氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲生長發育和繁殖的影響

韓文素,李 健,高景林*,李 翔,鐘義海,王釋婕,趙 珊

(1. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,?？?571101;2. 華中農業大學動物科學技術學院,武漢 430070;3. 中國熱帶農業科學院蜂業技術研究中心,?？?571101)

蜂巢小甲蟲AethinatumidaMurray屬鞘翅目Coleoptera露尾甲科Nitidulidae,是一種完全變態寄生在蜂群內的雜食性害蟲,是侵害蜜蜂的六大重要病原體之一(World Organisation For Animal Health, 2019),也是侵染我國蜜蜂的重要檢疫性害蟲(中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄,2020)。該蟲原分布于非洲南部撒哈拉沙漠以南地區,在當地危害性極小(Neumannetal., 2004)。1998年首次在美國的佛羅里達洲發現該蟲危害蜂群,并造成了300多萬美元的經濟損失(Ellisetal., 2002)。到2003年,該蟲遍及美國的30多個洲,引起了大量的蜂群飛逃和死亡(Hood, 2004; Kangaetal., 2021)。當前,蜂巢小甲蟲已擴散到除南極洲之外的所有大陸(Neumannetal., 2016),在我國的廣東(趙紅霞等,2018)、海南(鐘義海等,2019)和廣西(蜜蜂產業行業內通報)相繼發現該蟲危害蜂場并呈嚴重的擴散蔓延態勢。

蜂巢小甲蟲成蟲入侵蜂群后,在巢框縫隙內聚集、交配和產卵;其成蟲和幼蟲均可取食蜂蜜、花粉、蜜蜂幼蟲、蛹(Ellisetal., 2002; Neumannetal., 2004);幼蟲在覓食過程中在蜂巢內到處挖洞,破壞巢房,同時傳播病原菌(如Paenibacilluslarvae)(Sch?feretal., 2010),病毒(如蜜蜂殘翅病毒Deformedwingvirus、克什米爾病毒Kashmirbeevirus)(Eyeretal., 2009;Nanettietal., 2021)和蜜蜂寄生蟲(Lotmariapassim、Crithidiabombi)(de Landaetal., 2020)使蜜蜂幼蟲感病;還可攜帶酵母菌Kodamaeaohmeri使蜂蜜發酵,并散發出腐臭氣味,從而失去商品價值(Cornelissenetal., 2019)。蜂巢小甲蟲成蟲可存活數月,擴散飛行能力非常強,一頭雌蟲一生可產卵2000多粒(Papachetal., 2020),可在不同的蜂群間互相擴散,世代重疊。

盡管蜂巢小甲蟲造成了巨大的經濟損失,但當前還沒有有效的綠色防控措施?；瘜W殺蟲劑依然是當前防治蜂巢小甲蟲的主要手段(Kangaetal., 2012; Kangaetal., 2021)。國外長期使用蠅毒磷(Coumaphos),氟氰胺菊酯(Fluvalinate)防治蜂巢小甲蟲。據報道,蜂巢小甲蟲對蠅毒磷已產生了43.7倍的抗藥性,對氟胺氰菊酯產生了5.4倍的抗藥性(Kangaetal., 2021)。蜂箱內用藥比較困難,一是高毒農藥會造成蜜蜂農藥中毒,二是蜂蜜中農藥殘留也是令人擔憂的食品安全問題。筆者對海南蜂場進行蜜蜂病蟲害的普查過程中發現蜂農采用氯蟲苯甲酰胺進行蜂巢小甲蟲的防治,具有良好的控制效果。

