二穗短柄草SPL家族基因的鑒定、系統發育和表達分析

王淑婷,朱 婷,馬浩森,李小鵬,牛 娜,馬翎健

(1.西北農林科技大學農學院,陜西楊凌 712100; 2.渭南市農資農產品質量檢測中心,陜西渭南 714000)

基因家族由結構和功能相似的多個基因組成,在特定的生物體中扮演著重要的角色。目前,在真核生物中已經發現了各種基因家族,如bHLH[1]、TCP[2]和Prx[3]等。SPL家族基因(AmSBP1和AmSBP2)在金魚草的花分生組織中首次被發現,后在多種植物中被鑒定出。SPL蛋白均含有一個高度保守結構域(也稱為SBP結構域),由兩個獨立的鋅指結構組成,其中包含Zn-1(Cys3His或Cys4)和Zn-2(Cys2HisCys)[6-7];每個鋅指位點由4個氨基酸殘基結合一個鋅離子,在維持蛋白質構象穩定方面發揮重要作用[8]。在SBP結構域的C末端,有一個保守的核定位信號重疊在第二個鋅指結構上,將SBP蛋白引導到細胞核中,調節下游基因的轉錄[9]。

目前,SPL家族基因已經在擬南芥[10-11]、水稻[7]、大豆[12]、矮牽牛[13]、棉花[14]、煙草[15]、泡桐[16]、藜麥[17]和水曲柳[18]中得到研究。但還沒有關于二穗短柄草SPL家族基因的報道。

研究表明,SPL家族基因由miR156/157調控,在植物生長和生理的各個方面發揮著作用[11,19-20];在擬南芥17個SPLs中,有11個含有miR156/157識別位點[23-24]。Schwab等[25]發現,擬南芥中過表達miR156使多個SPLs的表達下調,這些SPLs都含有miR156/157識別位點,而其他沒有該識別位點的SPLs不受影響;突變5個AtSPL3的miR156/157識別位點堿基后,AtSPL3的轉錄水平顯著提高。在番茄中,大部分SPL基因在莖尖、花序和果實中高表達,而miR156/157在這三個組織中的表達較低, 表明miR156/157與SPLs的表達水平呈負相關。SPL基因參與植物的信號轉導,如AtSPL8可抑制促進種子萌發和根生長的下游基因的表達[27];VvSBP3和VvSBP5參與葡萄的低溫反應[28]。二穗短柄草基因組較小,與糧食作物如小麥、大麥和水稻關系密切[29]。目前,關于擬南芥和水稻SPL家族基因的功能研究較多,但其在二穗短柄草中的信息還不清楚。本研究擬對二穗短柄草中的SPL家族基因進行鑒定,分析其基因結構、基序、順式元件、系統發育、基因復制、GO注釋和表達模式等,并對其功能進行預測,為糧食作物功能基因的發現與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 二穗短柄草中SPL基因的鑒定

從Ensembl plant數據庫(http://plants.ensembl.org/)下載二穗短柄草的全基因組數據,包括基因組序列文件和蛋白序列文件。從PFAM數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載SBP結構域 (PF03110);使用HMMER 3.0程序將SBP結構域作為查詢序列,在二穗短柄草中尋找包含SBP結構域的蛋白質;以水稻和擬南芥的SBP蛋白序列為查詢序列,利用BLASTP程序對二穗短柄草蛋白序列進行檢索。分析HMM和BLASTP的結果,鑒定出BdSPL蛋白。利用NCBI-CDD網絡服務器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM數據庫對候選的BdSPL蛋白進行鑒定。共得到17個BdSPL蛋白,其相應基因依次命名為BdSPL1～BdSPL17。從ExPASY服務器(https://web.expasy.org/compute_pi/)[30]獲得BdSPL蛋白質的理論等電點(PI)和相對分子質量(MW),并使用Cello Web服務器(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預測這些蛋白質的細胞定位。

1.2 BdSPL蛋白的系統發育分析

使用CluastX 2.0軟件[31]對二穗短柄草、水稻和擬南芥的SPL蛋白氨基酸序列進行比對,利用MEGA 8.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹,bootstrap參數設置為1 000[32]。

1.3 BdSPL基因的結構及保守基序分析

利用Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/)對其基因結構和編碼序列(CDS)進行分析[33]。利用MEME v4.9.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)分析BdSPL蛋白的保守基序,基序最佳氨基酸數10～250,最大基序數量設置為15個[34]。

