CD10、CA9、CD133表達與索拉非尼或舒尼替尼一線治療轉移性腎透明細胞癌患者預后的相關性

張 昊,鄭萬祥,劉克普,侯廣東,袁建林

(空軍軍醫大學西京醫院泌尿外科,陜西西安 710032)

根據2020年全球癌癥統計數據,腎癌的發病率在男性和女性惡性腫瘤中分別是第9位和第14位[1]。其中,腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)約占腎細胞癌的70%[2]。轉移性腎細胞癌(metastatic renal cell carcinoma,mRCC)是一種對化療耐藥的惡性腫瘤,隨著分子生物學的進展,近十幾年來有多種靶向藥物可用于治療mRCC。索拉非尼和舒尼替尼主要用于靶向抑制血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR),屬于酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI),能改善mRCC的預后,但不同患者之間的生存獲益程度差異較大,此外,TKI會引起各種毒副作用,包括增加致命不良事件的風險[3]。因此,為了選擇適合特定治療方法的患者,有必要發現更多與TKI治療轉移性腎透明細胞癌(metastatic clear cell renal cell carcinoma,mccRCC)預后相關的生物標志物。

CD10在腎素-血管緊張素系統中催化生成血管緊張素1-7,后者與Mas受體結合可抑制血管生成和腫瘤進展[4];HORIE等[5]發現CA9外泌體在體外能促進血管生成;有學者發現表達CD133的內皮細胞可以促進腫瘤新生血管的形成[6]。鑒于3種標志物均參與調節腫瘤血管生成,本研究旨在分析CD10、CA9、CD133表達與TKI一線治療mccRCC預后的相關性,從而幫助泌尿外科醫生進行臨床決策和促進個體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析2007年1月-2017年12月在西京醫院泌尿外科接受索拉非尼或舒尼替尼一線治療的93例mRCC患者的資料。納入研究的患者需符合以下條件：①經病理證實為mccRCC;②接受舒尼替尼或索拉非尼作為一線的靶向治療;③有可用的甲醛固定、石蠟包埋的腫瘤組織標本;④有詳細的隨訪信息。如果患者既往患有其他惡性腫瘤、組織標本有超過80%壞死或出血區域以及隨訪信息缺失,則排除于本研究之外,本研究最終納入80例患者。根據患者治療方法不同分為索拉非尼組(53例)和舒尼替尼組(27例)。根據實體瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,RECIST)1.1版判斷疾病進展(progressive disease,PD),將無進展生存期(progression free survival,PFS)定義為從靶向治療的第1天到出現影像學PD、出現明確PD臨床證據或死亡之間的時間;如果PD日期未知,把最后1次隨訪時間定義為PFS刪失的時間?？偵嫫?overall survival,OS)定義為從靶向治療的第1天到死亡之間的時間。

1.2 免疫組織化學染色及染色強度分析將ccRCC組織標本制備成5 μm石蠟切片,而后進行免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色,所有原發腫瘤組織標本均來自西京醫院病理科。IHC過程如下：把石蠟包埋的載玻片在分級脫蠟液中脫蠟,接著進行抗原修復,而后用體積分數為3%的雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶,用體積分數為3%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA) 封閉切片后,將載玻片與一抗(抗CD10,1∶100,抗CA9,1∶600;抗CD133,1∶600)在4 ℃孵育過夜,然后在室溫下孵育二抗(1∶200) 50 min,蘇木精染色和脫水操作用于對細胞核進行反染色。通過全景切片掃描儀(Pannoramic MIDI,3DHISTECH,匈牙利) 采集IHC切片上的圖像,并通過軟件(Aipathwell,Servicebio Technology,中國) 進行分析,這款圖像分析系統可自動識別組織測量區域,并評估陽性等級：陰性不著色,0分;弱陽性呈淡黃色,1分;中等陽性棕黃色,2分;強陽性呈棕褐色,3分。然后分析并計算陽性等級、測量區域中的組織區域面積、陽性面積等。對每個載玻片進行組織化學評分(H-score)以評估各標志物的染色強度,后基于各標志物H-score的中位數,將其區分為低表達或高表達,低于H-score中位數的為低表達,反之則高表達。H-score=∑(pi×i)=(弱陽性區域的百分比×1)+(中等陽性區域的百分比×2)+(強陽性區域的百分比×3)。pi代表陽性面積的百分比;i代表陽性等級(圖1)。

