香蕉miR164-NAC 調控模塊的鑒定與分析

朱 虹，曾 俊,2，孔祥錦,2，彭 寬,2，朱孝揚，溫玲蓉，屈紅霞，蔣躍明

（1.中國科學院華南植物園/華南國家植物園，廣東 廣州 510650；2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049；3.華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】香蕉（Musaacuminata,AAA group）是芭蕉科芭蕉屬植物，營養豐富，經濟價值高。在我國，香蕉多以鮮食為主，而鮮食對于果實品質的要求比加工更為苛刻。一方面，香蕉屬于呼吸躍變型果實，一旦啟動呼吸躍變，果實會迅速完成后熟，難以繼續貯藏和運輸。香蕉對乙烯十分敏感，因此抑制乙烯產生和延緩呼吸躍變的到來是控制香蕉后熟及貯藏保鮮的關鍵［1］。另一方面，作為熱帶水果的典型代表，香蕉對低溫十分敏感，田間生長低溫或采后貯運溫度過低都易發生冷害，嚴重影響產量和果實品質［2］。鑒于種質資源缺乏和果實成熟及冷害調控的復雜性，目前針對香蕉采后成熟和冷害的控制仍面臨較大挑戰。因此，深入研究其后熟和冷害發生規律及調控機制，對于維持和提升香蕉采后品質以及減輕冷害損失，具有重大的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】microRNA（簡稱miRNA）是真核生物中廣泛存在的一類對基因表達調控具有重要影響的非編碼小分子RNA，長度在20～24 個核苷酸。一般產生于基因的間隔區域，通過與靶基因互補配對的原則在轉錄后水平調控基因表達。成熟miRNA 序列在不同物種間表現出高度的進化保守性，而其表達則具有嚴格的時空特異性，并受到環境條件的影響［3］。其中，miR164 最先在擬南芥和水稻中被報道，此后通過同源比對、克隆及高通量測序等技術，先后在多個植物物種中鑒定出miR164 家族的成員。經miRBase 22.0 版數據庫檢索，miR164 家族目前共有70 個成員，來自39 個不同物種。雖然這些miR164 家族成員源自不同物種或同一物種不同的基因位點，且具有各異的前體序列，但它們的成熟序列卻高度同源，超過半數的成員在不同植物物種中的序列是完全相同的［4］。部分植物miR164 的功能已得到解析。例如，擬南芥中miR164 調控營養生長及花器官形成，且伴隨葉片衰老，miR164 的表達量會出現下降［5］。甜橙miR164 在球形胚發育過程中特異性表達，與球形胚的形成關系密切［6］。過表達miR164 的番茄出現花朵脫落延遲、果形奇特且不產種子的表型，證實miR164 參與調控花器官形成及果實發育［7］。此外，環境脅迫如低氮或鹽漬條件下，楊樹和棉花的特定miR164家族成員均表現出早期的上調表達，通過靶基因調節根系生長以適應逆境脅迫［8-9］。盡管生信預測miR164 可能作用于多種類型的靶基因，但基于現有的研究報道，miR164 最主要的作用靶標為NAC 家族轉錄因子。換言之，絕大多數植物都是通過miR164-NAC 這一保守的調控模塊來行使功能。例如，擬南芥miR164 家族中的3 個成員，分別靶向5 個與分生組織形成和器官邊界建成相關的NAC 家族轉錄因子。其中CUC1和CUC2基因在擬南芥球形胚的葉原基之間表達，miR164 通過負調控CUC1/2影響分生組織的發育和器官原基的邊界建立。NAC基因在胚發生和花發育過程中有重要作用，其功能缺失會導致花芽發育異常［10］。Guo 等［11］證 實miR164-NAC 調控模塊和生長素信號通路存在密切的互作關系，miR164 功能缺失突變體中NACmRNA 積累，生長素信號通路受阻，最終導致側根增加。相反，miR164 過表達會引發側根數目減少。近期研究揭示了miR164-GhCUC2 模塊通過調控脫落酸合成影響棉花的株型［12］，而番茄SlMIR164A可以通過控制SlNAM2和SlNAM3的表達調節果實的成熟及營養品質［13］。NAC 家族是植物特異性轉錄因子超家族，廣泛存在于植物界，其結構域最初的特征在于來自NAM、ATAF1/2 和CUC2 的共有序列［14］。大多數NACs 蛋白具有保守的DNA 結合域，N 端包含約150 個氨基酸，參與行使NAC蛋白的多種獨特功能，而C 端具有高度可變的轉錄調節區域，富含絲氨酸、蘇氨酸等殘基，且該區域在不同亞群中存在差異，可能賦予不同亞群NACs 蛋白間的功能變異。某些NAC 轉錄因子還在C 末端含有負責錨定到質膜或內質網的跨膜基序，在需要表達時被蛋白水解切割后轉移至細胞核。通過對數百個不同物種NACs基因的進化關系分析表明NAC 超家族內部存在多個亞群，這些NAC 家族成員在植物生長發育、果實成熟衰老以及生物和非生物脅迫響應等多個生物過程中發揮著關鍵作用［15］。另一方面，對NACs 蛋白的結構解析也取得一些進展，如通過X 光衍射分別獲得ANAC019 和OsNAC1 保守域的晶體結構，并推斷大多數NACs 蛋白可能以同源二聚體的形式發揮調控作用［16-17］?！颈狙芯壳腥朦c】解析果實成熟與抗逆調控機制一直是采后生物學的重要科學問題，目前相關研究還有待深入和拓展，特別是針對microRNA-靶基因模塊介導香蕉采后品質形成和冷害發生的調控機制尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究以香蕉為試驗對象，對其采后成熟及低溫脅迫下不同階段的香蕉果實進行小RNA 測序，篩選分析與香蕉后熟及冷害密切相關的miR164 和NAC 轉錄因子，明確香蕉中的miR164-NAC 調控模塊，并對該模塊在香蕉后熟和冷害過程中的表達模式進行分析，以期為深入探究香蕉miR164-NAC 調控模塊的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

