基于轉錄組測序分析轉化生長因子-β1誘導腎纖維化機制

李華男，李佩芬，李善義，張雪瑩，董欣茹，楊 明，沈維干

1.揚州大學醫學院細胞生物學教研室 江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，江蘇 揚州 225009

2.揚州大學附屬醫院腎內科，江蘇 揚州 225009

腎纖維化是許多進行性腎臟疾病的共同表現，其特征是正常組織結構逐漸被ECM（如膠原、蛋白聚糖和糖蛋白）所取代［1-2］，直接原因是間質成纖維細胞增殖并分化為肌成纖維細胞，導致ECM 過度合成［3］。Kuppe 等［4］通過單細胞轉錄組測序發現，血小板源生長因子受體α 陽性且血小板源生長因子受體β 陽性的成纖維細胞/肌成纖維細胞是人腎纖維化瘢痕形成的主要來源。TGF-β1是一種多功能的細胞因子，是促進成纖維細胞分化為促纖維化表型和產生ECM 的主要介質［5-6］。通過多種途徑靶向TGF-β1可抑制腎纖維化，部分靶向藥物已用于臨床研究［7-9］。然而，TGF-β1 不僅參與纖維化過程，還參與炎癥反應、免疫調節等，直接阻斷TGF-β1 信號通路可能帶來諸多副作用，限制了其作為一種抗纖維化治療方法在臨床上的應用［7-9］。因此，了解TGF-β1 誘導纖維化的機制和TGF-β1 信號通路下游的效應分子將有助于探索預防和抑制腎纖維化的方法。

TGF-β1 誘導的正常大鼠腎成纖維細胞NRK-49F 是典型的體外腎纖維化細胞模型。Zhou等［10］采用質譜法對TGF-β1 處理48 h 的NRK-49F細胞和對照細胞的細胞裂解物及條件培養基在蛋白質組水平進行分析。與對照組比較，在NRK-49F細胞的細胞裂解物中鑒定出628種差異表達的蛋白質，在條件培養基中鑒定出62種差異表達的蛋白質。TGF-β1 調節的細胞裂解物蛋白表現為核糖體蛋白增加，參與多種代謝途徑的蛋白質失調，包括醛脫氫酶3 家族成員A1 減少、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1和肌苷單磷酸脫氫酶2 增加；酶聯免疫吸附試驗結果顯示，TGF-β1處理組膠原降解調節因子（絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族E 成員1 增加、基質金屬蛋白酶3 減少）、膠原交聯因子（前膠原-賴氨酸、2-氧葡萄糖酸5-雙加氧酶2 增加）、信號分子（細胞通信網絡因子1、細胞通信網絡因子2 和Tsukushi 增加，細胞通信網絡因子3 減少）和趨化因子（C-C 基序趨化因子配體2、C-C 基序趨化因子配體7 增加）的分泌異常［10］。然而，由于轉錄和翻譯的調控作用，基因在轉錄水平與翻譯水平的表達可能存在差異。TGF-β1 作用于成纖維細胞不同時間后基因的表達可能不同，TGF-β1僅處理48 h可能會丟失一些早期表達的差異基因；此外，由于基因的表達經歷先轉錄后翻譯的過程，蛋白質組比轉錄組提供的診斷信息晚［11］。因此，上述研究在尋找TGF-β1 信號通路下游的潛在靶點上存在局限性［10］。本研究使用轉錄組測序技術檢測了TGFβ1 處理6、12 和24 h 的NRK-49F 細胞轉錄組，匯總了表達上調和下調的基因、差異表達基因參與的生物過程和信號通路，并采用qRT-PCR 在動物模型和數據庫慢性腎臟病患者的轉錄組數據中進行驗證，為更好地理解TGF-β1 誘導的腎纖維化機制以及研發新的診斷和治療方案提供參考。

1 材料和方法

1.1 細胞、動物、試劑和儀器

正常大鼠腎成纖維細胞株NRK-49F 購自中國科學院細胞庫。8 周齡C57B/L6 小鼠（體重約20 g）購自揚州大學比較醫學中心，動物在通風、室溫為24 ℃的動物房中飼養，進行12 h 光照、12 h 黑暗的循環，所有動物均可自由獲得食物和水。動物實驗方案通過揚州大學醫學院倫理委員會審查（YXYLL-2021-05），符合美國國立衛生研究院發布的《實驗動物護理和使用指南》。

