基于SSR分子標記的‘粵秀3號’黃瓜雜交種子純度及真實性鑒定

金慶敏，林毓娥，王 瑞，鐘玉娟，吳廷全

（1.廣東省農業科學院設施農業研究所，廣東 廣州 510640 2.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】黃瓜（CucumissativusL.）為葫蘆科黃瓜屬植物，起源于喜馬拉雅山南麓的印度北部、錫金、尼泊爾和中國云南地區［1-2］，是世界上重要的蔬菜作物。中國為黃瓜最大的種植區，根據聯合國糧農組織最新統計結果（https://www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL/visualize），2021年全球黃瓜種植面積為217.22 萬 hm2，中國種植面積達129.25 萬 hm2，占比59%；全球黃瓜總產量為9 352.88 萬 t，中國黃瓜產量達7559.77 萬 t，占比81%。因此，黃瓜在我國具有重要的農業經濟價值［3］。世界范圍內主要作物的優良品種大多通過雜交育種的方法育成［4］。傳統的品種純度和真偽鑒定是以形態學標記為依據，這種鑒定方法從農業生產角度看具有穩定可靠的優點［5］，但從遺傳學角度看，品種的純度和真偽鑒定實質上是對品種基因型的鑒定，且只有通過鑒定DNA 分子本身才能準確可靠地鑒定品種的基因型［3,6-7］。有限的親本資源和雜交品種的不斷涌現，使得品種尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子的真實性與品種純度鑒定也越來越難［8］，加之黃瓜為自花授粉作物，人工去雄不及時，常會出現假雜種，導致種子遺傳純度降低，給生產造成巨大損失［9］。為保證優良品種能夠產生最大的經濟效益，開發快速、準確、有效的品種鑒定方法顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】DNA 分子標記技術是隨著分子生物學發展而興起的新型鑒定方法，具有簡便、快速、準確的特點［10］。目前常用的分子標記技術包括擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、相關序列擴增多態性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）、序列特征化擴增區域（Sequence characterized amplified region，SCAR）和簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）等［6,11］。SSR 分子標記具有共顯性、分布廣泛、多態性高等特征，且SSR 分子標記穩定性高、操作簡單、重復性好，且對DNA 質量要求低，可準確高效地鑒別大量等位基因［12-13］。鑒于以上優勢，SSR 分子標記已在水稻［14-18］、玉米［19-21］、小麥［22-23］、棉花［24-25］、茄子［26］、白菜［27-31］、冬瓜［8］、節瓜［32］、絲瓜［33］、苦瓜［34］等多種作物上得到應用。近年來，SSR 標記也被廣泛應用于黃瓜［1,3,35-38］，如在黃瓜純度鑒定［3,35］、重要基因定位［39-41］、種質資源多樣性分析［42-45］等方面應用較多。周勝軍等［12］在699 對SSR 引物中篩選出3 對引物在‘浙秀1 號’雜交種及其父母本之間表現出穩定的共顯性，其在‘浙秀1號’黃瓜雜交種的帶型均為父母本的互補帶，表明3 對引物可用于‘浙秀1 號’黃瓜雜交種的種子純度鑒定，且與田間鑒定結果一致。