基于納米酶構建比色生物傳感器用于總抗氧化能力分析

席書敏,王 丁,趙仁勇

河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

抗壞血酸(AA),又名維生素C,是一種能夠清除體內過剩的活性氧以及維持氧化和抗氧化系統平衡的生物輔助因子和必需的抗氧化劑[1]。AA在生理和病理過程中起著不可或缺的作用,既能幫助預防壞血病、心血管疾病、過敏和炎癥等復雜疾病,又能促進神經遞質的形成、離子攝取和氨基酸代謝[2-3]。AA主要存在果蔬中,不能由機體直接合成。然而,食物中存在的抗氧化劑種類繁多且可能相互作用,難以對特定的抗氧化成分進行分析[4]。因此,總抗氧化能力(TAC)被用作評估抗氧化性能的重要指標。

目前,已有多種分析TAC的方法,主要包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(DPPH)[5]、氧化自由基吸收能力測定法(ORAC)[6]、鐵離子還原抗氧化能力測定法(FRAP)[7]、等效抗氧化能力測定法(TEAC)[8]。這些方法不僅檢出限較高,不利于實際應用,而且有的化學試劑具有刺激性對人體有害,有的方法所需儀器昂貴,對反應條件要求較高,操作難度大,還有的檢測吸收波段重疊,結果有偏差。與這些方法相比,比色傳感器通過溶液顏色的深淺或光學信號的變化確定待測物,具有可視化、操作簡便、成本低、靈敏度和選擇性高的優勢。

納米酶是具有類似天然酶催化活性的納米材料,既具有納米材料成本低廉、穩定性高、可回收利用和合成方法多樣的性能優勢,又具有很高的類酶催化活性[9-10]。自2007年具有過氧化物酶特性的Fe3O4納米酶被報道以來[11],各種具有酶催化性能的納米酶被研究,并在各個領域迅猛應用和發展[12]。納米酶具有制備成本低且方法簡單、穩定性好、催化性能可調等優點[13-14],是替代天然酶制備比色傳感器應用于檢測分析各種物質的良好替代品。

作者以2-甲基咪唑、硝酸鋅、硝酸鐵為原料,通過高溫熱解合成具有良好催化活性的鐵-氮共摻雜碳基納米酶(Fe-N/C)作為信號放大探針,結合顯色機制,建立一種檢測TAC的比色傳感體系,進一步提高TAC的檢測靈敏度。所制備的Fe-N/C納米酶具有良好的類過氧化物酶催化活性和較強的底物親和力,可用于模擬天然辣根過氧化物酶(HRP),而且在較寬的溫度和pH值范圍內表現出較高的活性。此外,AA可抑制Fe-N/C催化氧化3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺顯色反應的發生,在一定濃度范圍內AA濃度與溶液的吸光度呈負相關關系,據此構建一種定量檢測AA的新方法,并以AA為典型的抗氧化劑模型,通過加標回收試驗驗證該比色傳感器在實際樣品中分析TAC的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鉀、葡萄糖(Glu)、抗壞血酸(AA)、谷胱甘肽(GSH)：分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;果糖(Fru)、蔗糖(Suc)、2-甲基咪唑、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)、對苯醌、L-組氨酸、乳糖(Lactose)、麥芽糖(Maltose)、L-半胱氨酸(L-Cys)：分析純,上海麥克林有限公司;硝酸鐵、硝酸鋅、過氧化氫(H2O2)、氯化鈉、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)：分析純,國藥集團化學試劑有限公司;牛血清蛋白(BSA)：優級純,Sigma-Aldrich公司。試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

PL1502-S分析天平：瑞士Mettler Toledo公司;HT7700透射電子顯微鏡(TEM)：日本Hitachi公司;UV-2550紫外-可見分光光度計：日本島津企業管理有限公司;MINIFLEX600 X射線衍射儀(XRD)：日本Rigaku公司;SevenEasy S20 pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Vortex-2 Genie漩渦振蕩器：美國Scientific Industries公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Fe-N/C納米酶的制備

