呼吸機相關性肺炎病原菌釋放VOCs的非靶向質譜分析

丁厚文,許 偉,王中新,劉 周,丁月婷,鄒 雪,王 琴,張 浩,陳治東,沈成銀,周 強

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科,安徽 合肥 230601;2.中國科學院合肥物質科學研究院健康與醫學技術研究所,醫學物理與技術安徽省重點實驗室,安徽 合肥230031;3.安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科,安徽 合肥 230022)

呼吸機相關性肺炎(VAP)是重癥監護病房(ICU)內一種高發病率(約5%～40%)和高死亡率(約10%)的醫院獲得性感染[1-2],由銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等微生物感染引起[3-4]。目前,臨床上VAP的診斷依賴于對下呼吸道痰標本的微生物病原學診斷,但痰標本采樣操作有創且繁瑣,且整個診斷過程耗時24 h以上。

呼氣檢測具有無創、便捷的特點。近年來,利用呼氣中的揮發性有機物(VOCs)篩查與診斷相關疾病得到關注,已涉及胃腸道疾病[5]、肝臟疾病[6]、呼吸系統疾病[7]、糖尿病[8]和癌癥[9]等。利用呼氣中的VOCs診斷VAP具有一定潛力,已有數項研究嘗試得到VAP患者呼氣中的特異性VOCs[10-14],然而,由于樣本數量小、個體差異大和病原菌不同等原因,獲得的結論均不同。但這些研究均認為VAP患者下呼吸道及肺部寄生的病原菌會釋放VOCs,這些VOCs會影響受試者呼氣中VOCs的具體分布,從而形成具有區分人群效果的標志性VOCs。因此,非靶向檢測與分析VAP病原菌釋放的VOCs,對相關呼氣檢測研究具有指導意義。

目前,檢測與分析VAP病原菌體外培養過程中釋放VOCs的報道不多。Oluwasola等[15]利用熱脫附-氣相色譜-質譜(TD-GC-MS)法檢測陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌共培養過程中釋放的VOCs,發現23種含量顯著提升且來自于細菌的物質。Filipiak等[16]利用氣相色譜-質譜(GC-MS)法對比檢測了金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌培養過程中的頂空樣本,分別釋放32、37種VOCs,且特異性VOCs質譜圖有明顯差異。但引起VAP的病原菌菌種遠不止這3種[3-4],因此,有必要系統地研究VAP主要病原菌是否釋放特定種類VOCs。

本研究擬在體外培養銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和表皮葡萄球菌等8種VAP病原菌,獲取其培養過程中的頂空樣本,利用固相微萃取-氣相色譜-質譜(SPME-GC-MS)法進行檢測,分析并討論8種VAP病原菌所釋放VOCs的異同。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

氣相色譜-三重四極桿質譜儀:美國Thermo Fisher公司產品,配有電子轟擊離子源(EI)及Xcalibur 2.2數據處理系統;紫外分光光度計:上海美普達儀器有限公司產品,配有長壽命氘燈、鎢燈;搖床培養箱:上海力辰儀器科技有限公司產品,配有回旋、往復振蕩系統。

1.2 菌株與材料

臨床上常見的VAP病原菌有近20種[17]。美國胸科學會的統計報告[18]顯示,VAP事件中各類病原菌占比為:銅綠假單胞菌24.4%,金黃色葡萄球菌20.4%,腸桿菌科14.1%,不動桿菌屬7.9%,嗜麥芽窄食單胞菌1.7%,凝固酶陰性葡萄球菌1.4%,嗜血桿菌屬9.8%,鏈球菌屬8.0%,肺炎鏈球菌4.1%,奈瑟菌屬2.6%,厭氧菌0.9%,真菌0.9%,其他3.8%。因此,本研究遴選了8種常見且具有代表性的標準菌株作為研究對象,包括銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、大腸埃希菌(ATCC25922)、陰溝腸桿菌(ATCC13047)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、鮑曼不動桿菌(ATCC19606)、嗜麥芽窄食單胞菌(ATCC17666)和表皮葡萄球菌(ATCC12228),所有標準菌株均購自上海魯微科技有限公司。