孟淑春等［1,38］利用66 對SSR 引物對‘京研綠翡翠’黃瓜品種進行分子標記篩選，得到10 對穩定的SSR 引物可用于該品種種子的純度鑒定；利用72對SSR 引物對‘京研冬美9 號’黃瓜品種進行分子標記篩選，得到2 對引物可用于該品種種子的純度鑒定，且上述篩選到的引物鑒定結果均與田間鑒定結果一致。李春等［36］從240 個黃瓜SSR分子標記篩選到2 對SSR 分子標記（Cs100 和Cs109），可對‘川綠15 號’華南型黃瓜品種進行種子純度鑒定，且2 對標記的分子鑒定結果與田間形態鑒定結果一致，并可將‘川綠15 號’與其他品種的黃瓜種子區分開。以上均為發掘利用SSR 分子標記、建立快速高效的黃瓜種子純度鑒定方法提供了重要的理論依據?！颈狙芯壳腥朦c】黃瓜種子純度和真實性鑒定一直是黃瓜商業化制種中亟待解決的科學問題。傳統的種子純度鑒定方法存在一定的局限性和不足之處，無法完全確保黃瓜種子的純度和真實性［38］。目前，市場上黃瓜品種居多，存在一品多名或一名多品的情況，且黃瓜遺傳背景狹窄，尤其是華北型黃瓜，遺傳相似性較高，用傳統方法鑒定存在一定難度，利用分子標記的方法可從根本上解決這個問題。同時，本單位所育成的‘粵秀3 號’黃瓜品種具有生長勢強、產量高、抗病抗逆性強的特點，是華南地區推廣面積較多的品種［46］。為實現‘粵秀3號’黃瓜在生產制種中增質提效，以進一步推廣該黃瓜品種，本研究擬采用SSR 分子標記技術，以‘粵秀3 號’及其父母本為試驗材料，建立一種準確、快速和可靠的方法，用于檢測和鑒定‘粵秀3 號’黃瓜雜交種子的純度和真實性?！緮M解決的關鍵問題】本研究圍繞如何選擇適合的SSR 分子標記，以最大程度地提高‘粵秀3 號’黃瓜雜交種子鑒定的準確性和穩定性；如何建立一套標準化的實驗流程，確保不同實驗室和操作人員之間的結果具有一致性；如何驗證該方法在不同批次和環境下的適用性和穩定性，以確保其在實際種子鑒定中的可行性等關鍵問題展開試驗。為降低‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定成本，提高種子純度鑒定時效性及穩定性，利用公開的SSR 標記引物資源，篩選用于‘粵秀3 號’純度和真實性鑒定的特異性引物，并建立一套高效準確的黃瓜品種種子純度鑒定方法，為SSR 標記在黃瓜品種鑒定和‘粵秀3 號’的市場化推廣提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用黃瓜品種為廣東省農業科學院蔬菜研究所育成的華北型黃瓜雜種一代‘粵秀3號’，其父本材料為C-8，母本材料為A-2。父本C-8植株生產強勢，葉色深綠，葉片較小，抗病性強，皮色深綠有光澤，為長春密刺系統變異植株中所選出的單株。母本A-2 是在100 多份資源材料鑒定的基礎上選出的，原始材料來源于亞洲蔬菜中心，主要表現為早熟、分支強、主側蔓結果［46］?！浶? 號’黃瓜早熟，主側蔓結瓜，連續結果性強，回頭瓜多，瓜型呈長棒狀，勻稱，外形美觀，皮色深綠有光澤，刺瘤密，白刺，單瓜重400～450 g，肉厚，味甜脆嫩，商品性好，耐貯運，較抗枯萎病、霜霉病、炭疽病、白粉病等多種病害，是華南地區推廣面積較多的品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 所有材料均于2022年7 月中旬浸種催芽播種于穴盤，在蔬菜研究所重點實驗室培養，待種子發芽后取兩片子葉用于DNA 提取。采用德國進口研磨儀RETSCH（萊馳）MM400 將樣品研磨后，參考姚春鵬等［34］DNA 提取方法提取黃瓜基因組DNA，用DL2000 核酸蛋白分析儀測定OD260、OD280的值，1%瓊脂糖電泳檢測DNA 質量。