先將50 mg硝酸鐵、1.68 g硝酸鋅和3.7 g 2-甲基咪唑分散于160 mL甲醇溶液中,室溫下將混合溶液攪拌約12 h,10 000 r/min離心10 min,用甲醇反復沖洗沉淀物,60 ℃過夜干燥即可得到Fe-ZIF8粉末。再將合成好的Fe-ZIF8粉末放在瓷舟中,在充滿氮氣氛圍的高溫管式爐中以10 ℃/min加熱至900 ℃,并保溫2.5 h,待管式爐冷卻至室溫后取出樣品,即得到黑色粉末狀的鐵-氮共摻雜碳基(Fe-N/C)納米酶。最后將制備的Fe-N/C納米酶溶于超純水并超聲分散備用。

1.3.2 類過氧化物酶活性測試

以TMB為顯色底物,對合成的Fe-N/C納米酶的類過氧化物酶(POD)活性進行評價,具體步驟：在780 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液(100 mmol/L,pH 4.0)中,依次加入100 μL TMB(1 mmol/L)、100 μL H2O2(100 mmol/L)和20 μL Fe-N/C納米酶(1 mg/mL),37 ℃孵育10 min后用紫外-可見分光光度計記錄反應體系的吸光度。對照試驗：將20 μL 1 mg/mL的Fe-N/C納米酶替換為Fe-ZIF8納米顆?；蛘叱兯?檢測過程與上述相同。

1.3.3 檢測條件的優化

(1)pH值：先配制100 mmol/L不同pH值(2.5、3、3.5、4、4.5、5、6.5)的乙酸-乙酸鈉緩沖液,加入1 mg/mL Fe-N/C納米酶20 μL、100 mmol/L H2O2100 μL、1 mmol/L TMB 100 μL,總體積為1 mL。再將混合溶液在室溫下孵育10 min,立即記錄不同pH值溶液的吸光度,確定反應最適pH值。

(2)溫度：將在最適pH值條件下的反應溶液分別置于不同的溫度(5、25、30、37、40、50、60 ℃)下,其他檢測過程同1.3.3(1)。

(3)Fe-N/C納米酶濃度：在最適溫度和pH值條件下設置Fe-N/C納米酶的質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2 mg/mL,其他檢測過程同1.3.3(1)。

1.3.4 酶促反應動力學研究

在780 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液(100 mmol/L,pH 4.0)中加入20 μL Fe-N/C納米酶(1 mg/mL)、100 μL H2O2(100 mmol/L)和不同濃度的TMB,溶液混合后立即記錄反應體系在最初60 s的動力學光譜。當以TMB為底物時,保持TMB濃度為1 mmol/L,改變H2O2的濃度,其他測試方法同上。根據底物濃度和反應初速度的倒數建立雙倒數曲線圖,計算最大反應速度和米氏常數。

v=ΔA/(Δt×ε×b);v=vmax×[S]/(Km+[S]),

式中：ΔA為反應體系的吸光度變化;v為初始反應速度,mol·L-1·s-1;Δt為反應時間的差值,s;ε為TMB的摩爾吸光系數(39 000 mol-1·L·cm-1);b為吸收層厚度,cm;vmax為最大反應速度,mol·L-1·s-1;[S]為底物濃度,mol/L;Km為Michaelis-Menten常數。

1.3.5 反應體系的催化機理驗證

在乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0,100 mmol/L)、100 μL TMB(1 mmol/L)、100 μL H2O2(100 mmol/L)、20 μL Fe-N/C納米酶(1 mg/mL)體系中,分別加入50 μL不同的自由基清除劑,總體積為1 mL,37 ℃反應10 min后立即記錄各個體系的吸收光譜。

