加查縣3株藏豬源產氣莢膜梭菌的分離鑒定及耐藥性研究

扎西旺堆，王辰龍，柳 泉，謝 怡，羅潤波

（西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000）

藏豬是我國寶貴的地方品種資源，原產于我國青藏高原，是世界上少有的高原型豬種。藏豬是一種適合放牧或半放牧的豬種，脂肪沉積能力強，對高寒、低氧等惡劣環境具有極強的適應能力[1]。

產氣莢膜梭菌是革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，是可同時感染人和多種動物的致病菌，廣泛存在于污水、腐殖質、泥土、排泄物等環境中[2]。根據產氣莢膜梭菌產生的毒素種類，可將其分為A—G 7種亞型。產氣莢膜梭菌C型通常被認為是0～2周齡仔豬壞死性腸炎發生的致病菌，A型菌株與乳豬輕度壞死性小腸結腸炎和絨毛萎縮有關[3]。產氣莢膜梭菌孢子長期存在于豬的糞便中，常引起仔豬腹瀉，給養豬業帶來巨大經濟損失[4]。

目前，國內外關于藏豬源產氣莢膜梭菌的生長、流行現狀、耐藥情況研究較少。本試驗設在西藏山南市加查縣，采集8份藏豬腹瀉糞便，對樣品中的產氣莢膜梭菌進行分離鑒定、毒素分型和耐藥表型檢測，旨在為加查縣藏豬產氣莢膜梭菌病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

2023年2月于西藏山南市加查縣無菌采集藏豬腹瀉糞便樣品8份，冷藏送至實驗室進行檢測。

1.2 試驗儀器、試劑、培養基

試驗儀器有冷凍離心機、移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統、厭氧產氣袋、厭氧罐等；試劑有DL2000 DNA Marker、2×Tap Master Mix酶、核酸染料、革蘭氏染色液、瓊脂糖、藥敏片；培養基有梭菌增菌培養基（RCM）、羊血瓊脂基礎培養基、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基（TSC）、無菌脫纖維綿羊血等。

1.3 細菌分離

取適量糞便樣品接種于梭菌增菌培養基，43 ℃厭氧培養12 h；吸取產氣的液體培養基200 μL接種于胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基，43 ℃厭氧培養36 h；挑取黑色圓形扁平菌落接種于梭菌增菌培養基上增菌8 h，劃線培養于7%綿羊血瓊脂培養基，43 ℃厭氧培養24 h，若發現有溶血環的單菌落，純化3次，進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生化鑒定

依據伯杰氏細菌鑒定手冊[5]，將純化增殖后的菌液接種于生化鑒定管中，43 ℃厭氧培養24 h，觀察并記錄試驗結果。

1.5 分離株16S rRNA基因鑒定

參考石蕓等[6]的方法合成細菌16S rRNA基因通用引物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′?；驍U增體系（50 μL）：上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應程序參考2×Tap Master Mix酶說明書進行。將PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將符合目的條帶大小的PCR產物委托擎科生物科技有限公司成都分公司測序，并進行BLAST比對。

1.6 毒素分型

參考Rood等[7]的方法對產氣莢膜梭菌進行毒素分型，其分型引物如表1所示。CpA、CpB、Etx、Ia基因檢測多重PCR反應體系：上、下游引物各1 μL，2×Taq Mix酶2 5 μL，模板2 μL，ddH2O 15 μL。CpE和NetB的PCR反應體系：上、下游引物各1 μL，2×Taq Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應程序參考2×Tap Master Mix酶說明書進行。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結果，具體判定標準見表2。

表1 產氣莢膜梭菌多重PCR引物信息

表2 產氣莢膜梭菌毒素分型標準

1.7 藥敏試驗

將分離株接種到梭菌增菌培養基43 ℃厭氧培養至OD600nm=0.8，取300 μL菌液均勻涂布于MH瓊脂平板，粘貼藥敏片，43 ℃厭氧培養24 h，測定抑菌圈大小。參照《抗菌藥物敏感性試驗執行標準》及杭州微生物試劑公司藥敏試驗標準對分離菌的藥物敏感性進行判定[10]。