氯蟲苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)是新型鄰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑,作用于魚尼丁受體(Ryanodine receptor),具有高效、低毒、對其它類型殺蟲劑無交互抗性等特點,主要用于農業害蟲防治(楊桂秋等,2012)。但隨著氯蟲苯甲酰胺的推廣使用,一些重要農業害蟲如甜菜夜蛾Spodopteraexigua、小菜蛾Plutellaxylostella、二化螟Chilosuppressalis等均對氯蟲苯甲酰胺產生了較高水平的抗性(支昊宇等,2021)。昆蟲抗藥性的產生與農藥產生的亞致死作用相關。如田間昆蟲長期處于殺蟲劑的低劑量選擇壓下,抗藥性或耐藥性強的個體存活或繁殖的機會較大,就有利于抗藥性能力的積累和發展(韓文素等,2011)。伴隨著蜂巢小甲蟲的爆發,蜂農施用氯蟲苯甲酰胺的劑量因防止蜜蜂中毒不會太高,但頻率會相應增加。這樣蜂巢小甲蟲長期處于氯蟲苯甲酰胺低劑量的選擇壓下,必然對氯蟲苯甲酰胺的敏感性逐漸降低。本研究測定了氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲生長發育和繁殖的影響,旨在指導蜂農科學用藥,以減少過度使用殺蟲劑帶來的蜂產品污染,同時為有效防治蜂巢小甲蟲提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼養

供試蜂巢小甲蟲采自海南省瓊中縣吊羅山區域內蜂場,帶回實驗室隔離養蟲室內飼養。飼養方法參照Neumannetal.(2013)的方法,蜂巢小甲蟲成蟲和幼蟲均用蜂糧(含蜂蜜、花粉、蛋白質)飼喂。飼養條件為:溫度27±1℃,相對濕度60%±10%,未成熟幼蟲黑暗無光照約2周;老熟即將化蛹的幼蟲,自然光照14 h,持續1周,以便老熟幼蟲離開食物入土化蛹,隨后無光持續約20 d;羽化后的成蟲,自然光照14 h,成蟲產卵孵化為幼蟲后,再黑暗飼養,周而復始。

1.2 供試藥劑

氯蟲苯甲酰胺96%原藥,由海南博士威農用化學有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲幼蟲亞致死劑量的測定

采用飼料混毒法進行幼蟲的毒力測定(IRAC,2011)。使用95%丙酮將氯蟲苯甲酰胺原藥配置成最大溶解度為3.446 g/L的母液,備用。試驗前,用丙酮將母液稀釋成2.5、5、10、20、40和80 μg/mL的系列試驗濃度。每濃度取0.5 mL藥液與0.5 mL的蒸餾水混合,空白對照采用0.5 mL丙酮與0.5 mL的蒸餾水,然后將混勻的藥液放入1 g蜂糧拌勻,配置成最終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/g的混毒蜂糧。將配置好的蜂糧放入直徑6 cm且墊有一層濾紙的培養皿內,接入大小一致剛剛進入3齡的幼蟲。每個濃度重復3次,每個重復供試10頭幼蟲,將各處理放入溫度27±1℃,相對濕度60%±10%,無光照的暗室內,48 h后統計死亡率。記錄結果時,用毛刷輕輕推動不動的幼蟲,等待一段時間,若幼蟲仍沒有反應則視為死亡。數據用SPSS 17.0軟件處理,計算LC50,LC10、LC25和毒力回歸方程的斜率(b)。

1.3.2氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲的亞致死效應

使用丙酮配置氯蟲苯甲酰胺濃度為LC10和LC25的藥液,對照為不含殺蟲劑的丙酮溶液,分別放入1 g蜂糧內混勻,置于培養皿內,再接入剛剛蛻皮的3齡幼蟲,放置于暗室內。每個濃度10次重復,每重復處理10頭幼蟲。48 h后將存活幼蟲放入無毒的2 mL離心管中,采用無毒蜂糧單頭飼養。對離心管進行編號,每日觀察幼蟲的生長發育情況,直至其變成老熟幼蟲。由于蜂巢小甲蟲在土里化蛹的特性,將快要化蛹的幼蟲放入裝滿沙土(高溫滅菌,濕度為10%)的50 mL離心管中供其化蛹。稱量入土前幼蟲的質量和初出土成蟲的質量,判斷出土成蟲的雌雄,計算雌雄比。取單只雌蟲和單只雄蟲放入含無毒蜂糧和黑色塑料膜的50 mL離心管中配對,置于養蟲室內飼養。每日觀察蜂巢小甲蟲的產卵情況,兩個月以后(從雌雄配對開始算起)停止記錄。收集各個處理組雌蟲產卵期前10 日內產的卵(包括卵塊和單卵),將其分為平等的三份作為3個重復,每個重復不少于70 粒卵,將卵放在消過毒的培養皿中放入光照培養箱,待卵孵化后測其孵化率。記錄孵化數時,將沒有孵化的卵算作死亡。

