BTK抑制劑LOXO-305的合成工藝研究

項良華 王 霞 袁 昕 姜虹羽 王 杰 唐春雷

(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫 214122)

LOXO-305(1)的化學結構如圖1所示,是由Redx Pharma公司開發,后被禮來公司收購的一種處于3期臨床研究階段的口服非共價布魯頓酪氨酸激酶(BTK)抑制劑。BTK是一種非受體蛋白酪氨酸激酶(Tec)家族的細胞質激酶,由調節不同信號通路(包括PI3K、MAPK和NF-κB等)的造血細胞和漿細胞表達[1, 2]。BTK是B淋巴細胞(B細胞)受體通路的重要信號分子,在B細胞的各個發育階段表達,B細胞的異常激活被證明在B細胞惡性腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥的發病機制中起核心作用[3]。過去十年已經開發了相當數量的BTK抑制劑,第一代和第二代主要是共價抑制劑(圖2),第三代主要是非共價抑制劑,其開發處于早期階段。伊布替尼(2)是首創的共價BTK抑制劑,已被批準用于治療套細胞淋巴瘤和邊緣區淋巴瘤,目前正在研究用于其他血液系統惡性腫瘤患者[4]。然而,伊布替尼的治療相關不良反應(AE)限制了其在癌癥治療中的應用,在臨床研究中,一些不良事件導致大量(9～23%)患者停止治療[5-8]。

圖1 LOXO-305Fig. 1 LOXO-305

圖2 目前上市的BTK抑制劑Fig. 2 BTK inhibitors currently on the market

此外,耐藥突變體的產生減少了它們的使用,特別是,用絲氨酸殘基等位替換481號位半胱氨酸(Cys481)降低了不可逆BTK抑制劑的主要活性。然而,不與Cys481相互作用的可逆抑制劑可以抑制C481R、T474I和T474M突變體,這成為一種新的開發方向。LOXO-305,一種可逆抑制劑,適用于BTK和BTK的不同變體C481突變,具有高靶向效力(IC50<1×10-9mol·L-1),對體外檢測的370種激酶中超過98%表現出大于300倍的選擇性,在1 mmol·L-1時對非激酶脫靶沒有顯著抑制[9]。LOXO-305有望在對伊布替尼產生耐藥性而復發的疾病中表現出有效的治療活性。本文對LOXO-305的合成方法進行研究,以期為該化合物及結構類似物的研究提供理論參考。

1 合成路線

目前,只有原研公司報道了LOXO-305的合成路線[10](圖3):以5-氟-2-甲氧基苯甲酸(X1)為起始原料,在氮氣氛圍下以乙腈(ACN)為溶劑,與二氯亞砜(SOCl2)反應,得到酰氯衍生物X2,然后4-氨甲基苯甲酸與X2偶聯得到產物X3;產物X3再以同樣的條件制成X4,隨后與丙二腈偶聯得到中間體X5;中間體X5在92 ℃條件下與原甲酸三甲酯(TMOF)反應得到產物X6;產物X6與2,2,2-三氟-1-甲基乙基肼在三乙胺(TEA)的催化下環合得到環合產物X7;環合產物X7再經氰基水解得到終產物LOXO-305。

圖3 LOXO-305的合成路線Fig. 3 Synthetic route of LOXO-305

原研專利的合成路線步驟為七步反應,較為煩瑣,增加了工藝成本,另外部分中間體需要經過兩次酰氯反應,容易產生大量毒廢氣體,不利于環保,限制了該合成路線在工業生產中的應用。作者同樣以5-氟-2-甲氧基苯甲酸(X1)為起始原料,經兩步縮合反應即可得到關鍵中間體N-((4-(2,2-二氰基-1-羥基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X5)(圖4),反應條件溫和,避免了使用?；噭?且收率高達90.4%,大大降低了工藝成本。另外,4-氨甲基苯甲酸原料在有機溶劑中的溶解度極差,大大延長了反應時間,影響收率。改進工藝中選擇氫氧化鈉(NaOH)水溶液作溶劑,能很好地溶解該原料,在室溫下僅3 h就能反應完全。優化之后的工藝路線不僅提高了總收率,降低了生產成本和能耗,而且反應條件相對溫和,后處理操作簡便,適合工業化制備。

