改良QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定烏雞肉中35種獸藥殘留

季寶成,楊瀾瑞,程迎新,侯鑄琛,呂 佳,許 旭,白艷紅

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南 鄭州 450001;2.河南省冷鏈食品安全質量安全控制重點實驗室,河南 鄭州 450001;3.冷鏈食品加工與安全控制教育部重點實驗室(鄭州輕工業大學),河南 鄭州 450001 )

烏雞肉中富含蛋白質、B族維生素等多種營養成分,且膽固醇和脂肪含量低,常被用于滋補養身,備受消費者青睞。在現代畜牧業中,獸藥已被廣泛用于預防和治療疾病[1]。但隨著市場需求的不斷提升,獸藥濫用現象逐漸增多,長期服用獸藥殘留超標的食品會對人體造成毒性作用、過敏反應等潛在的健康風險[2]。為保證食品安全以及人體健康,我國農業農村部、國家衛生健康委員會及國家市場監督管理總局于 2019 年9月聯合發布《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留量》[3]。烏雞肉中基質復雜且潛在的獸藥種類繁多,因此,建立高效、簡便的獸藥多殘留檢測方法可以為食品安全提供技術保障及支持。

目前,常用的獸藥多殘留檢測方法有熒光傳感器法[4-7]、酶聯免疫法[8]、質譜法[9-11]等。其中,質譜法具有高通量和高靈敏的優勢,廣泛用于動物源性食品獸藥殘留檢測。液相色譜-質譜聯用技術兼具液相色譜的高分離能力和質譜的高通量、高靈敏特征,逐漸發展成為動物源性食品獸藥多殘留的主要確證方法。根據檢測需求,應用于獸藥分析的液相色譜-質譜聯用技術主要包括液相色譜-高分辨質譜法[12-13]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[14-17]。其中,LC-MS/MS法可用于靶向藥物定性和定量分析,具有靈敏度高和選擇性強等特點。盡管如此,利用液相色譜-質譜聯用技術分析獸藥多殘留仍需對樣品進行適當凈化,以進一步降低樣品基質對低殘留濃度獸藥的檢測干擾。

烏雞肉基質復雜,樣品前處理可在一定程度上削弱基質效應,提升檢測準確度和靈敏度。常用的樣品前處理方法包括液-液萃取[18]、分散液-液微萃取[19]、固相萃取[20-21]和QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe)方法等。其中,QuEChERS具有快速、簡單和高效的特點,廣泛用于食品、生物醫藥以及環境等領域[22-24]。發展QuEChERS技術的關鍵在于新型高效基質凈化材料的開發與應用,常規QuEChERS法多采用C18、PSA、GCB等微納米材料作為基質吸附劑,其基質分離過程多依賴于高速離心,耗時相對較長,是主要的限速步驟。近年來,磁性納米基質凈化材料被開發并成功用于各種動物源性食品基質的凈化過程[25-27],通過磁場輔助可在一定程度上提升基質分離過程的便捷性。然而,尺寸均一性、顆粒分散性等均是磁性納米凈化材料開發過程中的關鍵前提和注意事項[28-29]。

三聚氰胺海綿(MeS)具有高度交聯的彈性三維多孔網絡結構,性質穩定、吸附性好,通過簡單的物理擠壓即可去除溶液中的干擾基質,實現快速的基質分離過程。前期研究中,本課題組通過硅烷化反應制備了改性三聚氰胺海綿基質凈化材料,與超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術結合,成功用于雞蛋中獸藥多殘留的快速分析,基質凈化效果良好、操作簡單[30]。

本研究擬采用還原氧化石墨烯改性(r-GO)三聚氰胺海綿(r-GO@MeS)作為基質凈化材料,建立一種改良QuEChERS方法,結合UPLC-MS/MS技術快速檢測烏雞肉中獸藥殘留,以期為動物源性食品獸藥多殘留檢測提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀:美國Agilent公司產品,配有二元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱;Qtrap 5500質譜儀:美國Sciex公司產品,配有電噴霧離子源(ESI)和 MultiQuantTM3.0數據處理系統;Vortex-Genie2多功能旋渦混合器:美國Scientific Industries公司產品;3K15高速冷凍離心機:德國Sigma公司產品;0.22 μm有機微孔過濾膜針式過濾器:天津津騰實驗設備有限公司產品;ME204分析天平:瑞士MettlerToledo公司產品。

