野生香菇菌株鑒定及其與栽培菌株的生物學特性比較

李宏月，歐小云，劉 斌

（1.廣西大學農學院/廣西大學食用菌研究所，廣西 南寧 530004；2.廣東茂名農林科技職業學院生物技術系，廣東 茂名 525000）

【研究意義】香菇（Lentinulaedodes）又名香蕈、冬菇，在分類歸屬方面一直存在許多探討和爭論，曾先后被歸入過12 個不同的屬，1983年從韌傘屬Lentinus轉入香菇屬Lentinula，即擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）光茸菌科（Omphalotaceae）香菇屬（Lentinula），延續至今。中國是香菇第一大生產國，也是最大的消費國。據中國食用菌協會統計，2020 年我國香菇的總產量為1 188.21 萬t，占食用菌總產量的29.25%，為我國食用菌年產量最大、創匯額較高的單品［1］。香菇野生種質資源主要分布在澳大利亞、日本、韓國、馬來西亞、朝鮮、越南、泰國等國家，其中屬日本記載最多［2］。我國香菇屬的種類及分布較廣，主要分布于熱帶及亞熱帶地區，溫帶地區較少［3］；野生香菇的多樣性中心分布于西北和西南地區［2］。開展野生香菇種質資源的收集、鑒定和評價利用，挖掘優良野生香菇種質可促進香菇產業的發展［4］。分析對比野生香菇和栽培香菇的生物學特性，可為香菇優良品種的選育提供理論基礎?！厩叭搜芯窟M展】我國香菇種質資源豐富，但香菇栽培品種的命名比較混亂，出現不少同名異物、同物異名等現象，因此香菇菌株的準確鑒定和命名極有必要。以往的香菇鑒定主要依賴形態學方法，但單純的形態鑒定無法提供準確的物種信息［5］。目前認為形態學在食用菌鑒定中可作為輔助手段，但不能作為唯一的鑒定方法［6］。近年來基于分子標記的分子生物學鑒定方法應用越來越廣泛［4,7］，由于此方法不易受外界環境的影響，具有特異性強、穩定性好、樣品需求量少等特點，可直接利用菌絲體或子實體提取DNA 進行鑒定［8-10］。Song 等［11］研究表明，采用核糖體基因轉錄間隔區（Internal transcribed spacers，ITS）序列分析是鑒定香菇的理想分子標記。袁思明等［12］對采自云南的1 株野生香菇進行了鑒定和菌絲生長條件試驗，其最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉膏。熊雪等［13］對分離自貴州馬桑樹的野生香菇進行生物學研究，該菌菌絲生長的最優碳源為蔗糖，最優氮源為蛋白胨，培養溫度以23～25 ℃最優，最適pH 為7～10；方志榮等［14］研究了不同碳源、氮源、溫度以及pH 對分離自四川的2株野生香菇菌株菌絲生長的影響，其最佳碳、氮源分別為玉米粉和酵母膏，最適培養溫度為25 ℃，最適pH 為6.0；劉元濤等［15］通過單因素試驗和正交試驗的方法，研究中華小香菇生長發育過程中所需碳源、氮源等營養條件和溫度、pH 等環境條件，從而得出其菌絲體生長的最佳條件?！颈狙芯壳腥朦c】我國香菇種質資源豐富，但功能性栽培品種較少，目前缺少適宜在南方高溫地區栽培的優良香菇品種。利用形態學和分子生物學鑒定方法，對香菇野生種質進行鑒定?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在對采集自廣西的2 株野生香菇菌株進行分離、鑒定，通過與香菇主要栽培菌株的生物學特性進行比較研究，探討分析影響香菇菌絲生長的因素，在此基礎上，根據不同菌株的綜合表現，以期篩選出適宜當地高溫氣候條件的香菇種質資源和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試野生菌株林香18（LX18）、林香19（LX19），栽培菌株L12、L26 和L808，均由廣西大學食用菌研究所提供，其中LX18、LX19 由采集于廣西上林縣大明山的野生子實體分離獲得。申香34（SX34）、申香60（SX60）和浦香08（PX08）由上海市農業科學院食用菌研究所陳明杰研究員惠贈。

PDA 培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。

基本培養基：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%、水1 L、pH 自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態鑒定 香菇子實體由菌蓋、菌柄和菌褶組成。通過觀察子實體的外觀特征，如子實體大小、菌蓋表面平整度、菌蓋厚薄、菌柄長度、菌蓋顏色、菌褶、菌環等進行鑒定。