1.2.2 SSR 分子標記引物的篩選 在黃瓜基因組數據庫網站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下載SSR 分子標記序列，選用200 對均勻分布在黃瓜染色體上的SSR 分子標記引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參考‘粵秀3 號’黃瓜及其父母本材料，將所提取基因組DNA 各取10 份混合，分別形成‘粵秀3 號’及其父母本材料的混合池，按照父母本帶型互補的原則用于篩選‘粵秀3 號’黃瓜的特異性SSR 分子標記。

1.2.3 PCR 擴增及丙烯酰胺電泳 PCR 擴增反應體系為20 μL：基因組DNA（100 ng/μL）：1.0 μL，Mg2+（20 mmol/L）：1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）：2.0 μL，SSR 上下游引物（10 mmol/μL）：0.4 μL，Taq 酶（5U/ μL）：0.2 μL，10×PCR buffer：2.0 μL，加ddH20 補足至20 μL。

PCR 擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35 個循環；72 ℃保持7 min，4℃保存待檢測。擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V，1.5 h）；電泳結束后，丙烯酰胺凝膠經0.1% AgNO3銀染15 min，然后用2% NaOH、0.4% 甲醛、0.04%Na2CO3顯色，清水沖洗干凈后在燈箱拍照分析。

1.2.4 DNA 片段的回收及測序 將父母本互補的兩條差異條帶在丙烯酰胺凝膠上用手術刀割下，然后用DNA 回收試劑盒（全式金EasyPure Quick Gel Extraction Kit）將DNA 片段回收，然后將所回收條帶連接至T 載體（全式金pEASY-T1 Cloning Kit），轉化DH5α（全式金Trans5α Chemically Competent Cell）大腸桿菌，挑取陽性單克隆菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 種子純度鑒定 隨機選取42 ?！浶? 號’黃瓜種子提取基因組DNA，用篩選出的SSR 分子標記對‘粵秀3 號’黃瓜種子及其父母本參照1.2.4方法進行PCR 擴增及丙烯酰胺電泳，染色并讀帶，判定‘粵秀3 號’黃瓜種子純度。

1.2.6 田間形態鑒定 選取‘粵秀3 號’黃瓜種子260 粒，于2022 年7 月中旬浸種催芽，播種于穴盤育苗。8 月上旬（長出1～3 片真葉）移栽238株‘粵秀3 號’黃瓜于廣東省農業科學院蔬菜研究所白云基地。采用深溝高畦，畦寬1.8～2.0 m，畦高30 cm，株距30 cm，進行常規化管理。在盛果期隨機選取100 株‘粵秀3 號’黃瓜植株，通過田間性狀（主要包括瓜型、瓜長、皮色、刺瘤、瓜重等）鑒定其種子純度。

1.2.7 SSR 分子標記特異性鑒定 選取市場上同種類型的黃瓜品種（‘中農108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農8 號’‘津研四號’）種子及其他49 份黃瓜種質材料提取DNA，用所篩選的SSR 引物對‘粵秀3 號’及其親本進行PCR 擴增實驗。并對擴增條帶進行檢測，檢驗所篩選的SSR 分子標記對‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定的特異性和有效性。

2 結果與分析

2.1 ‘粵秀3 號’黃瓜基因組DNA 提取結果分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，所提取的‘粵秀3 號’黃瓜基因組DNA 條帶清晰，無明顯拖帶和降解現象（圖1）。DNA 質量檢測結果顯示，其OD260/OD280比值在1.79～1.98 之間，且瓊脂糖膠的條帶單一，表明所提取的DNA 純度高、雜質少、質量好，滿足本試驗對基因組DNA 的質量要求。

圖1 ‘粵秀3 號’基因組DNA 檢測Fig.1 Genomic DNA testing of ‘Yuexiu No.3’

2.2 黃瓜SSR 分子標記的篩選

以‘粵秀3 號’黃瓜父母本為模板，利用合成的200 對SSR 引物進行PCR 擴增及檢測，篩選出12 對父母本條帶差異性引物。將此12 對引物在F1中進行驗證，經多次重復比較，篩選雜交種與父母本呈現共顯性互補帶型分離的引物組合，最終篩選出3B-10、2B-41 兩對SSR 引物（表1）。這兩對引物所擴增出的條帶清晰、穩定性和重復性好，在父母本中有共顯性差異。3B-10 引物在母本A-2 材料中擴增到特異性條帶P1-A，在父本C-8 材料中擴增到特異性條帶P2-B（圖2A）；2B-41 引物在母本A-2 材料中擴增到特異性條帶P1-C，在父本C-8 材料中擴增到特異性條帶P2-D（圖2B）。

表1 ‘粵秀3 號’SSR 分子標記的引物序列Table 1 Sequences for SSR molecular markers of ‘Yuexiu No.3’

圖2 引物3B-10（A）和2B-41（B）對‘粵秀3 號’及其親本的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of‘ Yuexiu No.3’ and its parents with primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B)