圖4 LOXO-305優化的合成路線Fig. 4 Optimized synthetic route of LOXO-305

2 合成實驗

2.1 主要儀器與試劑

LCMS-80質譜儀,日本島津公司;LC1260色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;Bruker AVII-400 MHZ核磁共振儀,德國Bruker公司,TMS為內標。實驗所用試劑均為市售分析純或化學純,未經進一步純化處理。

2.2 合成步驟

2.2.1 4-(((5-氟-2-甲氧基苯甲?；?氨基)甲基)苯甲酸(X3)的制備

5-氟-2-甲氧基苯甲酸(5g,29 mmol)溶于60 mL四氫呋喃(THF)中,冰浴條件下加入N,N-羰基二咪唑(CDI)(4.7 g,29 mmol)攪拌30 min,將上述反應液緩慢滴加至4-氨甲基苯甲酸(4.4 g,29 mmol)的NaOH溶液中(1 mol·L-1),滴畢,移至室溫反應3 h。薄層色譜法(TLC)監測原料反應完畢。用5 mol·L-1HCl調pH至3～4,溶液變澄清,減壓濃縮至體積20 mL左右,大量固體析出,抽濾,濾餅用乙醇(EtOH)淋洗2次,置于真空干燥箱干燥過夜,得白色固體8.7 g,收率98.2%。ESI-MS m/z: 304.1[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ12.85 (s, 1H), 8.87 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.91 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.50 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.44 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.37～7.31 (m, 1H), 7.19 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.56 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H).

2.2.2 N-((4-(2,2-二氰基-1-羥基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X5)的制備

在氮氣氛圍,冰浴條件下向1-羥基苯并三唑(HOBT)(3.8 g,29 mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(5.3 g,29 mmol)、X3(8.5 g,28 mmol)和丙二腈(2.2 g,34.8 mmol)的THF(100 mL)溶液中緩慢滴加TEA(8.5 g,87 mmol),滴畢,將混合物移至室溫下攪拌反應6 h。TLC監測原料反應完畢。減壓濃縮,加入乙酸乙酯溶解,用飽和碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液洗一次,飽和氯化銨(NH4Cl)水溶液洗一次,有機相再用5 mol·L-1HCl洗滌一次,有機相用無水硫酸鈉干燥,抽濾,減壓濃縮得白色固體9.1 g,收率92.1%。ESI-MS m/z: 352.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.80 (t,J=6.2 Hz, 1H), 7.56～7.46 (m, 3H), 7.37～7.26 (m, 3H), 7.17 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.50 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H).

2.2.3 N-((4-(2,2-二氰基-1-甲氧基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X6)的制備

將X5(9 g,25.6 mmol)加入原甲酸三甲酯(TMOF)(80 mL)的溶液中,升溫到100 ℃攪拌反應10 h。TLC監測原料反應完畢。減壓濃縮得棕色油狀物8 g,直接用于投下一步反應,收率85.1%。ESI-MS m/z: 366.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.94 (t,J=6.2 Hz, 1H), 7.69～7.62 (m, 2H), 7.60～7.48 (m, 3H), 7.35 (ddd,J=9.0, 7.9, 3.3 Hz, 1H), 7.19 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.61 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.90 (d,J=2.2 Hz, 6H).

2.2.4 N-((4-(5-氨基-4-氰基-1-((1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基)-1H-吡唑-3-基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X7)的制備

冰浴條件下將(1,1,1-三氟丙烷-2-基)肼鹽酸鹽(77 mg,0.59 mmol)溶于EtOH(2 mL)溶液中,滴加TEA(55 mg,0.54 mmol),攪拌30 min,然后再將上述溶液滴加入X6(200 mg,0.54 mmol)的EtOH溶液中,將混合物移至室溫下攪拌反應12 h。TLC監測原料反應完畢。溶液冷卻到0 ℃,抽濾,固體用EtOH洗3次,置于真空干燥箱干燥過夜,得白色固體200 mg,收率80.3%。ESI-MS m/z: 462.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.84 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.75 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.51 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.43 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33 (td,J=8.5, 3.3 Hz, 1H), 7.18 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 7.09 (s, 2H), 5.30 (p,J=6.7 Hz, 1H), 4.53 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 1.65 (d,J=6.8 Hz, 3H).