1.2.2 分子鑒定 采用CTAB 法提取DNA，隨后用兩對引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），LR0R（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'）和LR5（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'），進行PCR擴增，反應體系：總體系為25 μL，分別為GO Taq green master mix (2×) 13 μL；ITS1 和ITS4 或LR0R和LR5 (10 pmol/L) 各1 μL；DNA 模 板1 μl；Nucleasr-free water 9 μL。反應條件：預變性94 ℃5 min；變性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35 個循環；補平72 ℃ 10 min，10 ℃ 30 min。擴增完成后4 ℃保存并進行電泳檢測，PCR 產物送生物公司進行測序。所得序列于GenBank 數據庫進行BLAST 比對，下載相關序列并用Clustal X 軟件進行對比，并用MEGA 6.06 中的Maximum Likelihood 法構建系統發育樹。

1.2.3 香菇生物學特性對比分析（1）菌種活化。取保藏菌種接入斜面PDA 培養基，于25 ℃下培養，待菌絲長好后再轉接到PDA 平板中心位置，25 ℃下培養，菌絲長滿皿后備用。

（2）菌絲觀察測定。長滿菌絲的PDA 平板，用直徑0.5 cm 的打孔器打孔取菌餅，接種到基礎培養基平板中央，每個菌株3 次重復，培養3 d后開始進行觀察和測定。每個菌株取3 個平板，以接種中心點為起點，測量菌落半徑，計算平均值。長勢以菌落圓整程度、菌絲濃密程度以及菌絲潔白程度來表示。

菌絲生長速度（mm/d)=［(平均菌落半徑-5 mm)/2］/生長天數

（3）溫度對菌絲生長的影響。用直徑0.5 cm的打孔器打取菌餅，接入無菌PDA 培養皿中央，每個菌株3 個重復，分別放入15、20、25、30 ℃培養箱中培養，記錄菌絲萌發、生長時間及滿皿天數。

（4）碳源對菌絲生長的影響。以基礎培養基作對照，將基礎培養基中的葡萄糖分別換成麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等，觀察不同碳源對菌絲生長速度及長勢的影響。

（5）氮源對菌絲生長的影響。以基礎培養基作對照，將基礎培養中的蛋白胨分別換成尿素、牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀等，觀察不同氮源對菌絲生長速度及長勢的影響。

（6）C/N 對菌絲生長的影響。將基礎培養基中葡萄糖用量固定為20 g，改變蛋白胨的用量，配制7 個培養基處理，使葡萄糖與蛋白胨比例依次為10/1、20/1、30/1、40/1、50/1、60/1、70/1。觀察不同C/N 對菌絲生長速度及長勢的影響。

1.2.4 數據處理 試驗數據分析采用SPSS 20.0 軟件，應用鄧肯氏新復極差法（Duncan）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 野生香菇菌株的形態鑒定

林香18 野生子實體見圖1 A。子實體稍小，菌蓋直徑為3.0～3.5 cm，最大可達4.0 cm，扁平球形至稍平展，表面淺褐色，光滑無鱗片，無毛狀物；厚度1.1～1.5 cm，菌肉白色，細密；菌褶白色，彎生，不等長；菌柄長4.5～4.8 cm，粗0.6～1.0 cm，中生，白色，直立；菌環以下無纖毛狀鱗片，纖維質，內實，菌環易消失，白色。

圖1 野生香菇子實體Fig.1 Fruiting bodies of wild Lentinula edodes

林香19 子實體見圖1 B。子實體中等，菌蓋直徑為3.5～4.0 cm，最大可達4.5 cm，扁平球形至稍平展，表面深褐色、棕褐色，光滑無鱗片，無毛狀物，厚度0.9～1.5 cm；菌肉白色，細密；菌褶白色，彎生，不等長；菌柄長4.8～5.3 cm，粗0.7～1.2 cm，中生至偏生，白色，常彎曲；菌環以下無纖毛狀鱗片，纖維質，內實，菌環易消失。從形態學上可將野生食用菌初步鑒定為香菇屬。

2.2 分子序列分析

香菇野生菌株經PCR 擴增、測序后獲得的ITS 和LSU 序列，通過BLAST 在GenBank 數據庫中進行相似性檢索和比對，下載其他香菇序列進行對比，用MEGA 6.0 構建系統發育樹（圖2）。由圖2 可知，野生菌株林香18、林香19 與MH868346LentinulaedodesCBS225.51 和AF356159LentinulalateritiaTMI 1633 聚集在一個分支上，且該分支的最大似然引導支持率高達100%，因此把這兩個菌株鑒定為香菇Lentinula edodes。

