草地貪夜蛾高致病力綠僵菌菌株的篩選與鑒定

趙建偉,丁雪玲,鄭 宇,趙金鳳,姚鳳鑾,盧學松,何玉仙*

(1. 福建省農業科學院植物保護研究所,福建省作物有害生物監測與治理重點實驗室,福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心,福州 350013;2. 福建農林大學植物保護學院,福州 350002)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda起源于美洲,對農業生產危害極大,被聯合國糧農組織列為全球重大遷飛性農業害蟲之一(Nagoshietal., 2017;Guietal., 2020),可危害玉米、高粱、大豆等200多種重要農作物(Harrisonetal., 2019;彭國雄等,2019)。草地貪夜蛾于2019年初入侵我國云南地區,現已擴散至全國大部分地區,給我國農業及糧食安全生產造成嚴重威脅(潘興魯等,2020;占軍平等,2020)。福建地處亞熱帶,氣候適宜常年種植玉米,為草地貪夜蛾越冬提供了良好的寄主條件,是草地貪夜蛾周年繁殖區,防控任務艱巨(邱良妙等,2020)。

針對草地貪夜蛾在我國的遷飛路徑和危害特點,國內植保工作者已提出多種監測防治手段并提出了殺蟲劑田間應用策略(劉妤玲等,2019),但過度依賴農藥可能導致草地貪夜蛾產生抗藥性問題。在草地貪夜蛾的起源地美國、巴西等國家,由于長期依靠化學防治,導致其對傳統殺蟲劑產生了高水平抗性(Al-Sararetal., 2006;Zhangetal., 2020)。因此,生物防治相關方法也已被提出,如發掘和利用昆蟲病原真菌(徐毓笛等,2020)、捕食性天敵(孫貝貝等,2020)、寄生性天敵(湯印等,2020)等生物資源進行草地貪夜蛾防治。其中,利用昆蟲病原微生物實施“以菌治蟲”具有低毒、低殘留、無污染、不易產生抗藥性等優點,是害蟲生物防治的關鍵措施,也是害蟲綠色防控體系發展的趨勢(宋曉兵等,2016)。

綠僵菌作為一類重要而常見的蟲生真菌,可寄生多種害蟲,在農、林及衛生害蟲的防治中應用廣泛(Donald and Dymond, 2004;張亞波等,2020)。國外在利用綠僵菌防治草地貪夜蛾方面已有較多報道,墨西哥、巴西等國家很多地區的玉米種植區內均發現大量被萊氏綠僵菌感染的草地貪夜蛾幼蟲(Ruiz-Nájeraetal., 2013;Ordóez-Garcíaetal., 2015);Akutse等(2019)測定了多種昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾幼蟲的毒力,其中金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae對2齡幼蟲的致死率低于10%。鑒于草地貪夜蛾在我國的入侵時間較短,國內關于綠僵菌防治草地貪夜蛾的研究剛剛起步。彭國雄等(2019)在室內條件下測定了金龜子綠僵菌CQMa421對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲、蛹、成蟲和卵的殺蟲活性,發現該菌株對草地貪夜蛾低齡幼蟲具有殺蟲活性并引起蛹黑化。2019年7～8月,鄭亞強等(2019)在云南省曲靖市玉米田調查發現,田間草地貪夜蛾的萊氏綠僵菌感染率在2.52%～29.83%之間;雷妍圓等(2020)從廣州市玉米田染菌草地貪夜蛾幼蟲上獲得一株萊氏綠僵菌,高濃度孢子懸浮液處理下草地貪夜蛾2齡幼蟲的死亡率達100%。本研究從福建省不同地區收集罹病草地貪夜蛾幼蟲僵蟲以及其他鱗翅目和半翅目幼蟲僵蟲,對病原真菌進行常規分離及產孢培養,采用浸漬法測試其對草地貪夜蛾2齡幼蟲和蛹的致病力,并對高致病力菌株進行鑒定,以期為草地貪夜蛾的生物防治提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株:采自福建省三明永安、漳州長泰、龍巖上杭、南平建甌、莆田仙游、福州閩侯和永泰地區等田間罹病的草地貪夜蛾幼蟲僵蟲以及其他罹病鱗翅目和半翅目幼蟲僵蟲,在超凈臺內挑取帶菌蟲體少許孢子,采用劃線法接種于薩氏麥芽糖瓊脂酵母(SMAY)培養基(蛋白胨10 g、麥芽糖40 g、酵母浸粉2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L),置于光照培養箱(溫度26±1℃, 相對濕度70%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h,)中培養。6～8 d后挑取孢子轉接到新的SMAY培養基中進行單孢培養,10～15 d后刮取分生孢子置于高壓滅菌處理的30%甘油中,震蕩混勻后于-80℃冰箱貯存備用。供試菌株詳細信息見表1。