1.4 數據統計與分析

采用單因素方差分析(ANOVA)研究氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲各個階段的存活率、性別比例、漫游期幼蟲重和初羽化成蟲重以及子代卵孵化率的影響。每處理間的差異顯著性采用Tukey’s HSD法(P< 0.05)。存活率、孵化率在方差分析前進行反正弦平方根轉換,以滿足方差齊性。采用Morris-Watt提出的公式計算種群趨勢指數(I):I=S1·S2·S3……Sn·P♀·Fm(Watt, 1961; Morris, 1963)。式中,S1,S2,S3……Sn為生命表中各發育階段的平均存活率,P♀為雌蟲占成蟲總數的百分率,Fm指實際平均產卵量,Fm=F·PF,F為雌蟲最大產卵量,PF為卵的實際產出率。I=1,表明下代種群數量與上一代持平;I>1時,表明下代種群數量增加;I<1時,表明下代種群數量減少。數據統計分析采用SPSS 17.0軟件,作圖采用SigmaPlot 12.0軟件,數據均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲的亞致死劑量

根據室內生物測定的結果,氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲幼蟲48 h的LC50、LC25和LC10分別為5.193、2.865和1.678 μg/g(表1),選取LC25和LC10兩個濃度做亞致死效應研究。

表1 氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲3齡幼蟲的致死中量和亞致死劑量

2.2 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲幼蟲存活率和蛹羽化率的影響

氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理蜂巢小甲蟲 3齡初幼蟲后,LC25處理組蜂巢小甲蟲的存活率為76.00%±4.52%,顯著低于對照組;LC10處理組蜂巢小甲蟲的存活率與對照組相比無顯著性差異。LC25和LC10處理組蜂巢小甲蟲蛹的羽化率與對照組相比均無顯著性差異(表2)。

表2 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲幼蟲存活率和羽化率的影響

2.3 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲幼蟲和蛹發育歷期的影響

蜂巢小甲蟲3齡初幼蟲經氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理后,對幼蟲和蛹的生長發育影響結果見表3。對照組幼蟲的發育歷期為8.00±0.00 d,LC10和LC25處理組蜂巢小甲蟲幼蟲的發育歷期明顯延長,為8.27±0.06 d和8.36±0.08 d,分別延長了3.38%和4.50%,但兩處理組間無顯著性差異。LC10處理組雌蛹的預蛹+蛹期為26.82±0.20 d,雄蛹的預蛹+蛹期為27.00±0.23 d,LC25處理組雌蛹的預蛹+蛹期為29.59±1.31 d,雄蛹的預蛹+蛹期為28.78±1.14 d,相對于對照組的24.27±0.10 d和25.65±0.13 d,均顯著延長,且分別延長了10.51%、21.92%和5.26%、12.20%,兩處理組間存在顯著性差異。LC10和LC25處理組漫游期幼蟲體重、初羽化雌蟲重和初羽化雄蟲重分別為124.67±1.71 mg、82.75±1.35 mg、93.03±2.41 mg和127.59±2.21 mg、88.10±1.44 mg、93.93±2.35 mg,相對于對照組的147.45±1.55 mg、105.47±1.28 mg、112.44±1.28 mg均顯著降低,