圖2 基于ITSLSU 和序列采用極大似然法構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree generated from maximum likelihood based on ITS and LSU sequences

2.3 香菇生物學特性對比分析

2.3.1 不同溫度對香菇菌絲生長的影響 由表1 可知，8 株供試菌株在溫度15～30 ℃下均能生長，但菌絲生長速度存在較大差異。15 ℃時，L12 和L26 的菌絲生長速度最快、表現出耐低溫的特性，而L808 和林香19 生長最慢、對低溫比較敏感；20 ℃時，菌絲生長速度居前3 位的分別為L26、林香18 和L12；25 ℃為6 株栽培菌株的最適生長溫度，其中L808 的菌絲生長速度最快、達4.91 mm/d；而30 ℃下，野生菌株林香18 的菌絲生長速度最快，其次為L808 和林香19。綜上，L808、林香18 和林香19 具有較強的耐高溫特性，其他5 個菌株均不耐高溫。

表1 不同溫度對香菇菌絲生長速率的影響Table 1 Effect of different temperature on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

2.3.2 不同碳源對香菇菌絲生長的影響 從表2可以看出，當碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖時，香菇L26、申香60 和申香34 的菌絲生長速度無顯著差異，但當碳源為乳糖時三者的菌絲生長速度較慢。香菇L12 在含葡萄糖培養基中菌絲生長速度最快、達4.17 mm/d，與其他碳源差異顯著，而在含麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉培養基中，乳糖的利用效果最差；香菇L808在含蔗糖的培養基上菌絲生長速度最快、為4.03 mm/d，其次是可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖，乳糖最慢、菌絲生長速度僅2.42 mm/d；林香18 在不同碳源培養基上菌絲生長速度差異顯著，以蔗糖利用效果最好、菌絲生長速度達3.43 mm/d，乳糖利用效果最差、菌絲生長速度僅2.19 mm/d；林香19 在所有碳源中，對可溶性淀粉的利用效果最好、菌絲生長速度最快、為3.75 mm/d，乳糖利用效果最差、菌絲生長速度最慢、僅3.18 mm/d；浦香08 在所有碳源中，以麥芽糖培養基上菌絲生長速度最快、約為乳糖的2 倍。

表2 不同碳源對香菇菌絲生長速率的影響Table 2 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

從表3 可以看出，不同碳源條件下，L26、L808、申香34、申香60、林香18 和林香19 的菌絲長勢無顯著差異，只有L12 和浦香08 的菌絲長勢存在差異。在碳源為葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉時，L12 菌落圓整、菌絲較濃密、潔白，且在乳糖培養基上菌絲最為濃密；在可溶性淀粉培養基上菌絲濃密但老化快，存活時間較短。浦香08 在乳糖和可溶性淀粉培養基上，菌絲極濃密，菌落圓整、潔白；在葡萄糖、蔗糖和麥芽糖培養基上菌絲較濃密，菌落圓整、淺白色。L26 在5種碳源培養基上菌絲長勢均表現極濃密，除了乳糖以外，其他4 種碳源菌絲長勢均為圓整、潔白。L808 菌絲生長速度快，菌絲老化速度也較快，菌絲長勢無顯著差異，均為稀疏、灰白色、菌落完整。申香34 菌絲長勢均為濃密、菌落圓整，在葡萄糖、乳糖培養基上菌絲呈灰白色，在可溶性糖和蔗糖上菌絲顏色更為潔白。申香60 菌絲長勢無顯著差異，菌絲長勢較濃密、菌落圓整、淺白色。相比其他菌株，林香18 在不同碳源培養基上的菌絲萌發及生長速度慢，但菌絲長勢濃密、潔白、菌落圓整。林香19 菌絲長勢均表現稀疏圓整、淺白色，在5 個碳源培養基上生長無顯著差異。

表3 不同碳源對香菇菌絲長勢的影響Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.3 不同氮源對香菇菌絲生長速度的影響 由表4 可知，L26 在不同氮源培養基上生長速率的表現依次為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏＞硝酸鉀＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏上菌絲生長速度最快、達3.75 mm/d；L12 在不同氮源培養基上生長速率的表現依次為蛋白胨、牛肉膏＞酵母膏＞硝酸鉀＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏上菌絲生長速度最快、達4.17 mm/d；L808、林香18、林香19 和浦香08 在不同氮源培養基上生長速率的表現依次為牛肉膏＞酵母膏＞蛋白胨＞硝酸鉀＞尿素，以上4 種菌株在牛肉膏培養基上利用效果相對最好，生長速度分別為4.17、3.34、3.74、4.14 mm/d；申香34 和申香60 在不同氮源培養基上生長速率的表現依次為牛肉膏、酵母膏＞蛋白胨＞硝酸鉀＞尿素，兩菌株對牛肉膏、酵母膏的利用效果較好，菌絲生長速度分別為3.75、3.8 mm/d。