鑒于‘巴西蕉’高產優質，一直是我國香蕉的主栽品種，本試驗選取其作為研究對象。果實于2019 年8 月采自廣東省廣州市南沙區萬頃沙蕉園，采收時果實飽滿度為7～8 成，采收后立即運回實驗室。落梳后分為單個蕉指，清水清洗后再用0.1%施?？私? min 后自然晾干。挑選大小均勻、無病蟲害及機械傷的單果分成4 個處理：（1）對照組：自然后熟，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（2）實驗組1：100 μL/L C2H4密閉處理18 h 后，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（3）實驗組2：0.5 μL/L 1-MCP 密閉處理18 h 后，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（4）實驗組3：置于6 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏。每個處理150個果實，設置3 次生物學重復。分別在貯藏第0、2、4、6、8 d 取對照組與處理組的香蕉樣品，分離果皮和果肉，凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉miR164 家族成員的鑒定及進化分析 首先基于前期的sRNA 高通量測序分析［18］，獲得香蕉中6 條MIR164基因家族成員的前體基因組定位、長度、自由能、miRNA 成熟序列及miR* star 序列等信息。根據前體序列信息，利用在線RNAfold 網絡服務器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）分析香蕉MIR164基因家族前體序列的二級莖環結構。隨后從miRBase 數據庫（www.mirbase.org）下載所有植物物種MIR164基因家族成員的前體序列和成熟序列，按科屬分類統計，利用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）網絡服務器對香蕉和其他代表性物種（選取禾本科、薔薇科及十字花科代表）MIR164s基因的前體序列和成熟序列進行多重序列比對，分析進化特征，并在此基礎上用iTOL 在線軟件基于參數臨近法對前體序列構建系統進化樹。

1.2.2 香蕉NAC基因家族成員的miR164 靶位點預測及驗證 從前期香蕉sRNA 測序結果中獲取全部的成熟miR164 序列，使用Target prediction for plant microRNAs（TAPIR，http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/tapir/）對香蕉NAC基因家族的蛋白編碼序列進行miR164 靶位點預測，Score 值設為5.0，自由能比值設為0.6。預測結果使用TBtools 中的Gene structure view 功能進行可視化［19］。另一方面，基于香蕉降解組測序分析［18］，鑒定高置信度的miR164 的靶基因，以明確香蕉中特定的miR164-NAC 調控模塊。利用煙草瞬時表達體系進一步驗證miR164 與靶基因的互作需要兩類載體［20］：一類為miRNA 超表達載體pBI121。設計引物用PCR 方法獲得MIR164基因的前體，替代pBI121 載體中的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因完成miR164 超表達載體的構建。另一類為改造過的綠色熒光蛋白GFP 超表達載體pMS4，其中GFP基因前有兩個酶切位點XhoI 和XbaI，雙酶切后用于插入miR164 在靶基因上的結合位點片段，該片段由兩段寡核苷酸DNA 退火后合成。miR164 和靶位點如果能在煙草葉片上互作，則GFP 表達被抑制，熒光信號減弱。