1.4 二穗短柄草、水稻、小麥和玉米的SPLs共線性分析

利用MCScanX[35]軟件檢測二穗短柄草與水稻、玉米、小麥之間的SPL區域。使用Circos 0.67比較BdSPL與上述物種之間的共線性關系[36]。比較共線基因對的CDS和蛋白質序列,使用KAKS_Calculator軟件計算KAKS比率[37]。用Wang[3]的方法計算共線基因對的發散時間(T)。

1.5 SPL的GO注釋及其與其他蛋白質相互作用分析

二穗短柄草中SPL蛋白的GO注釋來自PLAZA數據庫(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v5_dicots/)[38]和Plant Transcriptional Regulatory Map數據庫(http://plantregmap.gao-lab.org/)。使用ArenanNet V2[39]和Cytoscape軟件[40]構建BdSPL與其他二穗短柄草蛋白之間的相互作用網絡。

1.6 BdSPLs的啟動子分析

從Ensemblplant數據庫下載BdSPL基因上游1.5 kb的DNA序列,提交到PLACE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),預測啟動子區域的順式調控元件[41]。

1.7 BdSPLs的基因表達分析

從SRA數據庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)中獲得17個BdSPL基因在九種組織[42]和不同植物激素處理下[43]的數據,分析其表達模式。

將二穗短柄草Bd21的種子鋪在有濾紙的培養皿中,使水輕微沒過種子,發芽3～5 d。將泥炭土、蛭石、營養土按照1∶1∶1的比例充分混勻,裝到培養盆(10 cm×10 cm×8.5 cm)中。挑選長勢一致且健壯的二穗短柄草幼苗移栽至培養盆中,每個培養盆3株,于16/8 h晝夜光周期、23 ℃、相對濕度55%～60%的溫室培養;3～5 d澆水并施肥一次,在抽穗期采集根、葉、莖和花序進行SPL基因表達分析。

同上述方法將二穗短柄草在鋪有濾紙的培養皿培養至3周齡,分別用200 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1GA、100 μmol·L-1ABA和20%PEG600處理液沒過幼苗根部,并用相應處理液噴濕莖和葉;同時設低溫(-4 ℃)處理[44],均保持2 h后用流水沖洗幼苗;將所有樣品用液氮速凍,于-80 ℃保存備用。

使用艾科瑞公司的 RNA 提取試劑盒(AG21019)提取上述材料的總RNA;使用Evo M-MLV RT-PCR試劑盒(Accurate Biology,中國湖南)合成cDNA,使用 PrimerPremier 5.0軟件設計17個BdSPL基因的qRT-PCR 特異性引物(表1)。使用艾科瑞公司的Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(含ROX)(AG11718)參照說明書用QuantStudioTMReal Time PCR儀進行實時定量PCR。BdUBC18為參考基因,相對表達量通過2-ΔΔCT方法計算。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used for the qRT-PCR

2 結果

2.1 二穗短柄草SPL家族基因的鑒定和染色體定位

所得17個編碼SBP蛋白的基因(表2)。在二穗短柄草的5條染色體上分布不均,其中6個分布在第3染色體上,占35%,第1、2、4染色體上均有3個,有2個位于第5染色體上。

表2 二穗短柄草SPL基因家族的特征Table 2 Characteristic features of SPL gene family in B. distachyon

亞細胞定位預測發現,所有的二穗短柄草SPL蛋白定位在細胞核中。17個成員的氨基酸長度為192～1 126 aa,其中最長的是BdSPL011,最短的是BdSPL002。相對分子量20.05～122.96 kDa,等電點5.44～9.92。

2.2 BdSPLs的序列比對及系統發育分析

在17個BdSPL蛋白中,均有約76個氨基酸組成的SBP結構域(圖1),其C末端有兩個鋅指結構,為Cys-His或Cys-Cys-His-Cys,以及一個NSL位點。

用 MEGA6.0構建二穗短柄草SPL蛋白與擬南芥、水稻 SPL蛋白的系統進化樹(圖2)。根據遺傳變異度將這52個SPL劃分成7組;其中D組和F組的SPL最多。二穗短柄草的17個SPL均勻分布在除E組外的其他6個組里。進化樹中進化枝相近SPL可能來自同源基因,例如,A組中的BdSPL012和OsSPL016可能是同源基因。同一組中,二穗短柄草與水稻的SPL遺傳變異度更小,說明二者關系更近。