DMEM/F12 培養基、胎牛血清為賽澳美細胞技術（北京）有限公司產品；青霉素/鏈霉素為武漢賽維爾生物科技有限公司產品；重組小鼠/大鼠TGF-β1為北京義翹神州科技股份有限公司產品；TRIzol 試劑為美國Invitrogen 公司產品；戊巴比妥鈉為北京方程生物科技有限公司產品；HiScript Q RT SuperMix 試劑盒和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品。PCR 儀為德國Eppendorf 公司產品；ABI 7500實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.2 細胞培養及處理

NRK-49F 細胞在含10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12 培養基中，置于37 ℃、5%二氧化碳的培養箱中培養。加入終濃度為5 ng/mL的TGF-β1 處理6、12 和24 h 后收集細胞，同期收集未經TGF-β1處理的對照細胞。

1.3 轉錄組測序文庫構建及測序

轉錄組測序文庫構建及測序由武漢愛基百客生物科技有限公司完成，主要步驟如下:使用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA，并使用Qsep1儀器評估所有RNA 樣品的完整性；取3 μg 總RNA，采用MGIEasy mRNA 文庫制備試劑盒構建RNA文庫（具體包括使用Oligo-dT磁珠分離polyA富集的mRNA、mRNA 片段化、片段化的mRNA 逆轉錄合成cDNA、末端修復、加堿基A 并連接測序接頭）；文庫在Illumina 測序平臺（Illumina NovaSeq 6000）上使用武漢愛基百客生物科技有限公司的雙末端技術進行測序。

1.4 轉錄組測序結果的生物信息學分析

1.4.1 識別差異表達基因 通過Cutadapt 1.11過濾出銜接子和低通量測序片段，然后使用Hisat 2 2.1.0 將純化的測序片段與大鼠參考基因組RN6進行比對［12-13］。將所有樣本的比對信息使用Stringtie 2.0.4 進行轉錄本重構。使用RSEM 1.2.6 評估轉錄本的豐度，并將表達值標準化為FPKM（每千個堿基的轉錄本每百萬映射讀取的片段數）［14］。差異表達基因用DESeq2 進行鑒定，FDR 低于0.05 且log2FC 絕對值大于1 的基因作為差異有統計學意義的基因。使用R 語言中的ggplot2 包繪制火山圖展示差異表達基因的分布，使用Venn Diagram 包繪制維恩圖展示TGF-β1 處理6、12 和24 h 后差異表達的交集基因數，使用pheatmap 包對差異表達基因進行層次聚類并繪制熱圖，展示組間差異和差異基因表達的動態變化。

1.4.2 差異表達基因的GO 和KEGG 通路富集分析 使用R 語言中的ClusterProfiler 包對差異表達基因分別進行GO 和KEGG 通路富集分析［15-16］。按照FDR低于0.05篩選富集結果。

1.5 轉錄因子的篩選

根據美國國家生物技術信息中心在線網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的基因信息，在差異表達的基因中篩選編碼轉錄因子的基因。

1.6 動物模型驗證TGF-β1 信號通路下游的轉錄因子

C57B/L6 小鼠在造模前禁食8 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，無菌條件下剪開小鼠皮膚及肌層至腹膜后，通過中線切口暴露并游離左側輸尿管，并用4-0 絲線在腎盂下方5 mm處結扎兩次，建立UUO誘導的腎纖維化小鼠。手術對照組以類似方式處理，但不結扎輸尿管。造模7 d 后收取小鼠腎組織，去包膜，使用TRIzol 試劑提取總RNA。

1.7 通過數據集GSE104954 驗證TGF-β1 信號通路下游的轉錄因子

為了進一步證實腎纖維化的潛在靶點，從高通量基因表達數據庫中篩選GSE104954 數據集，并在數據集中選擇健康對照（活體捐獻者）、糖尿病腎病患者和IgA 腎病患者數據，使用GEO2R 工具篩選上述數據集中糖尿病腎病患者和IgA 腎病患者腎組織標本分別相對于健康對照腎組織標本間的差異表達基因，篩選條件為FDR 低于0.05和log2FC 絕對值大于1。使用Prism Graph 8.0 軟件繪制相關轉錄因子的表達圖譜。