2.3 黃瓜SSR 分子標記純度鑒定

取‘粵秀3 號’黃瓜材料基因組DNA，用3B-10、2B-41 兩 對SSR 引物進行PCR 檢測。3B-10 引物在44 份‘粵秀3 號’黃瓜F1代基因組DNA 擴增結果中，43 株具有父母本雙方的特異條帶P2-B 與P1-A（圖3），1 株僅具有母本特異性條帶P1-A，得出‘粵秀3 號’黃瓜種子純度為97.73%；2B-41 引物的檢測結果與3B-10 引物結果一致（圖4）。綜上，本研究所篩選的兩對SSR 分子標記均可穩定、準確地對‘粵秀3 號’黃瓜進行種子純度鑒定。

圖3 引物3B-10 對‘粵秀3 號’親本及其雜交F1 代種子的純度鑒定Fig.3 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No.3’ parents and their hybrid F1 generation by primer 3B-10

圖4 引物2B-41 對‘粵秀3 號’親本及其雜交F1 代種子的純度鑒定Fig.4 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No.3’ parents and their hybrid F1 generation by primer 2B-41

2.4 ‘粵秀3 號’黃瓜田間性狀鑒定

田間性狀（主要包括瓜型、瓜長、皮色、刺瘤、瓜重等）鑒定結果顯示，隨機選取的100 株‘粵秀3 號’黃瓜植株中有98 株為雜交種，2 株性狀表現為母本類型，其田間純度為98%；用3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記對44 份‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定，結果顯示，43 份為雜交種，1 份為母本類型，種子純度為97.73%，與田間性狀鑒定結果一致。表明這兩對SSR 分子標記可準確地對‘粵秀3 號’黃瓜進行分子純度鑒定。

2.5 黃瓜SSR 分子標記特異性鑒定

在‘粵秀3 號’黃瓜中增加性狀相似的‘中農108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農8 號’‘津研四號’黃瓜品種種子作為假種子，同時使用3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記對‘粵秀3 號’及其他49 份種質材料進行鑒定。結果顯示，3B-10、2B-41 兩對引物在‘粵秀3 號’中為雜合互補帶型，在‘中農108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農8 號’中為父本或母本的純合條帶，在‘津研四號’中則無條帶顯示（圖5），表明3B-10、2B-41 為‘粵秀3 號’的特異性分子標記，可明顯區分 ‘粵秀3 號’種子與其他參試黃瓜品種。

圖5 引物3B-10（A）和2B-41（B）對‘粵秀3 號’的特異性鑒定Fig.5 Specificity verification of primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B) for ‘Yuexiu No.3’

利用3B-10 及2B-41 對‘粵秀3 號’黃瓜與其他49 份黃瓜種質資源的真實性進行鑒定，結果（圖6、圖7）發現，僅‘粵秀3 號’黃瓜具有父母本的兩個條帶，其他49 份黃瓜種質資源均未出現該兩條電泳條帶。但3B-10 在49 份黃瓜種質資源中多態性較高，未能有效區分7×8、24×25、36×37 等組合的雜交種。表明本研究所篩選的兩對SSR 分子標記中，2B-41 對‘粵秀3 號’黃瓜具有更好的特異性，可用于‘粵秀3 號’黃瓜真實性鑒定。

圖6 引物3B-10 對‘粵秀3 號’的真實性鑒定Fig.6 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 3B-10

圖7 引物2B-41 對‘粵秀3 號’的真實性鑒定Fig.7 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 2B-41

2.6 SSR 分子標記差異性條帶序列的鑒定分析

為明確3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記在‘粵秀3 號’黃瓜及其父母本中所擴增到的DNA序列及其差異，本研究對父母本中所擴增到的差異條帶進行膠回收，將DNA 片段連接至T 載體測序并對比分析。結果（圖8、圖9）表明，3B-10在父母本中所擴增到的差異條帶P1-A（160 bp）比P2-B（190 bp）在49～79 bp 處缺少5 個6 堿基（GTGAGG）的簡單重復序列；2B-41 在父母本中所擴增到的差異條帶P1-C（218 bp）則比P2-D（206 bp）在120～131 bp 處缺少12 個堿基。

圖8 引物3B-10 擴增父母本DNA 差異片段的序列比對Fig.8 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 3B-10

圖9 引物2B-41 擴增父母本DNA 差異片段的序列比對Fig.9 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 2B-41