A、B：CD10高表達和低表達;C、D：CA9高表達和低表達;E、F：CD133高表達和低表達。

1.3 統計學分析分析IHC標志物表達與臨床病理變量的相關性,兩組間計量資料以中位數(P25,P75)表示,比較采用Mann-WhitneyU檢驗,計數資料以例(%)表示,比較采用χ2檢驗;用單因素和多因素Cox比例風險模型分析mccRCC的預后因素;在索拉非尼和舒尼替尼亞組內,采用Kaplan-Meier法進行標志物表達與PFS和OS的生存分析,低表達和高表達間生存率的比較采用Log Rank檢驗。所有統計分析均由SPSS 25.0統計軟件進行,作圖軟件用Graphpad Prism 9.0,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者的基本特征本研究共回顧性納入80例mccRCC患者,其中索拉非尼組53例,舒尼替尼組27例(表1)。截至2022年7月,37例(46.25%)患者出現PFS隨訪結局,中位PFS(median PFS,mPFS)為24.9(95%CI：16.5～33.2)個月;有55例(68.75%)患者死亡,中位OS(median OS,mOS)為44.2(95%CI：14.6～73.7)個月?；颊呋咎卣髟谒幬锝M間的均衡性檢驗顯示,手術方式為腎部分切除術(partial nephrectomy,PN)和根治性腎切除術(radical nephrectomy,RN)在藥物組間分布差異有統計學意義(χ2=12.914,P<0.001)。

2.2 患者幾種標志物表達與臨床病理變量的相關性分析CD10表達與Fuhrman分級相關(χ2=6.241,P=0.012),在CD10低表達組,Fuhrman 3～4級mccRCC占比更高;CA9表達與淋巴結轉移(χ2=5.952,P=0.015)和轉移器官個數(χ2=8.205,P=0.004)相關,在CA9低表達組,有淋巴結轉移和轉移器官個數≥2個的患者占比更高,沒有發現CD133與臨床病理變量的相關性(表2)。

2.3 mccRCC預后的影響因素分析將年齡、性別、Fuhrman分級、T分期、轉移器官數、轉移部位、手術方式、藥物種類及各標志物的表達等因素分別與PFS進行Cox單因素分析,結果顯示,Fuhrman分級、轉移器官數以及淋巴結轉移是PFS的影響因素(P<0.05),將P<0.05的因素納入Cox多因素分析中,顯示Fuhrman分級是PFS的獨立影響因素(HR=2.457,95%CI：1.126～5.365,P=0.024);同樣方法對各因素與OS進行Cox回歸分析,單因素分析顯示轉移器官數、淋巴結轉移及CA9表達是OS的影響因素(P<0.05),而其中轉移器官數是OS的獨立影響因素(HR=1.857,95%CI：1.048～3.290,P=0.034,表3)。

表3 mccRCC患者PFS和OS的單因素分析

2.4 CA9表達與治療亞組患者PFS和OS的生存分析Kaplan-Meier生存分析和Log Rank檢驗顯示,在索拉非尼組內,CA9低表達和高表達組患者的mOS分別是25.4、79.7個月,OS的生存曲線差異有統計學意義(Log RankP=0.006),而兩組間PFS生存曲線差異無統計學意義。在舒尼替尼組內,CA9低表達和高表達組間PFS和OS生存曲線差異均無統計學意義(圖2)。

A、C：索拉非尼組CA9表達與OS(A)和PFS(B)的生存分析;B、D：舒尼替尼組CA9表達與OS(B)和PFS(D)的生存分析。

3 討 論

2021年CSCO指南中指出舒尼替尼、索拉非尼是一線治療轉移性或不可切除性ccRCC的Ⅰ級推薦[7]。相較于索拉非尼或舒尼替尼的Ⅲ期臨床試驗結果[8-9],本研究中mccRCC患者的mPFS和mOS相對較長,原因可能來自兩個方面。一方面是研究排除了失訪的患者,而失訪患者通常預后較差;另一方面是所納入的患者都接受了PN或RN。既往回顧性研究顯示,RCC患者在減瘤性腎切除術后接受靶向治療較單純靶向治療具有顯著OS獲益[10]。

藥物組間均衡性檢驗發現,索拉非尼組接受PN的患者僅3例(5.7%),明顯低于舒尼替尼組。究其原因可能是索拉非尼組患者的發病時間早于舒尼替尼組。得益于醫療設備技術和循證醫學的發展,接受PN的患者有逐年增多的趨勢。一項研究回顧性分析了單中心在10年間接診的1 498例RCC患者的資料,發現PN比例逐年提高,RN比例逐年降低[11]。有研究認為PN能有效地保存腎功能[12],降低心血管事件發生的風險[13],而接受RN或PN患者的腫瘤特異性生存率(cancer specific survival,CSS)并無明顯差異[14]。