1.8 qRT-PCR檢測相關基因的表達

使用HiScript Q RT SuperMix 試劑盒將1 μg總RNA 進行逆轉錄，合成cDNA。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒進行定量PCR 檢測。實驗中所使用的引物見表1。PCR 條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40 次擴增。使用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀進行定量PCR 檢測，每個基因的表達量表示為β-actin的倍數，每組進行三次獨立重復實驗。

表1 定量逆轉錄聚合酶鏈反應中所使用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.9 統計學方法

采用Prism Graph 8.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，兩組樣本之間比較采用雙側Student’st檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TGF-β1 誘導的體外纖維化模型構建成功

qRT-PCR 結果顯示，纖維化相關基因Acta2、Col1a1和Col3a1的表達在TGF-β1處理后顯著上調（圖1），提示TGF-β1 誘導的體外纖維化細胞模型構建成功。

圖1 TGF-β1處理組與對照組腎纖維化相關基因的mRNA表達Figure 1 The mRNA expression of renal fibrosis-related genes in TGF-β1 treated group and the control group

2.2 TGF-β1誘導的差異表達基因

高通量轉錄組測序結果顯示，與對照組比較，TGF-β1 處理6 h 時有552 個基因差異表達，其中291 個基因表達上調，261 個基因表達下調；TGF-β1 處理12 h 時有1209 個基因差異表達，其中363 個基因表達上調，846 個基因表達下調；TGF-β1處理24 h時有1028個基因差異表達，其中342個基因表達上調，686個基因表達下調（圖2）。將三個時間點的差異表達基因取交集，共有207個基因在TGF-β1 處理6、12 和24 h 時均差異表達，其中89個基因在三個時間點均上調，110個基因在三個時間點均下調（圖3）。聚類分析顯示兩個主要分支，即對照組和TGF-β1處理組（圖4）。以上結果表明，TGF-β1處理后成纖維細胞中的基因表達出現變化，且與TGF-β1誘導的時間相關。

圖2 TGF-β1處理6、12、24 h后表達變化基因的火山圖Figure 2 Volcano plot for the differentially expressed genes after TGF-β1 treated for 6， 12， 24 h

圖3 TGF-β1處理6、12、24 h后表達變化基因的維恩圖Figure 3 Venn diagram of differentially expressed genes after TGF-β1 treated for 6， 12， 24 h

圖4 TGF-β1處理組與對照組基因表達分層聚類和熱圖Figure 4 Hierarchical clustering and heatmap showing the genes expression in TGF-β1 treated group and the control group

2.3 差異表達基因GO分析和KEGG分析結果

GO 分析結果顯示，前二十個富集條目集中在生物過程上。其中，TGF-β1 處理6 和12 h 差異表達的基因主要富集在組織發育（tissue development）和小管發育（tube development），而TGF-β1 處理24 h 差異表達的基因主要富集在細胞遷移的調控（regulation of cell migration）。細胞死亡的調控（regulation of cell death）、細胞凋亡的調控（regulation of apoptotic process）和程序性細胞死亡的調控（regulation of programmed cell death）僅出現在TGF-β1 處理6 h差異表達的基因中，而細胞對細胞因子刺激的反應（cellular response to cytokine stimulus）、對含氧化合物的反應（response to oxygen-containing compound）和對細胞因子的反應（response to cytokine）僅出現在TGF-β1 處理24 h 差異表達的基因，見圖5。結果提示，TGF-β1 作用后，成纖維細胞中與差異表達基因相關的分子過程和生物途徑發生改變，且與TGF-β1誘導的時間相關。

KEGG 富集分析結果顯示，在TGF-β1誘導早期（TGF-β1 處理6 h）主要表現為Hippo、TGF-β、Wnt 信號通路的變化，而在TGF-β1 誘導晚期（TGF-β1處理24 h）主要表現為ECM 受體相互作用、局灶黏附和黏附分子連接等相關通路的改變，見圖6。結果提示，TGF-β1 作用后，成纖維細胞中差異表達基因參與的信號通路發生改變，且與TGF-β1 誘導的時間相關。