圖2 二穗短柄草、擬南芥和水稻SPL系統發育樹

2.3 BdSPL的基因結構和保守基序分析

基因結構分析結果(圖3)表明,17個BdSPL基因的外顯子數為2～11,58%的BdSPL基因含有3個外顯子,圖2中同組BdSPL基因結構相似。

圖3 BdSPLs基因結構和保守基序分析

17個BdSPL基序分析(圖3)表明,兩個基序(motif 1, motif 2)包含在所有BdSPL蛋白中,推測motif 1和motif 2是SBP結構域的重要構成部分。圖2中F組的BdSPL蛋白具有最多的基序數,蛋白質最長;不同組有其特定的基序,例如,motif 3、9、10和11僅存在于F組和G組的BdSPL蛋白中;motif 7存在于F組亞家族的BdSPL001、004和011中。推測同一組成員具有相似的功能。

2.4 二穗短柄草與水稻、小麥和玉米的SPL基因共線性分析

在二穗短柄草(圖4A)中檢測到6對基因復制事件,其中5對與片段復制事件有關,1對為串聯復制事件。這表明片段復制事件對BdSPL的進化起主要作用。所有BdSPLs的Ka/Ks均小于1;復制事件的發散時間約為76 Mya。

A: 二穗短柄草基因組中的重復基因對;B、C、D: 二穗短柄草與水稻、小麥、玉米間的共線性;淺色背景代表四個物種整個基因組中的共性區塊,深色線條代表BdSPLs的共線基因對。

在其他3個物種中檢測到125個基因與BdSPL基因是共線的,其中,水稻有23個(圖4B),小麥有62個(圖4C),玉米有40個(圖4D)。這表明與水稻和玉米相比,小麥與二穗短柄草SPL基因相似性更高。除BdSPL012/Os01t0922600、BdSPL015/Os01t0922600、BdSPL006/TraesCS7A02G260500等10對基因的Ka/Ks值大于1外,其余115對基因的Ka/Ks值均小于1。BdSPLs與水稻的分化時間約為53 Mya,早于小麥的45 Mya,晚于玉米的57 Mya。這表明BdSPL基因經過了純化選擇,其中Ka/Ks>1的基因對在進化過程中起著重要作用。

2.5 BdSPLs的GO注釋及與其他蛋白質相互作用分析

GO注釋顯示(圖5),17個BdSPL蛋白共得到22個GO注解,其中14個與生物過程有關,2個與分子功能有關,6個與細胞組分有關。在細胞組分中,17個BdSPLs與細胞和細胞器組成有關,不到30%的BdSPLs參與膜的形成。在分子功能中,17個BdSPLs均與DNA結合,不到10%的BdSPLs具有轉錄調節功能。在生物過程中,超過60%的BdSPL蛋白參與了二穗短柄草的生長和發育,包括發育過程、代謝過程和生物過程。不到40%的BdSPLs能對環境壓力作出反應。這說明BdSPL蛋白參與各種生理過程。

構建BdSPLs與二穗短柄草中其他蛋白之間的相互作用網絡(圖6),共檢測到678個相互作用的蛋白分支,每個BdSPL與至少4個其他蛋白發生15次相互作用。其中,47%的BdSPLs與至少61個蛋白相互作用,如BdSPL006、007和008,表明這些SPL蛋白在蛋白網絡的調節中發揮重要作用。將與BdSPL蛋白相互作用的其他蛋白的序列提交到CDD數據庫,發現多數為AP2和MADS超家族。據報道,AP2家族在激素調節和花發育中具有重要作用[45]。推測BdSPL蛋白與AP2家族的蛋白相互作用調節植物的花發育。

BdSPLs蛋白標記為紅色,其他蛋白標記為藍色。

2.6 BdSPLs基因的啟動子分析

為了確定BdSPL基因中包含的順式作用元件,我們分析了這些基因上游啟動子部位的1.5 kb DNA序列。結果(圖7)表明,BdSPL基因啟動子區域包含多種順式元件,可分為激素和脅迫反應元件、光響應元件和植物生長發育元件三類。其中,有47%屬于光反應元件。59%的基因含有G-box,推測BdSPL基因可能受光調控;88%的BdSPL基因含有與脫落酸反應相關的Abre元件,推測其參與ABA代謝途徑的調節;大約58%的BdSPL基因含有ARE、CGTCA-Motif、TGACG-Motif三種元件,推測其參與厭氧誘導和MeJA介導的反應。此外,啟動子序列中還有一些與植物生長發育相關的元件,如CAT-box、O2-Site和HD-ZIP-1。推測BdSPL基因在調節植物生長發育、光調節和激素反應等生理過程中發揮作用。