1.3.6 比色法檢測AA

在乙酸-乙酸鈉緩沖液(100 mmol/L,pH 4.0)中,加入20 μL Fe-N/C納米酶(1 mg/mL)、100 μL H2O2(100 mmol/L)、100 μL TMB(1 mmol/L)和不同濃度的AA,反應總體積為1 mL。37 ℃孵育10 min后記錄波長652 nm處的吸光度,并建立AA濃度與吸光度的標準曲線。

1.3.7 總抗氧化能力分析

以AA為抗氧化劑的典型模型,對獼猴桃、橘汁、維生素C片的TAC進行分析。為使檢測結果符合AA的線性范圍,將樣品用乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋一定倍數,并代替AA標準品加入體系中,其他測試條件參照1.3.6。樣品的TAC含量均以mmol/L為單位。

1.4 數據處理與分析

所有試驗至少進行3次,數據以平均值±標準差表示。采用SPSS 24對數據進行處理與分析,使用Origin 2023制圖。

2 結果與分析

2.1 納米酶的表征

由圖1(a)可知,Fe-ZIF8呈現出表面光滑、分散性良好、尺寸均勻的菱形十二面體形貌。由圖1(b)可知,經過高溫熱解后,由于有機配體在熱解中發生向異性收縮,納米材料皺縮且表面變得略微粗糙,但仍保持與Fe-ZIF8相同的形貌。圖1(c)顯示Fe-N/C納米材料在2θ為25°、43°處有寬衍射峰,這兩個特征峰對應于石墨的(002)和(100)特征峰,證明ZIF-8富含N的有機配體經過熱解后形成N摻雜碳雜化物。鋅基ZIF-8的特殊空腔結構可以摻入鐵鹽,900 ℃的熱解使Zn元素從主體中揮發,從而擴大Fe原子之間的空間距離,防止原子聚集,并且會產生豐富的微孔結構,從而提供更多的催化活性位點。從圖1(d)可以觀察到,Fe-N/C納米材料表面均勻分布C、N、Fe元素。以上結果表明Fe-N/C材料成功制備。

2.2 類過氧化物酶活性測試

以TMB為顯色底物驗證所制備的Fe-N/C納米材料的類酶催化活性。如圖2所示,TMB和TMB-H2O2溶液是無色的,且沒有特征吸收峰。當加入Fe-N/C或Fe-ZIF8后,在H2O2存在下其能催化氧化TMB為藍色產物,并在652 nm處有明顯的吸收峰,證明Fe-N/C和Fe-ZIF8均有類過氧化物酶(POD)催化活性,但Fe-N/C的POD活性更強。這可能是由于在高溫熱解過程中,金屬原子的擴散會形成缺陷結構,有利于活性位點與底物之間的電子轉移[15]。同時,鋅元素在高溫下的蒸發使碳骨架形成均勻分布的孔,有利于活性位點的暴露和反應物的擴散,進而提升材料的催化活性[16]。

圖2 Fe-N/C和Fe-ZIF8類過氧化物模擬酶的催化活性Fig.2 Catalytic activity of the peroxidase-like mimetic enzyme of Fe-N/C and Fe-ZIF8

與天然酶或其他催化劑一樣,人工合成的納米酶催化TMB氧化顯色也受諸多因素影響。因此,本研究檢測了反應體系在不同pH值、溫度和Fe-N/C納米酶濃度下的吸光度。如圖3(a)所示,pH值對反應體系有顯著影響,pH 4.0時吸光度最大。圖3(b)為反應溫度對Fe-N/C納米酶催化TMB/H2O2氧化的影響,隨著反應溫度的逐漸升高,反應體系的吸光度先升高后下降,37 ℃時達到最大,高于37 ℃時吸光度開始下降,這是因為在較高溫度下,反應體系中的H2O2不穩定易分解,導致TMB的氧化產物減少。由圖3(c)可知,反應體系對Fe-N/C納米酶質量濃度具有很強的依賴性,吸光度隨著納米酶質量濃度的升高逐漸增大,當質量濃度大于1 mg/mL后其增長速度開始減緩?？紤]到合適的儀器響應范圍,避免因質量濃度過高造成紫外光的散射,干擾檢測結果,將1 mg/mL作為納米酶的最優質量濃度。綜上所述,選擇pH 4.0、37 ℃、Fe-N/C納米酶質量濃度1 mg/mL作為后續試驗條件。如果納米酶廣泛地替代天然酶,除了具有優異的催化活性外,還需要有良好的穩定性和重復利用性。由圖4可知,天然的辣根過氧化物酶(HRP)在第2次重復使用時,催化活性有很大程度的降低,重復使用性能較差,而Fe-N/C納米酶循環使用5次之后,催化活性仍保持在80%以上,證明Fe-N/C納米酶有良好的循環使用穩定性。

