郭君鑫,林天寶,呂志強*
(1. 畫水君鑫家庭農場,浙江 東陽 322102; 2. 浙江省農業科學研究院 蠶桑與茶葉研究所,浙江 杭州 310021)
便秘是現代人群中比較常見的一種腸道疾病,特別是在老年人群多發,同時給患者帶來一些并發癥[1]。近年來,伴隨著現代飲食結構的改變和生活節奏加快,便秘的發病率顯著升高,嚴重影響著國民的身體健康[2]。中醫藥已被證實在臨床上具有良好的便秘預防與治療療效。
桑椹(Fructus Mori),又名桑果、桑棗、文武實等,為桑屬??粕涞某墒旃麑?,是一種美味、營養價值高的漿果類水果;同時,桑椹還是我國一味傳統中藥材,入藥始載于唐代《新修本草》;味甘、性寒;歸心、肝、腎經[3]。桑椹,具有滋陰補血、生津潤腸、填精補腦等功效;具有良好的抗氧化、抗微生物、抗高血糖、抗高脂血癥、抗炎、抗癌作用,常用于眩暈耳鳴,心悸失眠,須發早白,津傷口渴,內熱消渴,血虛便秘[4]。
桑椹已經被臨床上證實具有治療便秘的作用,但其主要活性成分、作用靶點與調控機制等尚不明確。因此,本研究以桑椹為研究對象,運用網絡藥理學方法篩選桑椹治療便秘的有效成分及潛在靶點,并進行生物信息學分析,得到桑椹分子作用機制,為進一步理論研究及臨床應用提供科學依據。
從TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫中輸入“桑椹”,檢索藥物化學組分及該組分靶基因,以口服生物利用度(OB)>30%,并且化合物類藥性(DL)>0.1為篩選條件,檢索桑椹的主要化學成分并收集化合物的相應靶點。
從Gene Cards、OMIM共2個疾病相關靶點的數據庫中檢索便秘相關靶點,篩選關鍵詞設置為“constipation”,設定物種為“Homosapiens”,取2數據庫共性靶點為便秘相關靶點。
利用R語言,對“1.1”與“1.2”所得到的桑椹預測作用靶點和疾病靶點集合的靶點名稱,取交集,得到桑椹治療便秘的靶點。
將上述分析得到的桑椹作用便秘主要化合物以及對應靶點,導入Cytoscapev3.9.1中進行可視化,得到藥材-化合物-靶點-疾病網絡圖,并對網絡圖進行分析。
將篩選到的靶點蛋白于STRING 數據庫(https://string-db.org/)進行PPI網絡模型構建,選擇“Homo Sapiens”為分析的生物體,置信度得分設置為最高置信度(0.900)之后進行整合和評估。
在DAVID網站(https://david.ncifcrf.gov/)進行靶點的基因本體(GO)功能分析和KEGG(京都基因與基因組百科全書,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。
從TCMSP(https://old.tcmsp- e.com/tcmsp.php)數據庫中輸入“桑椹”,設置口服生物利用度(OB)>30%”、“DL>0.1”,得到桑椹中12種活性成分,見表1,共獲得370個預測靶點。從Gene Cards、OMIM共2個疾病相關靶點的數據庫中檢索便秘相關靶點452個。通過取交集,共找到桑椹化合物治療便秘靶點211個。
將桑椹與交集靶點導入Cytoscape中,得到藥材-化合物-靶點-疾病通路網絡,結果見圖1。圖中節點數量有214個,349條邊,平均相鄰節點數量為3.24。在化合物中節點最大為quercetin 和oleic acid,提示桑椹主要通過quercetin和oleic acid調控靶點發揮治療便秘的功效。此網絡中度值排名前5 的靶點為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1和PPARG。
圖1 化合物-靶點-疾病網絡圖Fig. 1 Network of ingredients,targets,and disease
將211 個靶點導入String 數據庫,以互作分數(Interaction score)≥0.9為參照,獲取PPI網絡,共獲取39個節點,100條邊,平均度值為1.59,見圖2。通過Degree分析識別篩選其中的hub蛋白,hub蛋白包括:AR、AKT1、BCL2、CREBBP、FABP1、HMGCR、RXRA、PPARD、PPARG、MMP1、MMP2、TIMP1、TIMP2。
圖2 桑椹-便秘靶點PPI網絡Fig. 2 Ppi network of targets of mulberry fruits for constipation therapy
在線對于桑椹治療便秘的作用靶點進行GO與KEGG 富集分析。通過GO 富集分析,211 靶點顯著富集于127 個GO 分類(P<0.05),其中,分子功能(MF)29個、細胞組分(CC)12個、生物學過程(BP)86個,3 個分類排名前10 位分類如圖3 所示。分子功能分類,靶點主要富集于鋅離子結合(zinc ion binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)與酶結合(enzyme binding);細胞組分主要富集于液泡(cytosol)、細胞質膜(plasma membrane)和膜的整體成分(integral component of membrane);生物學過程主要富集于藥物反應(response to drug)、炎癥應答(inflammatory response)和凋亡過程的負調控(negative regulation of apoptotic process)。
圖3 桑椹防治便秘作用靶點GO富集分析柱狀圖Fig. 3 Histogram of GO enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy
KEGG功能注釋富集分析結果顯示,211個作用靶點顯著富集到28條信號通路(P<0.05),前20條信號通路如圖4 所示??梢钥闯?,PPAR 信號通路(PPAR signaling pathway)、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease)、糖尿病并發癥AGR 受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、脂肪細胞內脂類分解調控(regulation of lipolysis in adipocytes)及藥物代謝-細胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)等。
圖4 桑椹防治便秘作用靶點KEGG富集分析氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy
桑椹性味甘寒,人肝腎經,具有滋陰補血、生津潤燥功效,能治心腎不交或習慣性便秘(閩南民間草藥)[5]。
本研究結果從數據庫中篩選出桑椹候選活性化合物12 個,預測潛在參與便秘治療的相應靶點211 個。通過構建活性成分和靶點網絡模型并分析結果,發現度值較高的候選活性分子分別是quercetin 和oleic acid,度值較高的靶點為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1 和PPARG,提示桑椹主要通過quercetin 和oleic acid 調控這些靶點發揮治療便秘的功效。通過富集分析和通路分析得出,桑椹中活性成分的靶點主要參與的生物過程包括鋅離子結合、氧化還原酶活性、液泡、藥物反應與炎癥應答等,主要在PPAR 信號通路、酒精性肝病、糖尿病并發癥AGR 受體信號通路等發揮其藥理作用。