表1 供試綠僵菌菌株基本信息

供試蟲源:供試草地貪夜蛾于2019年6月采自福建省建甌市東峰鎮玉米地,經室內人工飼料連續飼養的實驗室種群,室內飼養條件為溫度 26±1℃、相對濕度60%～70%、光周期L∶D=14 h∶10 h。選取2齡幼蟲和1日齡蛹進行致病力測定。

人工飼料:草地貪夜蛾人工飼料參考李子園等(2019)方法配制。

1.2 孢子懸浮液的制備

將供試菌株接種于SMAY固體培養基,置于光照培養箱(溫度26±1℃,相對濕度70%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h)中培養15 d,收集孢子,加入無菌0.05% Tween-80水溶液,充分震蕩后用6層無菌紗布濾掉菌絲體獲得孢子懸浮液,采用血球計數板計數,最終將孢子濃度調整為5×107個/mL備用。

1.3 菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致死率測定

挑取大小一致、健康的草地貪夜蛾2齡幼蟲在濃度為5×107個/mL的供試菌株孢子懸浮液中浸漬5 s后取出晾干,然后將其移置人工氣候箱內(溫度26±1℃,相對濕度65%±5%)用塑料養蟲盒(直徑為3 cm,高為3 cm)單頭飼養,養蟲盒內放入人工飼料供其取食。設3次重復,每重復20頭幼蟲,以0.05% Tween-80無菌水處理的2齡幼蟲為對照。每日定期記錄試蟲的死亡數量,持續觀察8 d。死亡試蟲及時挑出保濕培養,若體表長出白色菌絲并產綠色孢子,則視為染菌死亡。

1.4 菌株對草地貪夜蛾蛹的致死率測定

選取大小一致的1日齡蛹,放入配制好的濃度為5×107個/mL的供試菌株孢子懸浮液浸漬5 s后取出晾干,然后將其移置人工氣候箱內(溫度26±1℃,相對濕度65%±5%)用塑料養蟲盒(直徑為6 cm,高為5 cm)飼養,養蟲盒內放入棉球保濕,每個養蟲盒中放入5頭蛹。設3次重復,每重復20頭蛹,以0.05% Tween-80無菌水處理的草地貪夜蛾蛹作為對照。每日定期記錄蛹的死亡情況(蛹體多次觸碰均無反應則視為死亡),持續觀察8 d。死亡蛹體及時挑出保濕培養,若體表長出白色菌絲并產綠色孢子,則視為染菌死亡。

1.5 菌株鑒定

菌株形態學觀察:將高致力菌株FJMR2和FJXY7接種于SMAY培養基,于溫度26±1℃、相對濕度70%±5%、光周期L∶D=14 h∶10 h的人工氣候箱中培養7 d,記錄菌落培養特征,并在光學顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態以及產孢結構。

分子鑒定:提取純化菌株FJMR2和FJXY7的基因組DNA,利用真菌通用引物IT1(5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′)對菌株rDNA-ITS序列進行普通PCR擴增。50 μL PCR反應體系:DNA模板2 μL(20 ng/μL),上、下游引物各2 μL(10 μmol/L),2×EsTaq PCR Master Mix 25 μL,ddH2O補足至50 μL。反應條件:94℃預變性5 min;94℃ 40 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環;72℃延伸 5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果在GenBank基因數據庫中比對后選擇相近序列,采用MEGA 7.0軟件的鄰接法重復1 000次構建系統發育樹。

1.6 統計分析

試驗數據通過Excel 2013和SPSS 17.0軟件進行統計分析,采用Duncan氏新復極差法檢驗,分析比較不同菌株間的致病力差異,并利用Probit方法計算半數致死時間(LT50)。