注：(a) pH值;(b) 溫度;(c) Fe-N/C納米酶質量濃度。圖3 催化反應體系的條件優化Fig.3 Optimization of conditions for catalytic reaction systems

圖4 Fe-N/C納米酶和HRP的循環使用性能Fig.4 Recycling performance of Fe-N/C nanozyme and HRP

2.3 動力學測試

在最佳條件下,對具有POD活性的Fe-N/C納米酶進行穩態動力學研究。如圖5(a)、(c)所示,納米酶的反應初速度隨著底物濃度的增加而增加,一定濃度后達到平衡狀態,符合典型的Michaelis-Menten方程模型。以反應初速度的倒數和底物濃度的倒數繪制Lineweaver-Burk圖(圖5(b)、(d)),雙倒數曲線有著良好的正相關線性關系,顯示出Fe-N/C納米酶穩態動力學的變化趨勢。根據雙倒數曲線的截距和斜率,可求出Fe-N/C納米酶對TMB和H2O2的vmax和Km。Km代表酶與底物的親和能力,Km越小,對底物的親和力越強,Km越大,親和能力越弱[17]。由表1可知,Fe-N/C納米酶對底物TMB、H2O2的Km均低于HRP,同時也低于大多數已報道的納米酶,表明該納米酶對底物有較高的親和力,在較低的底物濃度下即可達到最大催化速度,有利于反應的進行。并且,該納米酶的參數vmax表明,Fe-N/C作為POD酶具有相對較好的催化活性,可以作為人工模擬酶代替天然酶。

表1 各種催化劑的動力學參數比較Table 1 Comparison of kinetic parameters of various catalysts

注：(a) TMB濃度對反應速度的影響;(b) TMB濃度與反應初速度的雙倒數曲線;(c) H2O2濃度對反應速度的影響;(d) H2O2濃度與反應初速度的雙倒數曲線。圖5 Fe-N/C納米酶的酶促反應動力學Fig.5 Kinetics of the enzymatic reaction of Fe-N/C nanozymes

2.4 催化機理驗證

一般來說,POD模擬酶的催化途徑可分為活性氧(ROS)的產生和電子轉移過程[23]。納米酶催化產生ROS,如羥基自由基(·OH)、單線態氧(1O2)、超氧陰離子(O2·-)等,催化氧化顯色底物是溶液顏色變化的主要原因。因此,本研究選擇硫脲、對苯醌和L-組氨酸分別作為·OH、O2·-和1O2的自由基清除劑,探索Fe-N/C-H2O2-TMB體系中可能存在的ROS,從而研究Fe-N/C作為類過氧化物酶的催化機理。如圖6(a)所示,L-組氨酸對體系幾乎沒有影響。而加入對苯醌和硫脲之后,反應體系的吸光度顯著降低,表明催化過程形成了·OH和O2·-。為進一步驗證·OH的生成,選用對苯二甲酸作為·OH的熒光探針。對苯二甲酸本身沒有熒光性質,但和·OH結合生成的2-羥基對苯二甲酸具有強熒光[24]。從圖6(b)可以明顯觀察到,反應體系在波長430 nm左右有明顯的熒光峰,并且熒光強度隨Fe-N/C納米酶質量濃度的增大而升高,再次證明·OH參與了反應體系的催化氧化。以上現象表明,Fe-N/C能夠催化氧化底物生成強氧化性的ROS,進而氧化TMB生成藍色產物,從而表現出良好的催化活性,并且·OH在Fe-N/C類過氧化物酶催化反應中起到關鍵作用。