2.4 腎間質成纖維細胞中TGF-β1信號通路下游的轉錄因子

對TGF-β1處理6 h時差異表達基因中編碼轉錄因子的基因進行篩選發現，影響上述生物過程和信號通路的基因主要集中在上調的基因中。在TGF-β1 處理6 h 時291 個上調的差異表達基因中，Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7、Foxc2、Glis1這13 個基因可以編碼轉錄因子，其中部分轉錄因子在TGF-β1處理12、24 h 時較對照組也上調（圖7）。qRT-PCR驗證發現，在細胞模型中，TGF-β1可以誘導其中9個編碼轉錄因 子 基 因（Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Myc、Tcf7）的表達（圖8），其余4 個基因的表達水平在TGF-β1 處理后沒有顯著變化。在動物腎纖維化模型中，上述9個編碼轉錄因子基因中Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Myc和Tcf7這7 個編碼轉錄因子基因顯著上調，而Vdr顯著下調，Lef1沒有變化，見圖9。

圖7 熱圖顯示13個轉錄因子的表達Figure 7 The heat map shows the expression changes of 13 transcription factors

圖8 九種轉錄因子基因在細胞模型中的表達水平Figure 8 Expression levels of 9 genes in cell models

圖9 九種轉錄因子基因在腎纖維化動物模型中的表達水平Figure 9 Verifying the expression levels of 9 genes in animal models of renal fibrosis

數據集GSE104954驗證結果顯示，IRF8在糖尿病腎病患者（1.149±0.119）和IgA 腎 病 患 者（1.077±0.098）的腎小管間質中相比健康對照（1.000±0.093）顯著高表達（均P＜0.01），MYC在 糖 尿 病 腎 病 患 者（1.100±0.075）中 相 比 健 康 對 照（1.000±0.088）高表達（P＜0.01），而其他7個基因的表達產物與對照組比較差異無統計學意義。以上結果提示，Irf8和Myc可能是腎纖維化的潛在干預靶點。

3 討 論

腎纖維化是糖尿病、高血壓、免疫復合物沉積等引發的慢性腎臟病的共同病理特征，表現為ECM 合成與降解的失調［1-2］。TGF-β1等細胞因子誘導間質成纖維細胞增殖并分化為肌成纖維細胞，導致ECM 過度合成，是腎纖維化發生的直接原因［3］。深入了解TGF-β1 誘導纖維化的機制和TGF-β1 信號通路下游的效應分子將有助于探索預防和抑制腎纖維化的方法。相比蛋白質組，轉錄組的變化更為提前，因此可以為診斷提供更早期的信息。本研究采用轉錄組測序技術檢測了TGF-β1處理6、12和24 h后NRK-49F細胞和對照細胞的基因表達譜，對差異表達的基因進行了全面分析，為進一步了解TGF-β1 誘導腎纖維化的機制提供了信息。

本文資料顯示，TGF-β1 處理6、12 和24 h 后，分別有552、1209 和1028 個差異表達基因。GO分析表明，這些差異表達基因在發育、細胞死亡和細胞遷移過程中顯著富集，而Zhou等［10］的蛋白質組研究顯示差異表達蛋白主要富集在翻譯、氧化還原過程、對藥物的反應等生物過程，進一步證明了TGF-β1 處理的成纖維細胞在轉錄和翻譯水平的差異。KEGG 分析顯示，在TGF-β1誘導的早期主要表現為Hippo、TGF-β、Wnt 信號通路的變化，與之前的研究報道TGF-β 信號通路與Hippo、Wnt信號通路相互交叉共同影響纖維化一致［17-18］；而在TGF-β1誘導的晚期主要表現為ECM受體相互作用、局灶黏附和黏附分子連接等相關通路的改變，這可能是因為膠原等細胞外基質蛋白開始合成。

為了探索影響以上生物過程和信號通路的轉錄因子，本研究在TGF-β1 處理6 h 時291 個上調的差異表達基因中篩選到13 個編碼轉錄因子的基 因（Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7、Foxc2、Glis1），GO 分析顯 示Snai1、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7和Foxc2參與發育過程，Snai1、Junb、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7和Foxc2與細胞凋亡相關，Snai1、Lef1、Myc和Foxc2參與細胞遷移；KEGG 分 析 顯 示Lef1、Myc和Tcf7參 與Hippo 和Wnt 信號通路，Myc參與TGF-β 信號通路，Snai1、Lef1和Tcf7參與黏附分子連接。在細胞模型中驗證發現，TGF-β1 可以誘導其中9 個編碼轉錄因子基因（Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Myc、Tcf7）的表達，其余4 個基因（Ahr、Foxo1、Foxc2、Glis1）的表達水平在TGF-β1處理后無顯著變化。在動物模型中進一步驗證發現，Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Myc和Tcf7顯著上調，Vdr顯著下調，Lef1無顯著變化。在GSE104954數據集中驗證發現，IRF8在糖尿病腎病患者和IgA 腎病患者的腎小管間質中顯著高表達，MYC在糖尿病腎病中高表達，而其他7 個基因的表達產物與對照組相比無顯著差異。