正己烷中C10～C40正構烷烴類混標(1 000 mg/L):北京壇墨質檢科技有限公司產品;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基:青島海博生物技術有限公司產品;封口膜:美國Bemis公司產品;高純空氣、高純氦氣:純度>99.999%,南京特種氣體有限公司產品;PVF采樣袋:大連德霖氣體包裝有限公司產品;125 mL頂空瓶:自制。

1.3 體外培養與頂空采樣

1.3.1體外培養標準菌株 將保存完好的標準菌株在37 ℃以200 r/min搖動孵育過夜,隨后將少量菌液置于試管中,用紫外分光光度計檢測均質菌液在600 nm波長處的吸光值(OD600),兌入0.9%氯化鈉溶液稀釋菌液,直至被稀釋至OD600=1。TSB培養基為加富培養基,廣泛用于培養好氧菌、厭氧菌和真菌,取25 mL配制的TSB培養基和1 mL稀釋后的菌液,先后加入頂空瓶中,使用封口膜將頂空瓶的進氣與出氣導管口密封,于37 ℃搖床培養箱中培養,充分振蕩。

1.3.2頂空采樣 體外培養過程中,細菌在頂空瓶的瓶體中增殖,培養基上方100 mL的空體積中積聚了大量細菌產生的VOCs,振蕩培養10 h后進行頂空采樣。使用玻璃注射器向該器皿的進氣導管勻速注入100 mL載氣(高純空氣),經導管引導后從底部注入培養基,隨后將筒體中的頂空氣體從出氣導管壓出,使用200 mL PVF采樣袋收集頂空氣體。實驗流程示于圖1。

圖1 病原菌的體外培養及頂空獲取(a)、利用PVF采樣袋和SPME-GC-MS收集和檢測頂空樣本(b)的示意圖Fig.1 Schematic diagrams of in vitro cultivation and headspace acquisition of pathogenic bacteria (a), collection and detection of headspace samples using PVF sampling bags and SPME-GC-MS (b)

1.4 頂空檢測與保留指數計算

1.4.1樣品預處理 首先將SPME纖維在200 ℃氣相色譜進樣口預處理30 min,去除可能殘留的VOCs。隨后進行預富集,在37 ℃恒溫箱中對PVF采樣袋進行VOCs頂空固相微萃取,將萃取纖維(65 μm厚PDMS/DVB)刺入袋內,萃取40 min。最后,將萃取的VOCs通過氣相色譜-三重四極桿質譜儀檢測。

1.4.2色譜條件 TG-624SILMS色譜柱(30 m×0.32 mm×1.80 μm);載氣(高純氦氣)流速1.5 mL/min,不分流進樣;進樣口溫度200 ℃;SPME纖維解吸時間30 s;升溫程序:40 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至180 ℃,并保持2 min。

1.4.3質譜條件 EI源;電子能量70 eV,傳輸線溫度275 ℃,質量掃描范圍m/z45～300。

1.4.4保留指數(RI) 在非靶向檢測中,通過加入正構烷烴的標準混合物以獲得保留時間,計算出保留指數。以C10～C40正構烷烴混合標準品的保留時間計算樣品中化學成分的RI:

(1)

式中,TR表示保留時間,x表示待分析的化合物,n表示正構烷烴的碳原子數,且TR(n)

取20 μL正己烷中C10～C40正構烷烴類混標溶劑于10 mL頂空瓶中,以相同的色譜和質譜條件進行頂空檢測,得到各正構烷烴的保留時間。根據組分和各正構烷烴的保留時間計算樣品中組分的RI值。RI文獻值參考PubChem數據庫中的檢索結果。

2 結果與討論

借助NIST質譜數據庫對VOCs進行定性分析,當計算得到的反向檢索指數(RSI)超過800時認為匹配良好。通過頂空氣體可以檢測到VAP病原菌體外培養過程中釋放的VOCs,但培養基本身也會釋放一定種類及濃度的VOCs,為避免此干擾,本實驗以空白培養基為背景進行判定。判定準則為:若質譜檢測到某種細菌產生的某種VOC的峰面積大于或等于2倍背景值,則認為此細菌釋放了該VOC,否則認為該VOC來自培養基。培養基的VOC釋放情況與空氣背景進行對比判定。隨后,將SPME-GC-MS檢測到的VOCs按照酮、醛、醚、醇、酸、酯、烷烴、苯系物、酰胺和(含氮)雜環進行分類討論。