圖6 Fe-N/C的類過氧化物酶機理研究Fig.6 Peroxidase-like mechanism study of the Fe-N/C

2.5 AA的比色檢測

AA是一種廣泛使用的抗氧化劑,能與溶液中的自由基發生反應,導致催化氧化過程被還原,對應的藍色產物oxTMB減少。從圖7(a)可以看出,當反應體系中沒有AA時,體系在652 nm處的吸光度最高,當AA加入時,吸光度隨AA濃度的升高不斷降低,而且溶液也由藍色變為無色,證明該比色傳感平臺應用于AA檢測具有良好的可行性。在AA為0.1～160 μmol/L范圍內,AA濃度與吸光度呈良好的負相關關系,線性回歸方程為y=-0.003 34x+0.587 49(R2=0.997 2),檢出限為0.03 μmol/L(S/N=3)(圖7(b))。由表2可知,本檢測方法展現出較寬的線性范圍和較低的檢出限,優于其他的檢測體系。

表2 不同方法檢測AA的比較Table 2 Comparison of different methods for detecting AA μmol/L

圖7 基于Fe-N/C納米酶的比色傳感體系檢測AAFig.7 Detection of AA by a colorimetric sensor system based on Fe-N/C nanozyme

選取實際樣品中可能存在的干擾物質來評估該傳感器的選擇性能。如圖8所示,當加入與AA濃度相同的抗氧化劑GSH和L-Cys時均引起體系吸光度的降低,然而當分別加入100倍AA濃度的其他干擾物質時,這些干擾物質對體系幾乎沒有影響,由此可知,該比色傳感平臺對還原性物質的性能檢測具有較強的特異性,可以用來檢測TAC。

圖8 AA比色檢測體系的選擇性Fig.8 Selectivity of AA colorimetric detection systems

2.6 總抗氧化能力的測定

為了進一步驗證該方法的可行性和準確性,對實際樣品的TAC(以AA含量計算)進行檢測分析。橘汁、獼猴桃和維生素C片的TAC含量分別為42、60、68 μmol/L,維生素C片的抗氧化能力高于橘汁和獼猴桃,且該檢測結果與配料表成分含量一致。通過在稀釋樣品(1%)中添加不同濃度AA進行加標回收試驗,如表3所示,回收率為92.69%～105.45%,相對標準偏差(RSD)小于2%,表明該方法具有較高的準確性和良好的應用潛力,適用于復雜樣品的TAC檢測。

表3 稀釋樣品中AA的回收試驗Table 3 Recovery experiments for AA in diluted samples

3 結論

通過高溫熱解法成功制備了具有較高催化活性的Fe-N/C納米酶,并構建了一種簡便快捷、準確度高、特異性好的檢測AA和TAC比色新方法。Fe-N/C納米酶具有良好的類過氧化物酶催化活性,能夠在H2O2存在下催化產生多種ROS,進而氧化TMB產生藍色氧化產物。在最適條件下,Fe-N/C納米酶的催化過程符合Michaelis-Menten方程模型,對底物TMB和H2O2的親和力均高于HRP,有利于反應的進行。最終構建的AA比色傳感平臺在0.1～160 μmol/L范圍內與吸光度呈線性關系(R2=0.997 2),檢出限低至0.03 μmol/L。同時,該傳感器有較強的抗干擾性能,在分析實際樣品中TAC時,表現出良好的回收率和靈敏度。Fe-N/C納米酶在分析TAC中展現出良好的應用潛力,后續需進一步研究納米酶的比活性、材料的耐儲存穩定性以及體系對其他抗氧化劑的檢測范圍,繼續構建基于納米酶的新型比色傳感器應用于其他目標物的檢測分析。