表3 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲幼蟲和蛹發育歷期的影響

且分別減輕了15.45%、21.54%、17.26%和13.47%、16.47%、16.46%。LC10和LC25處理組的雌性比例分別為57.23%±3.96%和54.49%±4.34%,與對照組的59.29%±4.23%相比,無顯著性差異。

2.4 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲繁殖的影響

蜂巢小甲蟲雌雄配對后在第6天出現了第一個產卵高峰期,隨后大致在第20天、40天和 55天出現其余重疊的產卵峰(圖1)。各組的每日產卵量趨勢近乎相同,但有所差別。對照組和LC10處理組的每日單雌產卵量的峰值高度重疊,數目較多。而LC25處理組的每日單雌產卵量峰值相對較少,在第6天時峰值高于對照組和LC10處理組,其余時間均低于其它兩組。各組產卵量雖不穩定,但從圖中可看出LC25最高峰與最低峰相差最大,受到殺蟲劑影響較大。

圖1 亞致死劑量氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲每日單雌產卵量的影響Fig.1 Effects of chlorantraniliprole at different dosages on the number of eggs laid by per female per day of Aethina tumida

LC10和LC25處理組蜂巢小甲蟲雌蟲的產卵前期分別為7.96 d和7.47 d,顯著低于對照組的20.32 d(表4)。雌雄配對后,對照組、LC10和LC25處理組60 d內的平均產卵量分別為142.63±27.58粒、151.38±44.19粒和100.79±22.20粒。與對照組相比,LC10和LC25處理組的蜂巢小甲蟲產卵量分別增加了6.31%和減少了29.33%,但各組間并無顯著性差異。值得注意的是,LC25處理組在5～7 d平均產卵量顯著高于對照組,在18～19 d顯著低于LC10處理組,在40～41 d顯著低于對照組。各組卵的孵化率相比,對照組、LC10處理組和LC25處理組的孵化率分別為71.98%、81.04%和74.11%,無顯著性差異。

表4 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲繁殖力和卵孵化率的影響

2.5 暴露于氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量下的蜂巢小甲蟲實驗種群生命表

實驗種群生命表的分析結果顯示(表5),與對照組相比,氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲的種群增長具有一定的抑制作用。LC10和LC25處理組的種群趨勢指數與對照組相比分別降低了22.49%和67.27%,這與氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量降低蜂巢小甲蟲各期的存活率和成蟲的繁殖力有關。但本研究中LC10和LC25處理組實驗種群的種群趨勢指數遠遠大于1,表明暴露于氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量下的蜂巢小甲蟲種群均處于增長態勢,且氯蟲苯甲酰胺暴露的劑量越低,蜂巢小甲蟲的種群趨勢指數越接近于對照。

表5 暴露于氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量下的蜂巢小甲蟲實驗種群生命表

3 結論與討論

近年來,蜂巢小甲蟲呈嚴重的全球蔓延態勢(Cornelissenetal., 2019),國外對蜂巢小甲蟲的防治研究較多,物理、化學、生物的方法均有報道,但使用最為普遍的仍是化學殺蟲劑。當前,美國佛羅里達州的蜂巢小甲蟲種群已對有機磷類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生了抗藥性,因此急需篩選其它類型殺蟲劑治理蜂巢小甲蟲(Kangaetal., 2021)。我國蜂農在防治蜂巢小甲蟲時,多使用防治蜜蜂害蟲巢蟲的常用藥劑氯蟲苯甲酰胺(秦裕本,2018)。本研究結果表明,氯蟲苯甲酰胺對蜂巢小甲蟲3齡初幼蟲的LC50為5.193 μg/g,說明氯蟲苯甲酰胺對非靶標害蟲蜂巢小甲蟲具有一定的生物活性。隨著氯蟲苯甲酰胺在農業上的廣泛施用,已造成一些重要農業害蟲產生了抗藥性。此外,蜂巢小甲蟲基因組測序表明,其涉及解毒殺蟲劑和適應不同食源的幾個基因家族的拷貝數增加(Evansetal., 2018),說明蜂巢小甲蟲對氯蟲苯甲酰胺抗性發展的風險較高。