1.2 材料與試劑

磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類標準品,乙酸銨(AA)、甲酸(FA)、乙酸(HAc)、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB):上海安譜實驗科技股份有限公司產品;乙腈(ACN)和甲醇(MeOH):色譜級,美國Thermo Fisher Scientific公司產品;乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、L(+)-抗壞血酸(LAA):分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司產品;單層氧化石墨烯(GO):蘇州碳峰石墨科技有限公司產品;氯化鈉(NaCl)、無水硫酸鈉(Na2SO4)、無水硫酸鎂(MgSO4):分析純,天津市永大化學試劑有限公司產品;無水乙醇(EtOH):分析純,天津市富宇精細化工有限公司產品;超純水:由美國Millipore公司生產的超純水機制備。

1.3 r-GO@MeS的合成

根據水熱還原法制備還原氧化石墨烯改性三聚氰胺海綿[31]。稱量0.05 g GO,加入100 mL蒸餾水,超聲15 min,制備0.5 g/L GO分散液;然后稱量50 mg LAA,倒入GO分散液,再次超聲15 min;將裁剪好的圓柱形三聚氰胺海綿(直徑8 mm,厚度3 mm,約0.15 cm3)浸入上述溶液中,充分擠壓使分散液進入海綿,繼續超聲處理15 min后轉移至密封玻璃瓶,放入烘箱,95 ℃水熱反應3 h;反應完成后,將獲得的海綿單體分別用蒸餾水和乙醇洗滌;最后將洗滌過的單體放入烘箱中,40 ℃干燥24 h,得到r-GO@MeS。

1.4 樣品制備

將烏雞切割、去骨、絞碎,保鮮袋密封,-20 ℃儲存備用。精確稱取2.5 g烏雞肉樣品于50 mL離心管,分別加入2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液、10 mL 0.5%HAc-ACN,渦旋5 min;向離心管中分別加入2.0 g Na2SO4、0.5 g NaCl,再次渦旋5 min,在4 ℃以8 000 r/min離心5 min;取1 mL上清液于2.0 mL離心管中,備用。將上清液吸取到裝有5個r-GO@MeS的 2.5 mL注射筒中,動態吸打10次,然后經0.22 μm一次性針式過濾器過濾,上機待測。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);流動相:A相為含有0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的甲醇-水溶液(2∶98,V/V),B相為甲醇;梯度洗脫程序:0～2 min(0%B),2～10 min(0%～45%B),10～15 min(45%～98%B),15～17 min(98%B),17～17.1 min(98%～0%B),17.1～20.1 min(0%B);流速0.3 mL/min;進樣體積2 μL;柱溫35 ℃。

1.5.2質譜條件 ESI源,正離子模式,多重反應監測(MRM)模式。ESI源參數:霧化氣流速3.0 L/min,干燥氣流速10 L/min,加熱氣流速10 L/min,去溶劑氣溫度250 ℃,接口溫度300 ℃,加熱氣溫度400 ℃。使用MultiQuantTM3.0軟件處理實驗數據。

2 結果與討論

2.1 改良QuEChERS法的優化

2.1.1提取條件優化 采用以下4種提取條件對比和考察脫水劑種類和Na2EDTA添加量對獸藥回收率的影響:1) 提取劑(2.5 mL H2O和10 mL 1% HAc-ACN)/脫水劑(2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl);2) 提取劑(2.5 mL H2O和10 mL 1% HAc-ACN)/脫水劑(2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl);3) 提取劑(2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1% HAc-ACN)/脫水劑(2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl);4) 提取劑(2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1% HAc-ACN)/脫水劑(2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl)。

對以上4種條件下的獸藥回收率進行比較分析,結果示于圖1?？梢?使用無水MgSO4作為脫水劑的(2)和(4)組中,恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、奧比沙星(ORB)等7種喹諾酮類藥物的回收率低于60%,這可能是由于喹諾酮類獸藥與鎂離子發生螯合,導致提取液中獸藥回收率偏低;而(1)組和(3)組提取條件下的回收率分別為78.6%～117.2%和89.1%～119.8%。其中,在提取條件(1)下,柱晶白霉素(KIT)的回收率低于80%(78.6%);在提取條件(3)下,其回收率升至89.1%,這可能與添加Na2EDTA的金屬離子螯合作用相關。因此,選擇2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1%HAc-ACN作為提取劑,2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl作為脫水劑對待測樣品進行提取。