2.2.5 LOXO-305(1)的制備

將X7(200 mg,0.43 mmol)加入甲基磺酸(MsOH)(2 mL)的溶液中,于85 ℃攪拌反應3 h。TLC監測原料反應完畢。用NaOH溶液調pH至11左右,有固體析出,抽濾,固體用水洗3次,置于真空干燥箱干燥過夜,得黃色固體120 mg,收率(58.2%),純度為99.5%[HPLC面積歸一化法,色譜柱為Horizon C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為體積分數0.1%的三氟乙酸水溶液,流動相B為乙腈(梯度洗脫:0～1 min B 5%～20%, 1～11 min B 20%～40%, 11～11.2 min B 40%～95%, 11.2～13.2 min B 95%, 13.2～13.5 min B 95%～5%, 13.5～15 min B 5%);檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:40 ℃]。ESI-MS m/z: 480.1[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.84 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.51 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.44 (q,J=8.1 Hz, 4H), 7.37～7.30 (m, 1H), 7.18 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 6.67 (s, 2H), 5.29 (p,J=7.2 Hz, 1H), 4.55 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 1.61 (d,J=6.8 Hz, 3H).

3 結果與討論

3.1 中間體X3的方法優化

在合成化合物X3時,原研路線分為兩步,先使用二氯亞砜作?；噭?將中間體制成酰氯,隨后再與4-氨甲基苯甲酸偶聯得到中間體X3,反應過程中既要控水,還要氮氣保護,操作煩瑣,而且受4-氨甲基苯甲酸溶解度的影響,總反應時長達20 h,且存在原料剩余問題。本工藝路線改用低成本的CDI縮合劑,兩原料物質的量比為1∶1時一步反應即可得到中間體X3,室溫下僅3 h即可反應完全,且不存在原料剩余問題,大大縮短了反應時間,收率提高至98.2%,后處理只要調節pH至3～4,減壓濃縮一定量的溶劑,過濾干燥即得化合物X3,此步反應后處理避免了打漿操作,在保證純度和收率的同時,簡化了操作,更符合工業生產的要求。

3.2 中間體X5的方法優化

在合成化合物X5時,原研路線分為兩步,先使用二氯亞砜作?；噭?將中間體制成酰氯,隨后再與丙二腈偶聯得到中間體X5,反應過程中既要控水,還要氮氣保護,操作煩瑣,總反應時長達20 h;本工藝路線改用縮合劑EDCI,一步反應即可得到中間體X5,室溫下僅6 h即可反應完全,大大縮短了反應時間,收率提高至92.1%,后處理只要用堿水和酸水洗去反應體系中的HOBT,即得化合物X5,在保證純度和收率的同時,簡化了操作,更符合工業生產的要求。

3.3 中間體X6的方法優化

在合成化合物X6時,原研路線需要在92 ℃反應18 h;本工藝路線將溫度提高至100 ℃,反應時長降低至10 h,很大程度上減少了反應時間,后處理只要旋蒸去除TMOF,直接投下一步反應即可,在保證后一步收率的同時,簡化了操作。

4 結論

本文改進了LOXO-305的合成路線,以5-氟-2-甲氧基苯甲酸為起始原料,經兩步簡單的縮合反應得到關鍵中間體X5,很大程度地減少了反應時長,降低了合成成本。中間體X5經甲基化、關環反應、水解反應得到目標化合物LOXO-305,純度為99.5%,改進后的工藝路線總收率為35.9%。該方法使用的試劑簡單易得,后處理操作簡便,產物純化多采用水洗,避免柱層析分離,便于放大生產,可為LOXO-305及其衍生物的合成提供參考。