1.2.3 香蕉NAC基因家族成員的鑒定分析 從第4 版香蕉基因組數據庫（Version 4.3）下載全基因組文件，包括全部氨基酸序列和gff3 注釋文件。分別在擬南芥基因組數據庫（TAIR，http://www.arabidopsis.org/）和植物轉錄因子數據庫PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下載擬南芥和水稻的NAC 同源氨基酸序列，經手動去重后，共得到100 個擬南芥和141 個水稻的NACs 蛋白，建立參考序列庫。采用TBtools 軟件［19］的BLAST工具來檢索香蕉基因組中的潛在NACs基因，其中E-value cutoff 設置為e-10，其他參數默認。從PFAM 蛋白數據庫（http://pfam.xfam.org/）下載氨基酸序列NAM 保守結構域（PF02365）的HMM文件，在E-value cutoff 為0.01、其他參數默認的設置下，使用TBtools 軟件的Simple Hmm Search來搜索香蕉基因組中的NACs基因。將BLAST 和Hmm Search 結果合并，手動去重，將所有篩選出的候選NACs基因氨基酸序列使用Pfam 和NCBI的CDD 數據庫驗證蛋白序列保守結構域。含有NAM 結構域的序列被確定為香蕉NAC基因家族成員，并根據其所在染色體位置的先后順序對它們進行重命名。通過TBtools 中的Gene location visualize from GTF/GFF 工具，使用香蕉基因組的GFF3 注釋文件來創建香蕉NACs基因的染色體定位圖。使用MCScanX 對香蕉基因組內的同源復制事件進行分析，并通過TBtools 中的Advanced Circos 對香蕉NACs基因進行共線性分析。借助NCBI CDD 數據庫確定香蕉NACs 蛋白保守結構域NAM 域所在的具體位置，并使用TBtools 中的Gene structure view 功能對香蕉NACs基因結構進行可視化［19］。同時，利用ExPASy（www.expasy.org）網站中的ProtParam 工具對香蕉NACs 蛋白的理化性質進行分析。

1.2.4 香蕉NACs 系統進化樹的構建 使用ClustalX 2.0 對擬南芥、水稻和香蕉NACs 進行氨基酸多序列比對，利用TBtools 中的trimAL Wrapper 對多序列比對后的結果文件進行修剪，通過IQ-Tree 構建系統進化樹，參數默認，最后使用iTOL 在線網站進行美化。

