油酸與庚醇呈顯著正相關(P<0.05),相關系數為0.594,這是由于油酸是不飽和脂肪酸,在儲藏過程中發生過氧化而形成過氧羥基脂肪酸,裂解形成醛類或烯醛類化合物,醛類化合物經酶催化形成相應的醇類(Dixon and Hewett, 2000)。據文獻報道,不飽和脂肪酸中的亞油酸、油酸是重要的香氣前體物質。隨著油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸含量增加,蘋果的香氣含量也增加(Song and Bangerth, 1996)。獼猴桃中風味前體物質亞麻酸、亞油酸的分解速率降低,使得酯類化合物的含量保持在較低的水平。

氨基酸是香氣物質代謝途徑中的前體物質,氨基酸通過脫氨、脫羧等反應形成了酸類、醇類、醛類、酯類等揮發性成分(梁奕等, 2021)。本研究發現,氨基酸與酯類化合物相關性較高。這是由于氨基酸通過轉氨基作用形成支鏈酮酸,脫羧或脫氫后生成支鏈醛和?；o酶A,在醇脫氫酶和醇?；D移酶的催化下形成支鏈酯類香氣物質;由支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸代謝衍生形成的醛、醇和酯類是構成香氣的重要組分。香蕉中亮氨酸可以轉化為3-甲基醇類和酯類物質;番木瓜、草莓中支鏈的醇類和酯類化合物產生的前提物質是纈氨酸、丙氨酸;纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸被認為是它們是合成蘋果中揮發性化合物的重要組成(裴龍英, 2018)。有報道表明蘋果果實中氨基酸含量的變化影響支鏈揮發性化合物的釋放。添加氨基酸使蘋果和甜瓜果實增加相應支鏈揮發性化合物的產生(Gondaetal., 2010; Espinoetal., 2016)。水果中的酯類化合物通常來自氨基酸的代謝,相應的醛類是氨基酸代謝過程中的關鍵中間體,由脫羧和脫氨基形成反應,接著醛還原為相應的醇。在甜瓜中,脯氨酸、亮氨酸甲硫氨酸等氨基酸被代謝成數十種揮發化合物,賦予甜瓜獨特的香氣(Gondaetal., 2013; Gondaetal., 2018)。這些結果與本研究結果相似。

本研究探討了10℃條件下米象侵染5周內糙米揮發性成分、氨基酸、脂肪酸的變化以及它們之間的相關性。利用GC-MS技術和HPLC技術分別對脂肪酸和氨基酸進行分析,發現米象侵染過程中糙米的氨基酸呈現波動下降的趨勢,脂肪酸呈現先升高后降低的趨勢,表明糙米中的脂質和蛋白質發生了氧化與降解。利用HS-SPME-GC-MS技術對不同侵染時間內米象侵染后糙米揮發性成分進行分析,醛類、烴類、醇類和酮類等化合物的含量呈現顯著性差異(P<0.05)。通過對不同侵染時間內糙米揮發性成分進行偏最小二乘法-判別分析,得到18種特征揮發性成分,根據特征揮發性成分和脂肪酸、氨基酸的相關性分析得出,庚醇、鄰苯二甲酸二異丁酯與油酸、亞油酸、丙氨酸、亮氨酸含量變化呈一定的相關性,說明在10℃條件下,米象仍存在緩慢的生命活動,促進了糙米氨基酸和脂肪酸的氧化降解,進而對揮發性成分的形成產生顯著影響,但揮發性成分變化的相關機理還需進一步探究。