納米模擬酶的制備與活性

沈 楠,華紹烽

(河南理工大學,河南 焦作 454000)

天然酶自身的脆弱性與操作不穩定性限制了其在酶催化系統中的廣泛應用,納米模擬酶性能穩定,成本低,既有納米材料的優良特性,又有生物催化性能。因此,納米模擬酶成為一種新型生物催化劑[1]。

還原態氧化石墨烯(rGO)性能穩定,其較大的比表面積[2]能夠減少磁性納米材料的聚集,催化位點豐富[3-5],可被用于酶固定化載體。銅基納米模擬酶因其銅離子價態間的高效轉化,表現出良好的類酶活性,可催化H2O2[6]、酚類[7]和胺類[8-9]等物質的轉化。Kim K等[10]研究表明,還原氧化石墨烯的褶皺結構能夠保護銅納米顆粒不受過度氧化的影響,從而能夠形成穩定的Cu-rGO復合材料。

將磁性納米粒子與Cu-rGO復合材料結合,形成磁性催化劑,在外部磁場作用下,容易從反應體系中分離,從而獲得循環使用的模擬酶催化劑。同時改善磁性納米粒子易團聚效應[11],適合工業化應用。

本文通過同步還原法制備一種具有類過氧化氫酶活性的納米模擬酶(Cu-rGO),并將其與磁性納米粒子結合,進行XRD表征,研究其催化活性以及優化反應條件,最后用于H2O2分解實驗。

1 實驗部分

1.1 儀 器

紫外分光光度計,Ultrospec 7000,通用電氣公司;高速離心機,TG1650-W,湖南滬康離心機有限公司;磁力攪拌器TWCL-G,水浴鍋TWLL-G,鄭州生元儀器有限公司;超聲波清洗器,KX-1740QT,北京科璽世紀科技有限公司;轉靶X射線衍射儀,SmartLab(9 kW),日本株式會社理學公司。

1.2 試 劑

石墨粉,8 000目,99.95%,上海麥克林生化科技有限公司;無水硫酸銅,分析純,天津市河東區紅巖試劑廠;氫氧化鈉,分析純,天津市大陸化學試劑廠;過氧化氫,30%,煙臺市雙雙化工有限公司;無水乙酸鈉,分析純,洛陽市化學試劑廠;冰乙酸,分析純,天津威晨化學試劑科貿有限公司;3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB),≥99.9%,上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇,分析純,煙臺市雙雙化工有限公司;六水合三氯化鐵,分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;氯化亞鐵,分析純,天津歐博凱化工有限公司;氨水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,分析純,洛陽市化學試劑廠。

1.3 氧化石墨烯(GO)制備

采用修飾的Hummers法制備了氧化石墨烯[12]。磁力攪拌下,將1.0 g的NaNO3和44 mL濃硫酸添加到250 mL圓底燒瓶中,接著添加1.5 g石墨粉,在冰浴下將反應體系冷卻至4 ℃以下。緩慢加入6 g KMnO4(使溫度控制在約10 ℃),繼續反應20 min后,升溫至40 ℃,反應2 h。然后將100 mL 去離子水緩慢滴加到反應體系,升溫至85 ℃,反應10 min,再緩慢滴加4.7 mL的H2O2(30%)。冷卻,產物經HCl溶液(0.5 mol·L-1)離心洗滌,至上清液與BaCl2溶液不產生沉淀,之后由去離子水離心洗滌至中性。最后,冰水浴中超聲(250 W,40 kHz)40 min,離心,干燥,備用。

1.4 Cu-rGO制備[10]

將30 mL的GO水溶液(2 mg·mL-1)與27 mg的CuSO4混合,攪拌(10～15) min,加入2.1 mL的0.5 mol·L-1的NaOH,加熱至70 ℃,反應5 min,此時顏色瞬間變成深灰色。自然冷卻至室溫,快速加入1.8 mL水合肼溶液(80%),攪拌40 min,反應瓶中出現深紫色物質。將產物用過量的乙醇離心洗滌,50 ℃真空干燥。

1.5 Fe3O4制備[13]

將FeCl2·4H2O溶液與FeCl3·6H2O溶液按物質的量比1∶2混合,40 ℃水浴機械攪拌10 min,然后在該條件下緩慢滴加1.28 mol·L-1的NaOH,至pH=10,在氮氣氣氛下繼續反應30 min,得到黑色顆粒(Fe3O4MNPs)。靜置,在外部磁場的作用下用去離子水離心洗滌數次,干燥,充氮氣保存。