1.2.5 香蕉RNA 提取及小分子RNA 的Northern雜交 香蕉總RNA 的提取在熱硼法基礎上略有改動，具體參考曾?。?1］方法。小分子RNA Northern 雜交實驗參考文獻［20］并略作改動。配制15% PAGE 工作液，充分溶解后迅速加入10% APS 和凝固劑TEMED，隨即灌膠插梳。等膠凝固后拔出梳子，電泳槽中加入適量1×TBE電泳液，120 V 預電泳30 min。RNA 樣品制備：取總RNA 20 μL（濃度為1 μg/μL），加入20 μL 2×上樣緩沖液，98 ℃變性2 min，快速置于冰上備用。預電泳結束后用注射器沖洗點樣孔數次，點入RNA 樣品。60 V 電壓電泳30 min，接著調整為120 V 電泳90 min，直至下層溴酚藍指示劑遷移至距離膠底部約1 cm 左右停止電泳。然后使用Mini 垂直電轉槽（Bio Rad），設置60 V 電壓，轉膜90 min。隨后紫外交聯固定樣品，60 ℃烘膜2 h 后裝袋，4 ℃保存。使用Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit（Thermo Scientific）進行雜交及信號檢測，3’端生物素標記的雜交檢測探針與miR164 成熟序列反向互補，選擇香蕉U6 片段作為內參，探針由上海生工生物合成，序列見表1。配制雜交工作液，將膜正面朝內，貼放于玻璃雜交管中，加入雜交工作液在37 ℃預雜交30 min，隨后在預雜交液中加入5 μL 生物素標記的miR164 探針（濃度為5 μmol/L），同樣37 ℃雜交16～20 h。第2 d 在37 ℃雜交爐內，滾動洗膜。棄去雜交管中的嚴謹洗膜液，加入5 mL 顯色試劑盒（Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module）中提供的封阻液，雜交爐溫調至25 ℃，滾動封阻15 min。再取20 μL 鏈親和素-辣根過氧化物酶（HRP，Streptavidin-Horseradish peroxidase conjugate），加入1 mL 封阻液中，再將混合液加入上一步封阻液中，繼續室溫滾動15 min。棄封阻液，加入10 mL 1×檢測洗液洗膜。將膜從雜交管轉移至干凈洗盒中，加入底物平衡液50 mL，室溫勻速搖動5 min，混合250 μL 魯米諾溶液（Luminol/Enhancer solution）和250 μL H2O2溶液配制底物工作液。膜正面朝上平鋪于透明夾膜上，加入底物工作液使其均勻覆蓋整個膜，暗處室溫孵育5 min。使用ChemiDocTMTouch Imaging System 成像系統（Bio Rad）檢測雜交信號。根據信號強弱調整曝光模式及時長。

表1 RNA 探針和實時qPCR 引物序列Table 1 RNA hybridization probes and primers for real-time qPCR

1.2.6 香蕉NAC靶基因反轉錄及定量PCR 采用TaKaRa PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A）對質量過關的香蕉總RNA 進行反轉錄，參照試劑盒說明書操作。將所得cDNA 溶液濃度統一稀釋成50 ng/μL。靶基因定量PCR 采用TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒，依次加入10 μL TB Green Premix Ex Taq II（2×）、0.4 μL ROX Reference Dye II（50×）、0.4 μL Forward Primer（10 μmol/L）、0.4 μL Reverse Primer（10 μmol/L）、6.8 μL 超純水以及2 μL cDNA，總體系為20 μL。使用ABI 公司7500 Fast 熒光定量PCR 儀進行反應，程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環。反應結束后，設置熔解反應95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s。使用Beacon Designer 8.0 軟件設計靶基因定量PCR 的引物，交由上海生工生物合成。定量PCR 選擇香蕉RPS2作為內參基因，靶基因定量PCR 引物見表1。

2 結果與分析

2.1 香蕉miR164 家族成員的鑒定及進化分析

基于前期sRNA 測序結果，在香蕉中鑒定到6 個MIR164基因家族成員（相應成熟miR164 序列分別命名為mac-miR164 a～f），通過將這6 條前體序列比對到香蕉基因組V4.3，發現它們定位在第6、8 和11 號3 條染色體上，其中4 條位于4 個編碼基因的內部，另外2 條則位于基因間區（詳見數據附表 S1）。定位于第11 號染色體上的2 條MIR164基因前體與編碼基因的外顯子部分重合，而定位于第8 和第6 號染色體上的2條前體則完全處于編碼基因的內含子區域（圖1A）。經搜索和基于植物MIRNA基因位點鑒定標準進行篩選，從miRbase 數據庫中共獲得131條MIR164基因的前體序列，共產生70 條非冗余的成熟miR164 序列。依據現有數據庫，miR164家族分布于18 科39 個植物物種中，屬于保守度較高的一類MIRNA基因家族。其中，禾本科報道的MIR164最多、達30 條，成熟序列有18 條，分布于7 個物種中；其次是薔薇科的4 個物種，有18 條前體序列和8 條成熟序列；排在第3 位的是十字花科5 個物種，共報道16 條前體序列和10 條成熟miR164 序列。從分布上看，miR164廣泛分布在單雙子葉植物中，甚至也同樣存在于被子植物最原始的無油樟科植物互葉梅中。將香蕉中鑒定到的miR164 成熟序列與39 個已報道植物物種中的非冗余miR164 成熟序列進行比對，結果顯示miR164 成熟序列在5’端較為保守，尤其是前8 位，而3’端序列呈現多變性，特別是第17、20 和21 位的序列，在不同物種中差異較為明顯，其中香蕉miR164 也貢獻了部分多樣性（圖1B）。比對結果表明該家族的基因擴張在進化過程中存在明顯的重排和篩選，暗示其在不同物種中調控的復雜性，值得深入研究。接著分析測序鑒定到的香蕉6 條miR164 家族成員前體序列的二級結構。如圖1C 所示，這些前體序列的長度介于100～120 nt，具有MIRNA基因前體典型的發夾莖環結構和較低的自由能（-70～-45 kcal/mol）。圖中紅色和藍色標記的序列分別代表miRNA 成熟序列和miR* star 序列，其中有2 條前體未檢測到miR*star 序列的表達。通過對香蕉與禾本科、薔薇科及十字花科代表物種擬南芥的MIR164基因前體序列構建系統進化樹，發現該家族能在單、雙子葉植物間明顯區分開來。但香蕉的6 條MIR164基因前體并沒有全部聚在一起，而是分布在3 個亞群中，其中有5 條均與熱帶雙子葉植物番木瓜聚為一類，包括測序豐度較高的mac-miR164a/b 和mac-miR164c，僅有一條低豐度的mac-miR164f 與單子葉禾本科植物聚為一類（圖1D），這暗示香蕉MIR164基因家族的起源與雙子葉植物更為接近。