3 討論

目前，我國蔬菜種子市場處于瓶頸期，種子質量是農業生產中的重要元素，其質量的優劣程度直接影響到農產品的質量和產量。種子純度鑒定不僅是保證種子質量不可或缺的一部分，而且在品種權保護、品種登記管理、種質資源多樣性分析及種子生產中有重要價值［38］。相對于周期長、成本高、易受環境影響的傳統種子純度鑒定方法，以SSR 分子標記為基礎的種子純度鑒定方法快速、高效、低成本且操作簡單，是目前商品種種子純度鑒定的理想方法［8］。

隨著黃瓜產業發展及生產的需求，越來越多的新品種涌入市場，同時也存在劣種、假種等現象，在黃瓜育種及制種過程中黃瓜品種純度的鑒定顯得尤為重要［9］。利用SSR 分子標記對黃瓜進行分子純度鑒定，結果更為準確，且與田間鑒定結果一致。李海梅等［9］基于黃瓜線粒體父系遺傳特性，從線粒體基因組中的72 對SSR 引物中篩選出4 對引物，在30 份黃瓜品種中呈現多態性，其中利用引物mtSSR4 和mtSSR10 對4 份黃瓜F1種子純度進行鑒定，結果顯示黃瓜F1種子的帶型與其父本一致，可將摻入雜交組合中的假種子區分開。但其種子鑒定結果有一定的局限性，不能排除F1種子中摻入雜交種父本的情況，而本研究所篩選到的引物可嚴格區分出雜交種子的父母親本。周勝軍等［12］從699 對SSR 引物中篩選出3 對引物，其可有效鑒定出‘浙秀1 號’黃瓜雜交種及其父母親本，引物穩定性良好且種子純度鑒定結果與田間鑒定結果一致，但其未對所篩選引物的特異性進行鑒定，僅限于對父母本的區分，不能與其他品種黃瓜種子相區分。本研究使用與‘粵秀3 號’黃瓜田間性狀類似的5 個黃瓜品種及其他49 份黃瓜種質資源對3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記的特異性進行驗證，結果表明所篩選到的SSR 分子標記2B-41 不僅可鑒定其純度，也可有效地將‘粵秀3 號’與其他相似黃瓜品種區分開來，說明該標記對‘粵秀3 號’黃瓜品種有良好的特異性，實現了其對品種的真實性鑒定。陳鴻鴕等［37］利用100 對SSR 引物對黃瓜品種‘SH23’及其親本進行篩選，得到5 對在‘SH23’及其親本和對照品種間多態性較高的SSR 引物，均可有效鑒別出‘SH23’及其他品種，表明SSR 標記可用于黃瓜品種的真實性鑒定。本研究所建立的‘粵秀3號’黃瓜種子純度鑒定方法，在科學取樣的基礎上得到種子純度鑒定結果，其準確率可達100%。此外，本研究解析了3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記在‘粵秀3 號’黃瓜父母本中的差異條帶，與前人已報道的黃瓜種子純度鑒定相比，豐富了SSR 分子標記的內涵，明確了具體的DNA 差異片段序列信息，增強了SSR分子標記在鑒別和區分黃瓜品種遺傳背景差異的能力?！浶? 號’為華南地區主要的黃瓜栽培品種，該分子標記的開發可有效解決制種后的種子質量檢測滯后問題，大幅節約時間及人工成本，為‘粵秀3 號’在華南地區的推廣提供技術支撐。

4 結論

本研究從200 對SSR 分子標記引物中篩選得到可用于‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定的兩對引物3B-10 和2B-41。3B-10 引物在父、母本中可分別擴增出190 bp 和160 bp 的特異性條帶，而2B-41 引物在父、母本中則分別能夠擴增出206 bp 和 218 bp 的特異性條帶，這些條帶均可作為特異標記使用；兩對引物均能夠有效區分 ‘粵秀3號’雜交種子與其父本、母本，且該結果與田間生物學鑒定結果一致。2B-41 可用于‘粵秀3 號’的真實性鑒定，可有效地將其與其他品種種子所區分。本研究所開發的3B-10 和2B-41 兩對SSR分子標記引物可快速、準確、有效地對黃瓜‘粵秀3 號’雜交種子的純度進行鑒定，且操作簡單、成本較低，能夠替代傳統雜交種子純度鑒定的方法，具有極高的商業應用價值。