1.6 Cu-rGO-Fe3O4制備

通過共沉淀法制備Cu-rGO-Fe3O4,將Cu-rGO與Fe3O4按質量比2∶1進行混合,常溫攪拌15 h,在外界磁場作用下洗滌干燥。

2 結果與討論

2.1 XRD

在25 ℃和掃描速率10°·min-1條件下,采用軟件OriginPro 9.0分析得到的數據,分析其晶體結構。圖1為Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4和Fe3O4的XRD圖。

圖1 Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4和Fe3O4的XRD圖Figure 1 XRD patterns of Cu-rGO,Cu-rGO-Fe3O4 and Fe3O4

由圖1可以看出,2θ=43.4°、50.5°和74.2°的特征衍射峰,可以歸屬于Cu的(111)、(200)和(220)晶面,表明Cu2+在氧化石墨烯上的還原。Fe3O4的衍射峰出現在2θ=30.2°、35.5°、43.2°、53.5°、57.1°、62.7°和74.1°,依次對應于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)和(533)晶面,表明Fe3O4納米粒子的成功制備[14]。Cu-rGO-Fe3O4的XRD圖中,在2θ=50.5°存在Cu的特征衍射峰,對應(111)晶面,在2θ=43.2°和74.1°的衍射峰強度大于Fe3O4在該處的峰強,表明Cu-rGO與Fe3O4的成功結合,并且反應前后晶體結構保存完好。

2.2 類過氧化物酶活性

(1) 相對活性

H2O2為反應底物,TMB為顯色劑,測定Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的相對酶活性。將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在50 ℃條件下反應,藍色顯色后,用紫外-可見分光光度計在652 nm處記錄吸光度。吸收峰強度越高,類過氧化物酶活性越高。

相對活性(%)=A1/A2×100%

式中,A1為記錄的吸光度,A2為一組中最大的吸光度。A1和A2是在相同條件下測量的吸光度。

(2) 活 性

取5支試管做實驗組,1支試管做空白組?？瞻捉M加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5),1 mL硫酸(8%),1.5 mL蒸餾水。實驗組加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、1 mL硫酸(8%)、不同體積的H2O2(5.402 6 mg·mL-1)和不同體積的蒸餾水,構成總體積4 mL的反應體系?？瞻捉M調零,使用紫外分光光度計記錄240 nm處的吸光度,繪制H2O2濃度標準曲線。

取2支試管,1支為對照組,按順序加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5),0.1 mL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、0.2 mL蒸餾水、1 mL硫酸(8%)和0.2 mL的H2O2(5.402 6 mg·mL-1)。另1支為實驗組,按順序加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、0.1 mL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、1.2 mL蒸餾水和0.2 mL的H2O2(5.402 6 mg·mL-1),反應4 min后立即加入1 mL硫酸(8%)終止反應。在240 nm處以蒸餾水調零,分別記錄對照組與實驗組的吸光度。Cu-rGO-Fe3O4的活性測定同上。

類過氧化物酶活性用每毫克酶在1 min內消耗的H2O2的毫克數來表示。

式中,a,b為標準曲線回歸方程常數;Ak為對照組吸光度;As為實驗組吸光度;t為時間,min;ω為酶的質量,mg。

H2O2在Cu離子催化下產生羥基自由基·OH-,可使顯色劑TMB變為藍色。為了研究Cu-rGO的類過氧化物酶活性,在H2O2存在條件下,以TMB作為顯色基質,記錄不同體系在50 ℃條件下反應的顏色變化,不同反應體系的紫外-可見吸收光譜和不同納米模擬酶的活性如圖2所示。

圖2 不同反應體系的紫外-可見吸收光譜(a)和不同納米模擬酶的活性(b)Figure 2 UV-Vis absorption spectra of different reaction systems(a) and cctivity comparison of different nano-mimetic enzymes(b)

由圖2(a)可以看出,TMB+H2O2+Cu-rGO體系在652 nm處具有較強的吸收峰,其他三個反應體系沒有明顯的吸收峰,表明Cu-rGO能夠催化H2O2,使TMB發生顏色反應,同時證實Cu-rGO具有類過氧化物酶活性。由圖2(b)可以看出,Cu-rGO的類過氧化物酶活性低于Cu-rGO-Fe3O4,這可能因為Fe3O4在Cu-rGO表面的附著減小了粒子之間的團聚效應,增大與底物的接觸面積從而提高酶催化活性。

2.3 酶學性質

2.3.1 反應溫度

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在不同溫度下進行反應,利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖3為反應溫度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖3 反應溫度對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effects of temperature on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖3可見,在(25～50) ℃,Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO納米復合材料的類過氧化物酶活性均隨著反應溫度升高逐漸升高,在反應溫度50 ℃時,催化活性最強,之后隨反應溫度的升高而下降。故Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適反應溫度為50 ℃。

2.3.2 pH值

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL不同pH值的醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1)混合,在50 ℃條件下反應,利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖4為pH值對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響。由圖4可以看出,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4在pH=3.0時,催化活性最高,故Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適pH=3.0。