圖1 香蕉miR164 家族成員鑒定及進化分析Fig.1 Identification and evolutionary analysis of miR164 family members in banana

2.2 香蕉miR164 靶基因及miR164-NAC 調控模塊鑒定

首先利用psRNATarget在線軟件（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對香蕉miR164 家族成員所有可能的靶基因進行預測，發現大多數是編碼NAC 結構域的轉錄因子（詳見數據庫附表S2）。同時，結合香蕉NACs基因家族成員的鑒定，預測miR164 的結合位點。然而，在鑒定到的所有香蕉NACs基因中，僅有5%具有miR164 的靶位點，這暗示著miR164-NAC 調控模塊可能在香蕉物種進化過程中出現較晚，且miR164 靶點均位于接近NAM 保守結構域的3’UTR 區域（圖2A）。另一方面，前期的香蕉降解組測序共鑒定到4 條受miR164 切割的NACs靶基因（均屬于0類高置信靶基因，詳見數據庫附表S3）。降解組t-plot 證實，miR164 對這幾個NACs靶基因都有較高的剪切效率，且切割位點較為一致（圖2B～圖2D）。煙草葉片的瞬轉實驗則進一步驗證了miR164c 對香蕉NAC176的抑制作用（圖2E）。而香蕉中這幾個miR164 的NACs靶基因均位于第9 號染色體上。

圖2 香蕉miR164 靶基因及miR164-NAC 調控模塊鑒定Fig.2 Identification of miR164 target genes and miR164-NAC regulatory module in banana

2.3 香蕉NAC 基因家族成員的鑒定分析

通過同源序列比對結合手動驗證蛋白保守結構域，從第4 版香蕉基因組中共鑒定到222 個NACs成員，比基于第2 版基因組鑒定的結果多出41 個［22］，按照所在染色體位置分別命名為MaNAC001～MaNAC222（詳見數據庫附表S4）。如圖3 所示，這222 個香蕉NACs不均勻地分布在所有11 條染色體上。其中，6 號染色體編碼最多、達32 個NACs基因，其次是10 號染色體、含28個NACs基因，8 號染色體僅編碼12 個NACs基因。這些數量龐大的NACs基因可能源自芭蕉屬譜系中發生的3 輪全基因組復制（WGD）事件。此外，串聯重復和區段復制在香蕉NAC家族的顯著擴張中也可能起到重要作用［23-24］。

圖3 香蕉NAC 基因家族成員的染色體定位Fig.3 Chromosomal locations of in NAC gene family members in banana