圖1 Na2EDTA和脫水劑對烏雞肉中獸藥回收率的影響Fig.1 Effect of Na2EDTA addition and dehydrating agents on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

此外,由于所考察的獸藥中存在兩性化合物,提取劑的酸堿性可能會對回收率產生影響?；诖?考察了不同含量HAc-ACN(乙酸占比分別為0%、0.5%、1%、3%、5%)對獸藥回收率的影響,結果示于圖2?？梢?乙腈作為提取劑時,OFL、麻保沙星(MAR)、氟羅沙星(FLE)、西諾沙星(CIN)的回收率較低,分別為56.1%、47.3%、38.0%、53.4%。隨著HAc含量增加,OFL、MAR、 FLE和CIN的回收率均增加至85%以上。除此之外,培氟沙星(PEF)的回收率隨HAc含量增加呈上升趨勢,而其他藥物的回收率沒有明顯提高。通過計算得到,當乙酸占比分別為0.5%、1%、3%、5%時,所監測藥物的總體平均回收率分別為96.7%、95.6%、95.2%、96.2%。當提取劑中乙酸占比為0.5%時,獸藥回收率相對較高;當提取劑中乙酸含量較高(3%、5%)時,烏雞肉樣品出現部分結塊現象。綜上,采用2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 0.5%HAc-ACN作為提取溶劑。

圖2 HAc添加對烏雞肉中獸藥回收率的影響Fig.2 Effect of HAc addition on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.1.2r-GO@MeS用量優化 樣品經提取后,其溶液中含有脂肪、蛋白質、色素等干擾基質,凈化劑的選擇及其用量對基質凈化效果有著重要影響。本實驗分別使用3、4、5、6、7個海綿對1 mL烏雞肉提取液進行基質凈化(即海綿體積與提取液體積比分別為0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 cm3/mL),并考察r-GO@MeS不同用量對獸藥回收率的影響(動態吸打5次),結果示于圖3?？梢?r-GO@MeS不同用量水平下,藥物的回收率分別為73.9%～107.3%、74.7%～118.8%、80.6%～105.9%、76.1%～106.3%、72.9%～113.0%。通過對比回收率分布,當選用0.75 cm3/mL r-GO@MeS凈化時,獸藥回收率較集中,且35種藥物回收率均處于80%～110%之間;當r-GO@MeS用量為0.45、0.60、0.90、1.05 cm3/mL時,分別有1種(KIT:73.9%)、1種(KIT:74.7%)、2種(PEF:79.3%、KIT:76.1%)、1種(KIT:72.9%)獸藥的回收率低于80%。此外,當改性海綿用量較少(0.45、0.60 cm3/mL)時,部分化合物的回收率逐漸降至73.9%或者增至118.8%,表現為基質干擾效應加強,這可能與基質吸附不充分有關;當改性海綿用量較高(0.90、1.05 cm3/mL)時,所檢測獸藥的回收率整體呈降低趨勢,這可能與過剩改性海綿與檢測藥物間的吸附作用有關?；诖?本研究通過陰性對照樣品基質提取液加標實驗,在0.75 cm3/mL料液比水平下考察改性海綿對藥物的吸附效應。結果表明,磺胺類藥物的回收率為95.3%～101.7%,喹諾酮和大環內酯類藥物的回收率均處于80.2%～92.7%,說明r-GO@MeS對磺胺類藥物基本無吸附,而對喹諾酮和大環內酯類藥物具有一定程度的弱吸附作用。綜上,藥物的回收率不僅與樣品基質的凈化效果有關,還與凈化材料之間的吸附作用有關。因此,選用0.75 cm3/mL r-GO@MeS進行實驗。