死亡率(%)=死蟲數/試蟲總數×100。

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)×100。

2 結果與分析

2.1 供試綠僵菌菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力

用5×107個/mL孢子濃度的懸浮液處理8 d后,8株綠僵菌菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致病力差異顯著,其中菌株FJMR2和FJXY7對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致死率最高,分別為88.76%和82.13%;其次為菌株FJNP8和FJMR1,致死率分別為77.78%和76.19%;菌株FJMH4、FJYT6和FJLY5的致死率在52.33%～60.70%之間;菌株FJXY3的致死率最低,僅為28.25%。菌株FJMR2和FJXY7對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致死速率最快,半數致死時間(LT50)分別為4.81 d和4.93 d;其次為菌株FJNP8和FJMR1,LT50分別為5.37 d和5.53 d;菌株FJYT6、FJLY5和FJMH4的LT50在6.94 d～7.14 d之間;菌株FJXY3的致死率低于50%,故無法計算LT50(表2)。

2.2 供試綠僵菌菌株對草地貪夜蛾蛹的致病力

用5×107個/mL孢子濃度的懸浮液處理8 d后,8株綠僵菌菌株對草地貪夜蛾蛹的致病力差異顯著,其中菌株FJMR2和FJXY7對蛹的致死率最高,分別為86.57%和84.00%;其次為菌株FJNP8、FJMR1和FJMH4,致死率在72.74%～75.39%之間;菌株FJLY5的致死率為56.55%;菌株FJXY3和FJYT6的致死率均低于50%。菌株FJMR1、FJMR2、FJMH4和FJXY7對蛹的半數致死時間(LT50)為4.83～5.86 d,差異不顯著;菌株FJLY5和FJNP8對蛹的LT50分別為6.63 d 和6.29 d;菌株FJXY3和FJYT6對蛹的致死率均低于50%,故無法計算LT50(表3)。

表3 8株綠僵菌菌株對草地貪夜蛾蛹的毒力測定

總體上,菌株FJMR2和FJXY7對草地貪夜蛾2齡幼蟲和蛹的致死率最高、半數致死時間最短。

2.3 菌株FJMR2和FJXY7的種類鑒定

菌株FJMR2和FJXY7在SMAY培養基上的菌落形態相似。培養7 d后,菌落直徑6～9 mm,質地短絨狀凸起,正面乳白色,反面土黃色,無分泌物;菌絲表面光滑透明,具分隔,直徑1.1～4.2 μm;分生孢子梗著生于氣生菌絲,圓柱形,近基部明顯膨大,大小2.5～5.5×1.5～3.0 μm,瓶梗呈輪生狀,每輪3～5個;分生孢子鏈生,卵圓形或橢圓形,大小2.5～4.0×1.5～2.5 μm,表面光滑(圖1-C)。初步鑒定菌株FJMR2和FJXY7為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

圖1 萊氏綠僵菌形態特征及草地貪夜蛾2齡幼蟲和蛹感染萊氏綠僵菌的癥狀(以FJMR2為例)Fig.1 Morphological characteristics of Metarhizium rileyi and symptoms of infected Spodoptera frugiperdaexternal symptoms of larvae, pupa of Spodoptera frugiperda after infection Metarhizium riley (Take FJMR2 as an example)注:A,菌株生長初期;B,菌株生長后期;C,分生孢子和菌絲形態;D,田間被綠僵菌感染的僵蟲;E,2齡幼蟲染病初期;F,2齡幼蟲染病后期;G,蛹染病后期;H,蛹染病前期。Note: A, Initial stage of colony growth; B, Late stage of colony growth; C, Mycelia and branched conidiophores; D, Symptoms of S.frugiperda infected by M.rileyi in field; E, Initial stage of the 2nd instar larvae infected by M.rileyi; F, Late stage of the 2nd instar larvae infected by M.rileyi; G, Late stage of the pupae infected by M.rileyi; H, Initial stage of the pupae infected by M.rileyi.