使用默認參數，通過MCScanX 對每個香蕉NAC基因的重復事件進行分析，在222 個香蕉NACs中共鑒定出134 對同源基因，其中1、2 和4 號染色體上共存在4 對串聯重復基因，其余130對同源基因均為區段復制，表明香蕉NACs基因進化的主要動力來源于基因的區段復制事件（詳見數據庫附表S5）。如圖4 所示，香蕉NACs基因位于幾乎所有染色體的同線性區塊內。相應地，含有較多NACs基因的6 號和10 號染色體上區塊間存在較多共線性關系。然而，1 號染色體雖然也編碼數量較多的NACs基因，但卻基本聚集在染色體的末端位置，且僅存在1 對串聯重復和4對片段復制的同源基因，因而共線性關系也相對簡單（圖4）。

圖4 香蕉NAC 基因家族成員在染色體上的關聯Fig.4 Interchromosomal association of NAC gene family members in banana

2.4 香蕉NAC 基因家族成員的進化分析

為研究香蕉NAC基因家族的進化特征，對香蕉、擬南芥和水稻NACs 蛋白序列進行比較系統發育和亞群分布的分析。系統發育樹將NAC 家族蛋白劃分為23 個不同的亞群，比先前報道的分類［22］多出5 個亞群。如圖5 所示，沒有任何香蕉NACs基因分布在S5、S13 和S20 亞群中，而另一些香蕉NACs基因則形成獨立的亞群，如S1、S2、S3、S8、S21 和S23。此外，絕大部分混合亞群同時含有來自單子葉植物和雙子葉植物的NACs基因，表明這一超家族在單、雙子葉物種中并非完全獨立進化?？傮w而言，香蕉NACs基因在大多數進化分支中占據主導地位，尤其是S14 亞群（圖5）。香蕉NACs基因在S14 亞群中的數量最多達61 個，其次是S15 和S12 亞群，分別包含36 個和20 個NACs基因。在香蕉NACs基因形成的6 個獨立亞群中，數目較多的是S1 和S2 亞群，分別含有24 個和14 個NACs基因，表明這些香蕉NACs很可能是在水稻中丟失后又在香蕉中分化獲得的，暗示其可能具有特定功能。但轉錄組數據顯示，僅有不到30%的NACs基因在香蕉后熟過程中或低溫脅迫下有表達（詳見數據庫附表S6），表明香蕉NACs基因高度冗余，或某些NACs基因可能只在特定條件下才表達及發揮功能。

圖5 香蕉與擬南芥、水稻NAC 轉錄因子的系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of NAC transcription factors from banana,Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.5 香蕉NACs 基因的結構與功能分析

基于蛋白比對構建系統發育樹，在此背景下對有表達的66 個香蕉NACs基因結構進行注釋，明確其外顯子-內含子組成，并通過TBtools 進行可視化。結果（圖6）表明，除MaNAC079僅含一個外顯子、無內含子外，大部分香蕉NACs基因均含有3 個外顯子和2 個內含子、占比65%。其中MaNAC062含有最多的外顯子（44 個）和內含子（43 個），這是由于第4 版香蕉基因組中的MaNAC062基因整合先前第2 版基因組中的2個基因（5’端為舊版基因）的緣故。這些香蕉NACs基因中NAM 結構域的長度，除MaNAC079（141 bp）外均介于315～411 bp。多數情況下，同一亞群內的NACs基因有較為相似且保守的結構，但同時也存在單個內含子丟失或獲得的情況，但S7、S10、S12、S16 和S22 組內成員的基因結構相差較大。此外，同源基因對的外顯子/內含子結構分析也進一步驗證了系統發育樹和重復事件的分析結果。另一方面，理化分析結果表明，所有香蕉NACs 編碼蛋白的平均長度為353 個氨基酸，平均分子量為39.5 kDa，等電點范圍為4.44～10.33。除MaNAC079 外，所有香蕉NACs 蛋白均為親水性，且僅有不足15%的NACs 屬于穩定蛋白（詳見數據庫附表S4）。

圖6 香蕉NAC 家族蛋白聚類及基因結構Fig.6 Protein clustering and gene structure of NAC family members in banana