2.7 BdSPLs基因的表達分析

為了確定BdSPL基因的組織特異性表達模式,通過SRA數據庫分析其在二穗短柄草的9個組織(葉片、早期花序、出苗花序、花藥、雌蕊、授粉后5 d的種子、授粉后10 d的種子、植物胚胎和胚乳)的轉錄數據,并繪制了熱圖。結果(圖8A)表明,同一亞族的BdSPL基因具有相似的組織表達模式;其中BdSPL009、-010、-014、-017等12個基因在花序早期和萌發組織中高表達,推測其與花的發育過程有關。BdSPL001、-004、-006等8個基因主要在雌蕊中表達,BdSPL001、-004、-008和-011在授粉后5 d的種子中表達。只有少數基因在授粉后10 d的葉片、種子、植物胚胎或胚乳中表達水平較高,如BdSPL004、-005和-010。推測BdSPLs主要參與花的發育。

圖8 BdSPLs基因在9種組織(A)、8種植物激素和脅迫(B)下的表達譜

通過SRA數據庫分析了14個BdSPLs在8種植物激素高低水平處理下的表達數據(圖8B)發現,與低濃度激素處理相比,BdSPL基因在高濃度下的表達一致。例如,BdSPL001、-009和-014在高濃度激素下有較高的表達水平;在低濃度條件下,BdSPL001和-014被細胞分裂素、ABA和生長素等6種植物激素上調,并被GA下調;BdSPL009在生長素、ABA和GA處理下高表達,但在BR處理下表達很低。這表明BdSPLs對低濃度激素處理更敏感。在低濃度植物激素處理下,大多數基因上調,BdSPL015在ABA處理下高表達,BdSPL002、-005和-006在JA處理下高表達,BdSPL005、-007和-012在乙烯處理下高表達而BdSPL002、-006、-008、-009、-012和-014等大多數基因被BR或GA處理下調。由此認為,BdSPLs可以正向調節JA和乙烯途徑,負向調節GA和BR途徑。

2.8 BdSPLs基因的表達分析

為了研究BdSPLs的功能,采用qRT-PCR技術檢測17個BdSPLs在四個組織(根、葉、莖和花序)的表達模式。從圖9A發現,大多數BdSPL基因在花序中的表達高于根、莖和葉;除了BdSPL006、-008、-009和-012外,其余13個基因在花序中有高水平表達,進一步證明BdSPLs與花的發育密切相關。BdSPL001、-003和-005等14個BdSPLs基因在葉中的表達高于根和莖,表明這14個基因參與了葉的發育。BdSPL006和BdSPL012基因在莖中高表達,表明這兩個基因可能影響莖的發育。

圖9 17個BdSPLs基因在4個組織(A)和5種不同處理(B)下的相對表達水平

分析脅迫、溫度、激素5個不同處理下17個BdSPLs的表達水平(圖9B)發現,約有50%的BdSPLs在所有處理下呈下調趨勢。例如,GA處理下所有BdSPLs的表達均下調,ABA處理下85%的BdSPLs表達下調,PEG處理下94%的BdSPLs表達下調,低溫下,BdSPL004、-005、-007、-008、-013、-014、-016和-017共8個基因表達降低。有少數BdSPLs基因表達上調,如BdSPL005、-013、-014和-016在鹽處理下表達上調,BdSPL009、-011和-012在低溫處理下高表達,BdSPL006、-010和-015在鹽和低溫處理下均表達上調。這些結果表明,BdSPLs對GA和ABA處理及干旱處理可能有負調控作用。