2.1 酮、醛類VOCs

8種病原菌產生的酮、醛類VOCs的檢測結果列于表1。8種病原菌中僅金黃色葡萄球菌釋放了2-丁酮和3-羥基-2-丁酮,其余菌種均不產生酮類VOCs。Zechman等[19]與Filipiak等[16]利用GC-MS檢測到金黃色葡萄球菌會釋放2-丁酮與3-羥基-2-丁酮,與本研究結果一致。在由金黃色葡萄球菌致病引起的囊腫性纖維化(CF)患者的呼氣檢測中[20-21]發現,患者呼氣中的2-丁酮上升,表明其可能部分來源于寄生細菌代謝。此外,取由金黃色葡萄球菌導致的細菌性鼻竇炎(BS)患者的鼻竇粘液進行測試,觀察到3-羥基-2-丁酮的異常釋放[22],表明金黃色葡萄球菌在人體內(BS患者鼻竇處)會產生3-羥基-2-丁酮,這與體外培養的模擬結果相符。

肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌和陰溝腸桿菌會釋放一定種類及濃度的醛類VOCs,包括異戊醛和五氟苯甲醛,但在空白培養基中不存在。根據報道[16,23],乙醛是一種普遍的細菌代謝VOC,是生物體中最常見的乙醇氧化產物,而且絕大多數細菌都具有乙醛脫氫酶(ALDH)編碼基因[24],即通過ALDH活性進行乙醛代謝的途徑在細菌中很常見。乙醛的分子質量為44,與空氣中廣泛存在的CO2一致,因此,本研究中設置的質量掃描范圍起點為m/z45則無法檢測到乙醛。在本課題組前期研究[2]中,使用質子轉移反應質譜(PTR-MS)檢測了5種病原菌體外培養過程中乙醛的濃度變化情況,發現均釋放了乙醛。

2.2 醚、醇類VOCs

8種病原菌產生的醚、醇類VOCs的檢測結果列于表2。8種病原菌在體外培養過程中均產生了二甲醚,部分產生了二丁醚。肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌釋放了二甲基二硫醚(DMDS),大腸埃希菌和嗜麥芽窄食單胞菌釋放了二甲基三硫醚(DMTS),均為揮發性含硫化合物(VSCs)。有研究發現,銅綠假單胞菌會釋放低濃度的DMDS和DMTS[16],其中DMTS在病原菌培養24 h后開始逐步釋放。本研究僅檢測到DMDS信號,可能由于培養時間不足,導致DMTS的釋放濃度較低,Thorn等[25]的研究也佐證了該觀點。Kelly等[26]利用表面增強拉曼光譜(SERS)發現大腸埃希菌產生了DMDS;Ratiu等[27]利用SPME-GC-MS在3種不同培養基質(TSB、MH和M9)中均檢測到大腸埃希菌釋放了DMDS和DMTS,與本研究結果一致。

在體外培養過程中,病原菌會釋放多種醇類VOCs,包括2-乙基己醇、2-甲基-1-丁醇、甲硫醇、2,2-二甲基丁醇、叔丁醇、1-十一醇、2-氯乙醇和2-甲基-3-庚醇。所有病原菌均釋放了甲硫醇,其為1種具有惡臭氣味的VSC。Allardyce等[28]和Chippendale等[29]在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長環境中檢測到額外的甲硫醇;Tangerman[30]認為哺乳動物體內(特別是腸道)普遍存在由細菌釋放的甲硫醇,表明較多細菌具備產生甲硫醇的能力。此外,人體口腔中亦含有低濃度的甲硫醇[31],是由口腔細菌對含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸)降解產生的[32-33]。

2.3 酸、酯類VOCs

8種病原菌產生的酸、酯類VOCs的檢測結果列于表3。在所有病原菌中,僅檢測到大腸埃希菌產生了乙酸。有研究[28]使用選擇離子流動管質譜(SIFT-MS)檢測血培養環境下銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和腦膜炎奈瑟菌的VOCs釋放情況,發現僅有大腸埃希菌生成了乙酸;Sovova等[34]利用SIFT-MS檢測深紅沙雷氏菌、粘質沙雷氏菌和大腸埃希菌的VOCs釋放情況,同樣發現僅有大腸埃希菌產生了乙酸,與本研究結果一致。大腸埃希菌在特定情況下發生三羧酸(TCA)循環的能力是有限的,這可能是其生成乙酸的原因[35]。在高增長率(本研究為大腸埃希菌在TSB培養基中的指數增長)下,由于過程中產生了大量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP),大腸埃希菌合成乙酸作為能量來源路徑。