圖5 中用藍色三角形標記了已報道的16 個香蕉NACs基因（詳見數據庫附表S7），有5 個分布在含香蕉NACs基因數目最多的S14 亞群，其中3 個（MaNAC177、MaNAC176、MaNAC207）被報道在乙烯誘導的香蕉后熟過程中發揮作用［25］，而另外2 個（MaNAC210、MaNAC217）則與次生細胞壁的形成密切相關［26］。然而，同樣受乙烯上調的MaNAC121、MaNAC132和MaNAC126則分別位于S16、S21 和S21 亞群中。這些結果表明香蕉NACs基因在果實后熟過程中所起的作用可能是多元化的。此外，香蕉NACs還能對各類脅迫作出響應，通過多種渠道發揮抗逆作用。例如，MaNAC129 通過調節氣孔關閉及H2O2含量來增強香蕉的耐旱性［27］，MaNAC085和MaNAC141 均正向參與了香蕉對高鹽和干旱脅迫的響應［28］，MaNAC176 可通過與WRKY 家族蛋白互作，增強香蕉抵抗炭疽菌過程中病程相關基因的表達［29］。

2.6 miR164-NAC 模塊在香蕉后熟和冷害過程中的表達分析

結合sRNA 測序數據，首先對香蕉miR164家族6 個成員的表達進行Northern 雜交檢測，分別選取后熟和冷害進程中不同時期的香蕉樣品進行檢測（圖7A）。其中，mac-miR164 d～f 未檢測到雜交信號，表明豐度極低，而另外3 個豐度較高的成員均在香蕉后熟過程中上調表達，miR164a（圖7B）。此外，雜交結果顯示伴隨后熟進程，miR164a 的表達在乙烯處理的香蕉果皮和果肉中均持續增強。1-MCP 處理后，香蕉miR164a 在果皮中的表達未受明顯影響，但在果肉中出現先降低后上升現象（圖7B）。隨后檢測受miR164 靶向調控的2 個表達量較高的MaNAC165和MaNAC176的轉錄本在后熟過程中的豐度變化，圖7C 顯示，MaNAC176在果皮和果肉中均響應乙烯處理且隨后熟進程逐漸下調表達，這與乙烯處理后果皮和果肉中miR164a 的表達模式正好相反。1-MCP 處理下MaNAC176的表達無明顯變化，僅第8 天在果皮中的表達顯著升高。相比MaNAC176而言，MaNAC165在果皮和果肉中的轉錄本豐度更高，在乙烯處理后的果皮中其表達呈現先升高后快速下降的趨勢，而在果肉中則持續下調（圖7C）?？傮w而言，1-MCP處理對MaNAC176和MaNAC165的表達影響不明顯，特別是果肉樣品。另一方面，在冷害的果皮樣品中，香蕉miR164a 的表達則被顯著誘導，相應地，MaNAC165和MaNAC176兩個靶基因的表達均出現明顯下調（圖7B、圖7C）。

圖7 香蕉后熟和冷害過程中miR164-NAC 模塊的表達變化Fig.7 Expression changes of miR164-NAC module during banana ripening and chilling injury

3 討論

香蕉基因組共編碼222 個NACs成員，數量相當龐大。然而，轉錄組數據顯示僅有不足30%的NACs基因產生表達，特別是聚集于第1、4和10 號染色體上的多個NACs基因均無表達，表明香蕉中該家族大多數成員存在功能冗余或時空表達特異性。另一方面，只有5%的NACs基因具有miR164 的靶切位點，這一比例在有表達的NACs基因中上升為20%。但相比香蕉中其他保守miRNA-靶基因模塊（如miR156-SPL、miR482-NBS-LRR）而言，香蕉miR164-NAC 模塊中的NAC靶標的范圍仍較為局限，暗示該調控模塊可能在香蕉的物種演化過程中出現較晚。

作為植物中一個高度保守的miRNA 家族，miR164 保守的靶基因NAC也是植物特有的一類轉錄因子，且miR164-NAC 模塊已被證實在調控植物生長發育和抗逆過程中發揮重要作用。研究發現，草莓des突變體相比野生型，其miR164a的成熟體在第19 位核苷酸上存在堿基突變，miR164a 通過靶向植物組織器官發育相關基因FvCUC2，影響草莓葉片和花器官的形態建成［30］。另有研究發現乙烯處理后，獼猴桃miR164 的表達受到顯著抑制，且與靶基因AdNAC6、AdNAC7的表達呈明顯負相關。AdNAC6、AdNAC7 能夠結合獼猴桃乙烯生物合成、細胞壁降解和香氣合成基因的啟動子，進而調控獼猴桃品質形成及后熟進程［31］。在香蕉中，MaNAC089 蛋白（又名MusaATAF2-like）可通過調節葉綠素降解和H2O2積累誘導香蕉葉片衰老［32］，進一步研究發現，該蛋白還可以通過誘導細胞分裂素超敏和類黃酮積累，調節香蕉植株幼苗的生長［33］。