標志物表達與臨床病理變量相關性分析發現,CD10低表達與Fuhrman高分級相關。與此發現一致的是,明少雄等[15]分析了1 084例ccRCC組織標本,發現CD10在細胞核高分化、中分化、低分化中的陽性表達率分別為81.1%、82.8%、50.0%,差異具有統計學意義(P=0.040)。這提示CD10低表達的mccRCC可能更容易發生疾病進展,有學者認為CD10表達缺失或減少可能會促進神經肽介導的細胞增殖和腫瘤進展[16]。CD10對ccRCC的預后作用尚存在爭議。本研究未發現CD10表達與mccRCC患者PFS和OS的相關性。ERRARTE等[4]發現在ccRCC患者中,CD10陽性表達與更差的15年OS相關(P=0.007);另一研究發現在CD10陰性和陽性表達組之間,ccRCC患者的CSS生存曲線差異無統計學意義(P=0.361)[15]。

CA9低表達與淋巴結轉移和轉移器官數≥2相關,可能提示CA9低表達的ccRCC侵襲性更高。一項Meta分析研究發現,在RCC中CA9低表達與淋巴結轉移和遠處轉移顯著相關,并能預測較高的腫瘤分級[17]。ZHANG等[18]對730例接受手術治療的ccRCC患者進行長期隨訪,中位隨訪時間為13.8年,發現CA9低表達與患者CSS降低相關(HR：1.62,P=0.001),但多因素分析沒有發現顯著相關性。本研究中,CA9低表達是mccRCC患者OS縮短的非獨立預后因素。然而生存分析結果可能與CA9表達水平的界定標準有一定關系。CHAMIE等[19]對813例非轉移性ccRCC患者的腫瘤組織進行CA9染色和H-socre評分,發現與CA9評分≤100分相比,CA9評分≥200分是PFS和OS獨立且有利的預后因素。

CD133是五次跨膜糖蛋白prominin家族的成員,其表達在RCC中的預后作用存在爭議。有Meta分析發現CD133高表達是RCC患者CSS獨立且有利的預后因素(HR=0.4,95%CI：0.29～0.54)[20]。SAEEDNEJAD等[6]發現CD133的高胞質表達與ccRCC高分級、高分期、淋巴結轉移顯著相關,其膜性表達與腫瘤分級、分期不相關。而D’AlTERIO等[21]的一項研究評估了細胞質和細胞膜CD133的表達,發現CD133不是RCC患者無疾病生存期的預后因素(P=0.151)。本研究發現CD133不能作為mccRCC的預后因素,在進一步的研究中可分析胞膜或胞質表達其各自的預后作用。

治療亞組內CA9表達與PFS和OS的生存分析表明,CA9高表達與索拉非尼組mccRCC患者較長的OS相關,而與PFS不相關。CHOUEIRI等[22]分析了TARGET研究中接受索拉非尼治療的133例mccRCC患者的資料,CA9高表達與低表達患者的mPFS分別為5.5和5.4個月,差異沒有統計學意義。在舒尼替尼治療的ccRCC患者中,CA9的預后作用存在爭議。本研究發現,CA9低表達與舒尼替尼組患者的OS和PFS均不相關。有學者前瞻性招募了67例接受舒尼替尼一線治療的ccRCC患者,同樣發現CA9表達不是PFS和OS的預后因素[23]。然而MA等[24]的研究發現,在52例接受舒尼替尼一線治療的mccRCC中,CA9高表達組相較低表達組患者有較長的PFS和OS,差異有統計學意義。在本研究中,CA9低表達組患者從索拉非尼和舒尼替尼治療中生存獲益較少,因此對于腫瘤組織中CA9低表達的mccRCC患者,可以根據指南選擇靶向免疫聯合治療或雙免聯合治療以改善預后。

本研究存在一定局限性,首先,本研究為單中心的回顧性研究,存在一定偏倚,樣本量相對較少,未來需要擴大樣本量及前瞻性研究對本結論進行驗證;其次,部分患者在疾病進展后換用不同的二線或三線藥物治療;第三,各研究所使用的抗體敏感性和規格各不相同,確定標志物陽性或陰性表達的標準也有所不同,可能會導致不同的結果。本研究僅納入ccRCC患者,保證了數據的同質性,基于各標志物調節腫瘤血管生成的潛在機制,本研究可能是首個分析CD10、CD133與TKI治療mccRCC預后相關性的研究,旨在協助臨床醫生精準決策。