8種病原菌釋放了種類繁雜的酯類物質,包括丙烯酸正丁酯、硫代丙酸S-乙酯、乙酸己酯、丙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯和異戊酸乙酯。有報道[16,36-37]指出,不同種類細菌在不同培養基質下同樣產生了種類繁雜的酯類物質,如甲基丙烯酸甲酯、乙酸丙酯、苯甲酸甲酯等。Filipiak等[16]認為酯類VOCs的背景濃度相對較高且不穩定,對病原體感染相關的呼氣研究而言參考價值較低。

2.4 烷烴、苯系物類VOCs

8種病原菌產生了多種烷烴類VOCs,但苯系物相對較少,列于表4。目前,多項研究表明,一些細菌釋放的VOCs包含烷烴類物質,有研究[38]在卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌和嗜肺軍團菌的體外培養過程中檢測到庚烷和甲基環己烷等烷烴,枯草芽孢桿菌會產生庚烷[39]。此外,銅綠假單胞菌會持續釋放正十二烷[40]和亞乙基環丙烷[41]。Patel等[42]利用TD-GC-MS檢測到分離培養較困難的艱難梭菌會釋放正十二烷,而本課題組亦發現多種病原菌會產生正壬烷、正癸烷、正十一烷、正十四烷、正十五烷等長鏈烷烴,也有研究報道過細菌釋放正十一烷[20]和正十四烷[43]等烷烴類物質。Gao等[43]發現鮑曼不動桿菌在體外培養過程中釋放正十四烷,在鮑曼不動桿菌引起的VAP患者呼氣中檢測到正十四烷升高,與本研究結果一致。

2.5 酰胺、雜環類VOCs

本研究在病原菌頂空中檢測到酰胺類(3,5-二羥基苯甲酰胺和N-甲基甲酰胺)和(含氮)雜環類(2,5-二甲基吡嗪和吡嗪)VOCs,列于表5。Mariia等[44]發現,以厚壁芽孢桿菌為代表的菌群含有將Nτ-甲基組氨酸降解為L-谷氨酸和N-甲基甲酰胺的酶,并描述了菌源性N-甲基甲酰胺的生化合成過程,本研究同樣在大腸埃希菌、嗜麥芽窄食單胞菌和金黃色葡萄球菌的頂空中檢測到了N-甲基甲酰胺。此外,有研究[45-46]報道了N-?；０奉?、N-異戊基甲酰胺和N-異戊基乙酰胺等來自于細菌的酰胺類VOCs。吡嗪等含氮雜環類物質在細菌VOCs的研究中鮮有報道,本研究僅在大腸埃希菌中檢測到2種相關VOCs,Bean等[47]檢測到甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等,與本研究結果部分一致。此外,Dickschat等[48]在體外培養海洋細菌時發現其可以產生多種吡嗪類VOCs,進一步表明部分細菌具有合成含氮雜環類(特別是吡嗪類)物質的能力。

3 結論

本研究在體外培養了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和表皮葡萄球菌等8種VAP病原菌,并獲取頂空樣本。利用SPME-GC-MS非靶向檢測與分析病原菌釋放的VOCs,并進行分類討論。研究表明,8種VAP病原菌共釋放了44種差異性VOCs,包括酮、醛、醚、醇、酸、酯、烷烴、苯系物、酰胺和(含氮)雜環,且均產生了二甲醚和甲硫醇;僅金黃色葡萄球菌釋放了2-丁酮和3-羥基-2-丁酮;僅大腸埃希菌產生了乙酸;僅大腸埃希菌、嗜麥芽窄食單胞菌和金黃色葡萄球菌生成了N-甲基甲酰胺。此外,肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌釋放了DMDS,嗜麥芽窄食單胞菌釋放了DMTS。本研究較系統、具體地分析了8種VAP病原菌釋放VOCs的異同,可以為VAP相關的呼氣檢測研究提供參考。