表4 不同氮源對香菇菌絲生長速率的影響Table 4 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

總體來看，8 個菌株在尿素培養基上均無法生長，在牛肉膏培養基上生長速度最快，在硝酸鉀培養基上菌絲生長速度最慢，L12 菌株菌絲生長速度最快，林香18 生長速度明顯低于其他7 個菌株。

從表5 可以看出，8 個菌株在尿素培養基上均不能生長，在硝酸鉀培養基上長勢無明顯差異，均表現為菌落較圓整，菌絲稀疏、淺白色。L26、L12、L808、申香34 和林香18 等5 個菌株在其他3 種氮源培養基上表現一致，菌絲均極為濃密、潔白，菌落圓整；申香60 在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏培養基上菌絲長勢較濃密，無明顯差異；林香19 和浦香08 在5 種氮源培養基上表現一致，均在蛋白胨和牛肉膏上表現菌絲較濃密、潔白、菌落完整，在酵母膏上表現菌絲極濃密。綜上，在酵母膏培養基上除申香60 外其他7 個菌株長勢均為菌絲濃密、潔白、菌落圓整。

表5 不同氮源對香菇菌絲長勢的影響Table 5 Effect of different nitrogen source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.4 不同C/N 對菌絲生長速度的影響 不同C/N 條件下，香菇菌絲生長表現出明顯差異。由表6 可看出，香菇菌絲可以在7 個不同的C/N 培養基中生長，其生長情況各有不同。香菇L26 在C/N 為10/1、20/1、50/1、60/1、70/1 條件下菌絲生長速度相同，為3.75 mm/d；L12 在C/N 為30/1條件下，菌絲生長速度最快，為4.08 mm/d；L808在C/N 為50/1 時菌絲生長速度最快，為3.97 mm/d；申香34 在C/N 為30/1 時菌絲生長速度最快，為3.8 mm/d；申香60 在C/N 為10/1 和50/1 生長速度相對較快，為3.8 mm/d；林香18 在10/1 時菌絲生長最快，為3.7 mm/d，林香18 的總體生長速度低于其他7 個品種；林香19 在70/1-10/1 的C/N 條件下，菌絲生長范圍在3.48～3.8 mm/d，10/1 時菌絲生長速度最快，50/1 速度最慢；浦香08 在C/N為40/1 時菌絲生長速度最快，為4.15 mm/d。

表6 不同碳氮比對香菇菌絲生長速率的影響Table 6 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

由表7 可知，在不同C/N 的7 個處理中，申香34、林香18 與林香19 無顯著差異，申香34和林香18 菌絲極為濃密、潔白，菌落圓整，而林香19 菌絲較濃密、淺白色，菌落圓整；L808 在C/N 為30/1 時菌絲生長表現濃密潔白，菌落圓整，其他6 個處理菌絲生長表現稀疏，為淺白色，菌落圓整；L12 只在C/N 為70/1 時菌絲長勢表現稀疏、灰白色、菌落圓整，其他處理中菌絲生長表現差異不大，表現為濃密、淺白色，菌落圓整；L26 在C/N 為10/1 時菌絲長勢最好，菌絲潔白、極為濃密，菌落圓整，其他6 個處理菌絲較濃密、潔白、菌落圓整；浦香08 在C/N 為10/1 和30/1時菌絲極濃密、菌絲潔白、菌落圓整；申香60 在C/N 為20/1 和40/1 時菌絲稀疏、淺白色、菌落圓整，當C/N 為10/1、50/1、60/1、70/1 時菌絲均較濃密且潔白，菌落圓整，當C/N 為30/1 時菌絲極濃密、潔白、菌落圓整。綜合看來，申香34、林香18、林香19 菌絲長勢不受C/N 的影響，其他5 個菌株菌絲長勢受C/N 的影響。

表7 不同碳氮比對香菇菌絲長勢的影響Table 7 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth density of Lentinula edodes

3 討論

本研究對采自廣西大明山的2 份野生食用菌標本進行形態特征觀察和分子序列分析，發現從野生標本分離的菌株林香18 和林香19 與香菇Lentinulaedodes相似度最高，在ITS 構建的系統發育樹上聚集在一起，因此將其鑒定為香菇Lentinulaedodes。兩份材料的子實體外觀形態差異不大，區別為林香18 菌蓋顏色為淺褐色，而林香19 菌蓋顏色為深褐色。廣西野生香菇的研究報道較少，陳麗新［16］等曾對十萬大山的野生香菇進行組織分離，認為分離部位不同，菌絲的生長速度和長勢有差異。