2 結果

2.1 細菌分離結果

經分離得到3株疑似藏豬源產氣莢膜梭菌，記作Z-1、Z-2、Z-3。以上3株疑似藏豬源產氣莢膜梭菌的菌株在梭菌增菌培養基中培養時可觀察到明顯的產氣現象，在TSC培養基中長出黑色菌落，在7%綿羊血瓊脂平板中培養時出現有典型溶血環的灰白色單菌落，且革蘭氏染色鏡檢下為紫色直桿菌。

2.2 生化試驗結果

生化鑒定結果顯示，3株疑似藏豬源產氣莢膜梭菌對卵磷脂酶、甘露糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖呈陽性，對酪蛋白、水楊苷、脂酶、吲哚呈陰性。分離菌株生化特性鑒定結果均符合產氣莢膜梭菌的生化特征。

2.3 16S rRNA基因鑒定結果

分離菌16S rRNA基因檢測結果顯示，約1 500 bp處出現條帶。將測序結果在NCBI網站Nucleotide數據庫中進行比對發現，3株分離菌與產氣莢膜梭菌的相似性較高，為99.5%～100%。

2.4 毒素分型結果

毒素分型檢測結果顯示，3株分離菌均含有CpA毒素基因（324 bp），未檢測出其他毒力基因。結合比對結果判定3株分離菌株均為A型產氣莢膜梭菌。PCR凝膠電泳結果見圖1。

圖1 產氣莢膜梭菌多重PCR分型凝膠電泳結果

2.5 藥敏試驗結果

3株藏豬源產氣莢膜梭菌均對阿莫西林、磺胺甲噁唑耐藥，其中Z-3株的耐藥情況較為嚴重，對20種藥物耐受，具體結果見表3。

表3 藥敏試驗結果

3 討論

本研究通過細菌的分離培養、生化試驗、16S rRNA基因檢測、PCR毒素分型，分離鑒定出3株藏豬源產氣莢膜梭菌，均為A型，分離率為37.5%。張漢云等[11]對我國湖南、浙江、福建、廣東等4省8市的規?；i場的74份豬糞便樣品進行了產氣莢膜梭菌檢測，同樣發現分離到的31株產氣莢膜梭菌均為A型；候照峰等[12]分離到的4株鵝源產氣莢膜梭菌同樣為A型；吳丹等[9]對青海牦牛源產氣莢膜梭菌的鑒定發現，14株分離株中10株為A型。以上研究結果表明臨床上流行的產氣莢膜梭菌優勢菌株為A型。

產氣莢膜梭菌主要侵害1周齡仔豬，俗稱仔豬紅痢，但在育肥豬、母豬上也常有報道，感染后表現為血痢，腹部脹氣且病程短，又稱猝死癥。豬感染的產氣莢膜梭菌病主要是由A型、C型引起的一種急性、致死性腸道傳染病[13]。本研究分離到的菌株均為A型，表明加查縣藏豬有患仔豬紅痢、猝死癥的風險，可以采用二氧化氯對產房、豬舍、周圍環境進行消毒，母豬臨產前清洗乳頭，從而減少產氣莢膜梭菌病的發生和傳播。

本研究發現3株藏豬源產氣莢膜梭菌對青霉素類、β-內酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類、喹諾酮類、氟喹諾酮類、多肽類、磺胺類、硝基呋喃類、氯霉素類等藥物表現出不同程度的耐藥性。楊麗等[13]對4株豬源產氣莢膜梭菌的耐藥性進行研究，發現分離株對阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、麥迪霉素、阿奇霉素、林可霉素、桿菌肽、多粘菌素B、復方新諾明、甲氧芐啶表現出完全耐藥性；蔣增海等[14]對1株豬源產氣莢膜梭菌的耐藥性進行檢測，發現其對青霉素和磺胺甲噁唑表現出完全耐藥性，表明豬源產氣莢膜梭菌耐藥性較為嚴重。在生豬養殖過程中，應合理使用抗生素，防止濫用，避免耐藥菌株產生。