亞致死效應是指由不能直接殺死害蟲的低劑量殺蟲劑所引起的一種應激性反應。殺蟲劑的亞致死劑量可以影響害蟲的生長發育、生態行為、生理生化及抗藥性發展等多方面,并對不同害蟲的生長發育和繁殖作用存在一定的差異。這種由殺蟲劑引起的亞致死效應可以持續影響下一代甚至多代(Galvanetal., 2006; Hanetal., 2012)。本研究使用氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量LC10(1.678 μg/g)和LC25(2.865 μg/g)處理蜂巢小甲蟲3齡幼蟲后,與對照組相比,LC10和LC25處理組幼蟲和蛹的發育時間顯著延長,其中蛹的發育還存在明顯的劑量效應。此研究結果與氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量延長梨小食心蟲Grapholitamolesta(庾琴等,2018)、桃小食心蟲Carposinasasakii(劉宴弟等,2021)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Laietal., 2011)、白背飛虱Sogatellafurcifera(楊洪等,2012)的發育歷期結果相似。LC10和LC25處理組入土前幼蟲重和羽化后成蟲重明顯低于對照組,這可能是氯蟲苯甲酰胺抑制了蜂巢小甲蟲幼蟲的取食,或者取食后獲得營養一部分用于應付殺蟲劑的解毒代謝,從而改變了其營養狀況。

蜂巢小甲蟲成蟲可存活數月,一生可交配多次(de Guzmanetal., 2015),本研究發現成蟲在60 d內可出現多個產卵高峰期。LC10和LC25處理組蜂巢小甲蟲的產卵前期顯著低于對照組,LC25處理組蜂巢小甲蟲在60 d內的每雌產卵總和有所下降,但卻無顯著性差異。值得注意的是,進一步分析每日單雌產卵量,發現5～7 d時,LC25處理組顯著高于對照組,說明氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲首次產卵時具有一定的刺激繁殖作用。此研究結果不同于氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量顯著降低小菜蛾(Hanetal., 2012)、白背飛虱(楊洪等,2012)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Zhangetal., 2013)、桃小食心蟲(劉宴弟等,2021)等雌蟲的產卵量。據Fujiwara研究報道,藥劑的亞致死劑量對害蟲的整個發育階段的影響是不一樣的,可能對某一發育階段造成一定的刺激作用,而對另一發育階段起到抑制作用(Fujiwaraetal., 2002)。

綜上所述,氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量延長蜂巢小甲蟲的發育歷期,尤其是體現在預蛹和蛹期上,這可能與昆蟲的自我補償有關。在繁殖方面,LC25處理組蜂巢小甲蟲的60 d產卵總量與對照相比呈下降趨勢,但需要注意的是,在第一個產卵高峰時,顯著高于對照組,出現這種情況的原因有待深入研究。氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量縮短蜂巢小甲蟲的產卵前期,刺激蜂巢小甲蟲初次產卵量增加的現象,可能會造成蜂巢小甲蟲生活史縮短,繁殖代數增加,世代重疊。若蜂巢小甲蟲連續暴露在氯蟲苯甲酰胺的亞致死劑量下,無疑會誘導蜂巢小甲蟲抗藥性增強,種群大暴發,從而擴散到無疫區。雖然本研究表明氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對蜂巢小甲蟲處理代的種群增長具有一定的抑制作用,但其種群趨勢指數仍遠遠大于1,表明蜂巢小甲蟲種群仍處于增長趨勢。因此,需要進一步監測蜂巢小甲蟲對氯蟲苯甲酰胺的抗性發展,以及研究抗性產生的機制,以期為氯蟲苯甲酰胺防治蜂巢小甲蟲的合理應用提供理論基礎。此外,應該研發氯蟲苯甲酰胺蜂箱內外施用的新方法,最大限度的減少對蜜蜂的毒性影響。