野生菌的馴化栽培通常有賴于其菌種的生物學特性研究。本研究以香菇的2 株野生菌株和6 株栽培菌株為試材，測定不同溫度、氮源、氮源、C/N 對菌絲生長的影響，結果顯示，供試的8 株香菇菌絲在15～30 ℃條件下均可以生長，生長速度具有一定規律，多數菌株的菌絲生長速度在15～25 ℃呈上升趨勢，25～30 ℃菌絲生長速度緩慢，6 株栽培菌株生長的最適合溫度均為25 ℃，而2 株野生菌株在30℃時的菌絲生長速率最高。同時得出供試8 個菌株菌絲生長的最適營養條件，其中L26 最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨、牛肉膏或酵母膏，在7 種不同C/N 中無顯著差別；L12 最適碳源為葡萄糖，最適氮源是蛋白胨或牛肉膏，最佳C/N 是30/1；L808 最適碳源為蔗糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為50/1；申香34 最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為酵母膏或牛肉膏，最適C/N 為30/1；申香60 最適碳源是可溶性淀粉、麥芽糖或蔗糖，最適氮源為酵母膏或牛肉膏，最適C/N 為10/1、50/1；林香18 最適碳源是蔗糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為10/1；林香19 最適碳源是可溶性淀粉，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為10/1；浦香08 最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為40/1。本研究結果與已往的文獻報道相似，如袁思明等［12］對野生香菇菌絲最佳生長條件進行研究，菌絲在牛肉膏上生長最好。熊雪等［13］指出，野生馬桑香菇菌絲的最優碳源為蔗糖，最優氮源為蛋白胨，培養溫度以23～25 ℃最優。方志榮等［14］認為，香菇屬的最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為酵母膏，最適培養溫度為25 ℃；伍燕等［17］研究發現，香菇菌絲在葡萄糖培養基上生長更好，而在尿素上不能生長。推測多數食用菌菌絲均無法直接利用尿素，可能是因為尿素在高壓滅菌時發生了縮合反應，生成的縮二脲、縮三脲等無法被菌絲吸收利用，導致菌絲無法生長。曾茜等［18］發現，野生香菇黔香篩5 號母種培養基的最佳碳氮源為葡萄糖和硫酸銨，最適培養溫度 25～30 ℃。廖真等［19］研究表明，野生香菇菌絲生長的最適碳源為果糖，最適氮源為牛肉膏，最適生長溫度25 ℃，而在尿素培養基上菌絲無法生長。本研究結果野生香菇林香18 和林香19 菌絲生長的最適氮源是牛肉膏，這與袁思明等［12］、廖真等［19］的研究結果一致。由此推測在蛋白胨和牛肉膏為氮源的處理下，菌絲長勢較好，可能是因為這種復合氮源中營養較為豐富，能夠滿足菌絲生長的營養需求。溫度方面，本研究試材野生香菇林香18、林香19 與曾茜等［18］研究的“野生香菇黔香篩5 號”均為耐高溫野生香菇，與熊雪等［13］研究的野生馬桑香菇、方志榮等［14］研究的野生微香菇屬 (Lentinula)真菌存在差異。

本研究中，8 株香菇在7 種不同C/N 培養基上的菌絲生長速度沒有任何規律，但多數菌株在C/N 為10/1 時菌絲生長速度最快，而張權［20］研究發現5 種香菇（931-9，靈仙一號，南山一號，9608，L808）的最適C/N 為20/1，由此推測不同品種的香菇在碳源、氮源需求上差異較小，但在C/N 需求上存在較大差異，同一菌種不同菌株之間利用碳氮的能力也有所不同。

4 結論

本研究通過形態學和分子學相結合的方法，將來自廣西上林縣大明山的兩份野生食用菌鑒定為香菇。通過與6 個主要栽培菌株進行生物學特性的比較分析，結果表明，兩株野生菌株在30 ℃條件下的菌絲生長速度均高于25 ℃，表現出較強的耐高溫特性，說明野生菌株為耐高溫菌株，其他菌株為中溫性品種，生長最適合溫度在25 ℃。本試驗篩選出適宜當地高溫氣候條件的香菇種質資源為林香18 和林香19，為野生香菇種質資源的應用，特別是耐高溫香菇新品種的選育提供了新材料及重要參考依據。