文獻檢索顯示，Snai1［19-20］、Junb［21］和Lef1［22-23］在腎纖維化動物模型中顯著上調，且能夠誘導腎小管上皮細胞-間質細胞轉化并促進腎纖維化。但在腎間質成纖維細胞中，TGF-β1 是否能誘導Snai1、Junb 和Lef1 的表達及其功能尚不清楚。Zhang 等［24］通過生物信息學預測發現Bhlhe40 可能在SARS-CoV-2 誘導的急性腎損傷到慢性腎臟病的轉變中發揮重要作用。Martínez-Arias 等［25］發現Vdr 的水平與腎纖維化程度成負相關。Irf8是干擾素調節因子家族的轉錄因子，其特異性結合Ⅰ型Ifn和Ifn 誘導的MHC Ⅰ類基因的上游調節區［26-27］。GO 分析顯示，Irf8 參與多細胞生物過程的正向調節、對含氧復合物和細胞因子刺激的反應。KEGG信號通路分析顯示，Irf8與百日咳相關。關于Irf8 的研究多集中在免疫細胞，既可以作為免疫細胞的轉錄激活因子，也可以作為抑制因子［28-29］。Irf8是多發性硬化的易感基因，Ototake 等［30］發現多發性硬化癥患者單核細胞和巨噬細胞中Irf8 下調可能加重纖維化表型。而Yoshida 等［31］的研究顯示，Irf8 在抗原提呈細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞和小膠質細胞）中表達，Irf8敲除能夠抑制小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（一種用于研究多發性硬化癥的動物模型）；Irf8一方面通過增強抗原提呈細胞中αvβ8 整合素的表達，激活TGF-β信號，導致Th17細胞分化，另一方面通過刺激IL-12和IL-23的產生、抑制IL-27的產生，有利于Th1 細胞和Th17 細胞生長和維持的細胞因子環境，從而促進疾病的發生和發展。Fu等［32］發現Irf8在腎移植后發生間質纖維化和小管萎縮的腎組織中表達增加。Guo 等［33］在數據集GSE30122 和GSE30529 中分析了糖尿病腎病患者的差異表達基因，結果顯示Irf8 在糖尿病腎病組顯著上調?？傊?，Irf8 可能是腎纖維化的潛在治療靶點，但其具體作用機制還須進一步研究。人MYC是一種原癌基因，其編碼蛋白與MYC 相關因子X 形成異源二聚體，該異源二聚體與DNA的啟動子結合，并調節特定靶基因的轉錄，許多人類腫瘤中會出現該基因的異常擴增［34］。因其在細胞周期進程、細胞凋亡和細胞轉化中的作用，近年來越來越多的研究發現該蛋白參與纖維化進程。據報道，Myc 在腎纖維化過程中顯著上調，并通過直接結合成纖維細胞的整合素αv的啟動子促進其表達，進而激活TGF-β1 信號通路，促進纖維化的發生［35］。本文資料進一步證實TGF-β 1也能反向誘導成纖維細胞中Myc的表達，TGF-β 1、Myc 和整合素αv 在腎臟成纖維細胞中可能以正反饋的環路發揮促纖維化的作用。

綜上所述，本研究對TGF-β1誘導的NRK-49F細胞腎纖維化模型的轉錄組測序結合細胞、動物、患者數據庫層面的驗證，提出Irf8和Myc可能是腎纖維化的潛在干預靶點。今后將進一步探索Irf8和Myc在腎纖維化進程中的具體作用和機制，以期為腎纖維化的臨床診治提供理論依據。

志謝 研究得到國家自然科學基金（32100911）、江蘇省高等學校自然科學研究項目（20KJB310002）、2019年江蘇省雙創博士項目、2020年揚州市“綠揚金鳳計劃”支持

Acknowledgements This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (32100911),Natural Science Research Project for Universities of Jiangsu Province (20KJB310002), 2019 Double-Innovation Doctor Program of Jiangsu Province, 2020 Lyuyang Jinfeng Project of Yangzhou City.

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)