本研究基于sRNA 高通量測序，發現香蕉miR164 家族中共有6 個成員（miR164a/b/c/d/e/f），其中miR164a/b/c 的積累水平與其對應NAC靶基因的表達量呈明顯負相關關系。然而，與同為呼吸躍變型果實的獼猴桃不同，香蕉中miR164 的表達受到乙烯強烈誘導，且隨后熟進程呈上調趨勢，而其靶向的MaNAC176的表達則隨香蕉后熟進程逐漸減弱。miR164 另一個靶基因MaNAC165在乙烯催熟的果皮中出現先上升后下降的趨勢，基本上與miR164 的表達模式相反。NAC 類轉錄因子在香蕉果實后熟調控中的作用已有不少相關報道。早期研究發現，MaNAC128、MaNAC129的表達在自然后熟、乙烯催熟和1-MCP 延緩后熟的香蕉果實中，隨著乙烯釋放和后熟進程而不斷增強［34］。作為轉錄激活子，MaNAC128和MaNAC129 均能夠結合乙烯合成關鍵基因MaACS1和MaACO1的啟動子，激活乙烯的生物合成，加速香蕉后熟與品質形成［35］。與此相反，MaNAC197在香蕉后熟過程中明顯下調，而其作為轉錄抑制子，通過結合MaACS1和MaACO1的啟動子抑制其表達［34］。類似地，MaNAC085 和MaNAC198 也相繼被報道是香蕉成熟衰老過程中的負調控因子［36-37］?？傮w來看，上述結果暗示著MaNAC176 和MaNAC165 很可能是香蕉后熟的負調控因子，而miR164 則通過負調控這兩個靶基因的表達，參與促進香蕉后熟進程中的乙烯合成。另一方面，本研究結果表明，香蕉miR164能夠被低溫誘導，同樣可能通過負調控其靶基因MaNAC176和MaNAC165來應對冷害。前期報道多個香蕉NAC 家族成員參與調控逆境脅迫響應，如MaNAC121 通過與CBF1 蛋白互作參與果實采后的低溫脅迫應答［38］，MaNAC129 通過調節氣孔開合度和H2O2含量增強香蕉抗旱性［27］，MaNAC085 和MaNAC141 均能提高香蕉對高鹽和干旱的耐受性［28］。近期報道指出，MaNAC127和MaNAC164 可通過上調磷脂降解相關基因，促進磷脂降解積累磷脂酸，從而引發香蕉的冷害癥狀［39］。本研究發現的香蕉miR164-NAC165/176 模塊很可能是香蕉發生冷害的又一個關鍵調控通路，具體的分子機制還需通過轉基因手段進一步證實。

4 結論

本研究基于高通量測序及第4 版香蕉基因組信息，鑒定出6 個香蕉miR164 家族成員，詳細描述其染色體定位、序列同源性、前體二級結構及其與代表性物種間的系統進化關系。明確了香蕉miR164 在不同NACs基因上的切割位點，并通過降解組和煙草瞬時共轉化驗證香蕉中多條miR164-NAC 調控模塊。利用更新版香蕉基因組注釋，鑒定出222 個香蕉NACs成員，明確其在基因組上的定位、重復事件、與擬南芥和水稻的系統發育關系，并結合轉錄組數據呈現部分香蕉NAC 家族成員的基因結構。分別設置香蕉后熟和低溫實驗，通過小分子RNA 雜交和qRT-PCR，分析鑒定到的香蕉miR164-NAC 調控模塊在后熟和冷害兩種過程中的表達情況。綜上，本研究系統篩選了與香蕉后熟及響應低溫脅迫密切相關的miR164 及其靶基因NAC 轉錄因子，可為后續香蕉miR164-NAC 模塊的克隆及功能驗證奠定基礎。