以ITS1和ITS4為引物,從菌株FJMR2和FJXY7基因組DNA分別擴增出1條約550 bp的序列。將獲得序列在NCBI數據庫中進行BLAST相似性比對,發現該2株菌株與MetarhiziumrileyiCBS 806.71(GenBank登錄號MH872111)的同源性高達99.9%以上,位于系統發育樹最小進化分支,親緣關系最近(圖2)。綜合菌株培養特征、形態特征和分子生物學方法鑒定,最終確定菌株FJMR2和FJXY7均為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

圖2 基于rDNA-ITS序列構建的菌株FJMR2和FJXY7與相關種的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain FJMR2 and FJXY7 with others related species based on rDNA-ITS sequences

3 結論與討論

綠僵菌作為重要的害蟲生防真菌,國內外在其物種資源、致病力研究及生防產品開發中已取得重要成果(蒲蟄龍和李增智,1996)。鑒于草地貪夜蛾在我國的入侵時間較短,有關草地貪夜蛾綠僵菌資源的研究主要集中在金龜子綠僵菌和萊氏綠僵菌(彭國雄等,2019;雷妍圓等,2020)。致病力是評價菌株應用潛力的核心指標,也是篩選優良菌株的基本依據,為進一步挖掘防治草地貪夜蛾的優良菌株,本研究測定了分離自福建省不同地區不同寄主的8株綠僵菌菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲和蛹的致病力,發現8株供試菌株對草地貪夜蛾均有不同程度的致病力,致死率為28.25%～88.76%,LT50為4.81～7.14d。從中篩選出2株對草地貪夜蛾具較強致病力的菌株FJMR2和FJXY7,根據菌株形態特征和rDNA-ITS序列對比分析,鑒定2株菌株均為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

萊氏綠僵菌又名萊氏野村菌Nomuraearileyi,可侵染多種鱗翅目害蟲,尤其針對夜蛾科多種為害較大的害蟲,如斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius、銀紋夜蛾Argyrogrammaagnata(Staudinger)、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner等,是一種生防潛力極高的蟲生真菌,在適宜的自然環境下能夠引發害蟲的病害流行,顯著降低害蟲的種群密度(Srisukchayakuletal.,2005;羅卿權等,2018)。周立峰等(2012)測定了5株萊氏綠僵菌對斜紋夜蛾的毒力,第10天的侵染率在60%～95%之間。胥志民等(2019)研究發現,萊氏綠僵菌Nr 5772在5×109個/mL孢子濃度下對甜菜夜蛾3、4、5齡幼蟲的LT50分別為4.44 d、4.48 d和4.85 d。雷妍圓等(2020)用孢子濃度為1×109個/mL的萊氏綠僵菌GZSF-1處理草地貪夜蛾2齡幼蟲,7 d后幼蟲的死亡率達100%。本研究結果顯示,萊氏綠僵菌FJMR2和FJXY7對草地貪夜蛾2齡幼蟲具有較高致病力,在5×107個/mL孢子濃度下對2齡幼蟲的致死率均達80%以上,與龍秀珍等(2021)的研究報道結果一致。另研究發現,FJMR2和FJXY7能侵染草地貪夜蛾蛹,在5×107個/mL濃度下對蛹的致死率達84%以上,大大降低了蛹的羽化率;而龍秀珍等(2021)研究發現,萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾蛹的致死率僅有20%,可能是菌株地理來源不同,致病性差異較大造成的。土壤具有更好的保濕保溫能力,又可避免紫外線的照射,為孢子的萌發創造了有利條件,更適合綠僵菌等殺蟲真菌對土壤中棲息害蟲的防治(Maetal.,2019),而且在土壤中施加菌劑以防治地下害蟲被認為是一種安全有效且可持續的害蟲防控措施(Roggeetal.,2017)。鑒于草地貪夜蛾大部分在土壤中化蛹,可以考慮在土壤中添加菌劑,達到對草地貪夜蛾持續控制的目的。

綜上所述,文中篩選到2株對草地貪夜蛾2齡幼蟲及蛹有較高致病力的萊氏綠僵菌FJMR2和FJXY7,具有研究價值和應用潛力,但本文研究結果是基于穩定的室內環境條件下取得的,如何讓該菌株在復雜的自然環境中發揮對草地貪夜蛾的持續控制作用仍有待進一步研究。