3 討論

3.1 二穗短柄草中SPL家族基因的特征

本研究采用比較基因組學的方法,從二穗短柄草全基因組中獲得了17個BdSPL基因,多于擬南芥(16)[11],但少于玉米(31)[46]、水稻(19)[47]和蕎麥(24)[48]。17個SPL蛋白序列長度、分子量及等電點均存在較大的差異,亞細胞定位其均在細胞核中,這與上述植物的結果一致,推測其功能保守。系統發育樹將二穗短柄草、擬南芥和水稻的SPL基因分為7個組,同一組中同源性較高的基因可能具有相似的功能,如B組二穗短柄草BdSPL003和水稻OsSPL010具有較高的同源性,而水稻OsSPL010已被證明參與逆境脅迫響應及水稻生長發育過程[49],推測BdSPL003參與二穗短柄草逆境脅迫和生長發育。鑒定到17對二穗短柄草和水稻的同源SPL基因,但沒有鑒定出二穗短柄草和擬南芥間的SPL同源基因對,這表明BdSPL基因與水稻的同源性高于擬南芥。本研究發現5對BdSPL基因歸因于片段復制事件,只有1對BdSPL基因經歷了串聯復制事件,這與Liu等[48]結果一致。共線性結果表明,BdSPLs與小麥的同源基因比水稻和玉米的同源基因更多。

3.2 BdSPLs的結構

基因結構包括外顯子和內含子,Xu[50]認為,內含子和外顯子通過獲取、丟失、插入或缺失進化?；虻慕Y構不僅是影響基因功能的主要因素,也是了解基因家族進化的重要基礎。本研究發現,BdSPL基因有2～11個外顯子,大部分基因含有3個外顯子。推測BdSPL基因在進化過程中因為內含子/外顯子的插入和缺失導致其結構和功能產生差異,多數BdSPL基因有3個外顯子,表明BdSPL基因較保守。Guo[51]認為,生物體中染色體融合或重組的原因之一是基因組進化過程中內含子/外顯子數量的變化,這些變化改變了基因的功能。在本研究中,BdSPL基因內含子或外顯子的數量不同,也影響了二穗短柄草SPL基因的生物學功能。

在本研究中,在BdSPL蛋白中發現了15個基序。Motif 1和motif 2主要編碼SPL結構域,不同的亞族含有特定的保守基序,這與水稻[47]研究結果一致。特有的基序增加了SPL蛋白功能的多樣性,特定的保守基序是其功能的關鍵。

3.3 BdSPL基因的潛在功能

在本研究中,大多數BdSPL基因在花序中高表達,表明BdSPL基因可能對花的發育過程中具有重要作用。Chao[52]報道了AtSPL1基因可以通過調節營養生長期下游靶基因的表達增強花序的耐熱性;Liu[48]發現AtSPL2、-9、-10、-11、-13和-15促進了苦蕎從營養生長到生殖生長的轉化,并調控其花和莖的發育;Cui[53]報道AtSPL9縮短了植物的開花時間,調節側根的生長。同源基因一般具有相似的功能。在本研究中,進化分析結果表明,AtSPL1和AtSPL12與BdSPL001、-004和BdSPL014高度同源;AtSPL2、-10和-11與BdSPL007、-008高度同源;AtSPL9、-15與BdSPL010、-014和-016密切相關;AtSPL13與屬于A組的BdSPL基因高度同源。許多與上述AtSPL基因同源的BdSPL基因在花序中的表達水平高于其他三個組織,表明BdSPL基因可能參與花的發育。此外,在莖中低表達的BdSPL006和-012基因與AtSPL13同源,表明這兩個基因可能參與了莖的發育。

通過基因芯片和miRNA測序發現,植物中很多microRNA基因響應生物和非生物脅迫,而SPL基因作為microRNA156的靶基因,也在響應環境脅迫中發揮著關鍵作用[54]。本研究發現,SPL基因在苗期的表達水平都很低。Wu[55-56]和Wang[57]報道miR156在苗期的表達水平最高,隨著植物從苗期向成熟期轉變,其表達水平逐漸降低。AtSPL3和AtSPL9的表達水平在苗期較低,在整個營養生長期逐漸升高。因此,推測miR156在苗期抑制SPL基因的表達。17個BdSPL基因均在GA和ABA脅迫下下調,表明BdSPL基因在GA和ABA介導的植物生長中起負調控作用。在PEG、鹽和低溫處理下,不同BdSPL基因或上調或下調。Cui[53]發現鹽和干旱處理下調了AtSPL9的表達,推遲了擬南芥的開花。本研究發現,BdSPL010、-014和-016基因與AtSPL9有很高的同源性,推測這3個基因延緩開花時間。