圖4 pH值對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 4 Effects of pH value on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

2.3.3 反應時間

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在50 ℃下反應,利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖5為反應時間對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖5 反應時間對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 5 Effects of reaction time on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖5可以看出,反應時間500 s前,Cu-rGO的催化速率比Cu-rGO-Fe3O4快。反應500 s后,Cu-rGO的催化活性顯著減小,而Cu-rGO-Fe3O4在反應600 s時催化活性最高。故Cu-rGO的最佳反應時間為500 s,Cu-rGO-Fe3O4的最佳反應時間為600 s。

2.3.4 重復性

將30 μL的TMB、6 mg的Cu-rGO-Fe3O4、15 μL蒸餾水、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,50 ℃下反應10 min。反應結束后在外界磁場的作用下分離Cu-rGO-Fe3O4,用去離子水洗滌數次,進行下一次循環實驗。每次循環實驗使用紫外分光光度計在652 nm處記錄吸光度。圖6為Cu-rGO-Fe3O4反應4個循環后的相對活性。

圖6 Cu-rGO-Fe3O4反應4個循環后的相對活性Figure 6 Relative activity of Cu-rGO-Fe3O4 after four cycles

由圖6可以看出,Cu-rGO-Fe3O4循環反應4次后仍具有80%的催化活性,并且在循環使用過程中酶活性下降緩慢。

2.3.5 TMB濃度

選擇30 μL不同濃度的TMB溶液(0.625 mmol·L-1、1.25 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、3.75 mmol·L-1、5 mmol·L-1、7.5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1)與15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合反應,利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖7為TMB濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖7 TMB濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 7 Effects of TMB concentration on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖7可見,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的催化活性都隨著TMB濃度的增大而升高,當TMB濃度為20 mmol·L-1時達到最大催化活性。因此,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適TMB濃度為20 mmol·L-1。

2.3.6 H2O2濃度

保持TMB濃度不變,選擇100 μL不同濃度的H2O2溶液(0.8 mmol·L-1、1 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1、300 mmol·L-1)與15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、30 μL的TMB和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合反應,利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖8為H2O2濃度對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響。由圖8可見,當H2O2濃度為(0.8～30) mmol·L-1,Cu-rGO的催化活性隨著H2O2濃度的增大而逐漸增強;當H2O2濃度為30 mmol·L-1時達到最大催化活性,之后隨著H2O2濃度的增大而緩慢減小。Cu-rGO-Fe3O4在H2O2濃度為20 mmol·L-1時達到最大催化活性。因此,Cu-rGO的最適H2O2濃度為30 mmol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的最適H2O2濃度為20 mmol·L-1。

圖8 H2O2濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 8 Effects of H2O2 concentration on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

2.4 底物H2O2濃度范圍

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、100 μL不同濃度的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,50 ℃下反應500 s,記錄紫外分光光度計在652 nm處的吸光度。Cu-rGO-Fe3O4檢測底物H2O2濃度范圍的方法同上。圖9為Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO催化反應的吸光度與H2O2濃度的線性關系。

圖9 Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO催化反應的吸光度與H2O2濃度的線性關系Figure 9 The linear relationship between the absorbance with concentrations of hydrogen peroxide using Cu-rGO-Fe3O4 and Cu-rGO catalyst

由圖9(a)可以看出,Cu-rGO-Fe3O4在(0.52～100) μmol·L-1,H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關系,檢出限約0.38 μmol·L-1。由圖9(b)可以看出,Cu-rGO在(1.04～100) μmol·L-1,H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關系,檢出限約1.0 μmol·L-1。因此,Cu-rGO-Fe3O4的靈敏度更高,檢測范圍更廣,具有更好的檢測性能。

3 結 論

采用同步還原法制備了納米模擬酶Cu-rGO,通過共沉淀法制備磁性納米模擬酶Cu-rGO-Fe3O4,二者具有類似的最適反應溫度與最適pH值,Cu-rGO的最佳反應時間為500 s,Cu-rGO-Fe3O4的最佳反應時間為600 s,Cu-rGO的類過氧化物酶活性低于Cu-rGO-Fe3O4。Cu-rGO-Fe3O4循環使用4次后仍具有80%的相對活性,表現出較好的穩定性。Cu-rGO的最佳H2O2和TMB濃度分別為30 m mol·L-1和20 m mol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的最佳H2O2和TMB濃度分別為20 m mol·L-1和20 m mol·L-1。Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4對H2O2濃度的檢出限分別約為1.04 μmol·L-1和0.5 μmol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的靈敏度更高,對H2O2具有更好的檢測性能。其中,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4對H2O2的選擇性,需要進一步條件優化。