圖3 r-GO@MeS用量對烏雞肉中獸藥回收率的影響Fig.3 Effect of r-GO@MeS dosage on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.1.3凈化模式優化 r-GO@MeS的凈化模式可分為動態與靜態2種。動態凈化是通過反復抽推注射器栓塞實現提取液在海綿中不斷吸附與分離,從而達到凈化效果;靜態凈化是用注射器吸取提取液到r-GO@MeS中,通過調整靜置時間達到凈化效果。本研究通過控制吸打次數與靜置時間設置以下6組凈化條件:1) 動態吸打1次;2) 動態吸打5次;3) 動態吸打10次;4) 靜置1 min;5) 靜置5 min;6) 靜置10 min,結果示于圖4。對比實驗結果可知,獸藥回收率分別為72.9%～119.0%、74.3%～114.8%、76.1%～109.4%、64.9%～112.8%、68.6%～114.9%、61.9%～113.2%。在動態模式下,隨著吸打次數的增加,獸藥回收率更接近100%;且在動態吸打10次凈化時,35種獸藥的加標回收率均處于70%～110%之間,而動態吸打1次和5次時,分別有4種和5種獸藥的回收率大于110%。靜態模式下,當靜置時間從1 min增加到10 min時,回收率處于90%以下的獸藥數量增加,分別有31、29、24種獸藥的回收率處于90%～110%之間,其中分別有1種(KIT:63.9%)、3種(PEF:68.7%、CIN:88.9%、KIT:77.8%)和5種(ENR:84.9%、OFL:84.2%、PEF:62.0%、CIN:87.1%、KIT:79.4%)獸藥的回收率小于90%,這可能是由于靜置時間較長,部分待測殘留藥物不同程度地被r-GO@MeS吸附。通過對比,以動態吸打10次作為凈化條件時,35種獸藥的回收率全部處于70%～110%之間,而靜置1 min時,有31種獸藥的回收率在70%～110%之間,表明動態吸打10次的基質凈化效果更好,模式更優。因此,最優凈化條件為0.75 cm3/mL r-GO@MeS、動態吸打10次。

2.1.4與商品吸附材料對比 本實驗分別使用C18、PSA、GCB和r-GO@MeS對待測樣品進行凈化處理,其中,C18、PSA、GCB的用量均為25 g/L。通過對比獸藥回收率,比較r-GO@MeS與上述商品基質吸附材料的凈化效果,結果示于圖5。對比發現,經GCB凈化后,ENR、萘啶酸(NA)、氟甲喹(FLU)、PEF、噁喹酸(OXA)、CIN的回收率分別為48.0%、41.4%、56.3%、35.5%、36.6%、30.7%,均低于60%,且均為喹諾酮類獸藥,由此推測,GCB對喹諾酮類藥物具有一定的吸附作用。使用PSA、C18、r-GO@MeS處理后,獸藥的回收率分別為69.0%～116.2%、75.5%～114.7%、73.8%～112.9%,除KIT外,其余獸藥的回收率均處于80%～120%之間。從整體上看,使用r-GO@MeS凈化后的獸藥回收率更集中于100%,且有31種獸藥的回收率處于90%～110%之間,而PSA、C18和GCB處理組分別有28、30和28種獸藥的回收率處于90%～110%之間。經綜合分析,r-GO@MeS與其他3種商品化吸附材料具有同等甚至更優的基質凈化效果,在獸藥多殘留檢測領域有著較大的發展潛力。

圖5 不同吸附劑對烏雞肉中獸藥回收率的影響Fig.5 Effect of different purification adsorbents on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.2 r-GO@MeS材料表征

三聚氰胺海綿基底呈白色,經還原氧化石墨烯改性后,其顏色變成深黑色。使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察發現,改性前后其表面微觀形貌發生了顯著變化。MeS和r-GO@MeS均由纖維骨架相互連接而成,呈多孔網絡結構。但MeS表面光滑,無附著,示于圖6a、6b;r-GO@MeS的微觀結構中存在還原氧化石墨烯片層,示于圖6c、6d,并通過平鋪堆疊和延伸2種方式大量附著于骨架表面和邊緣。采用乙腈、甲醇等常用有機溶劑反復擠壓、浸泡,測試其溶液穩定性,結果表明,r-GO@MeS材料彈性良好,且未發現有石墨烯片層脫落的現象。

圖6 MeS(a, b)和r-GO@MeS(c, d)的掃描電鏡圖Fig.6 SEM spectra of MeS (a, b) and r-GO@MeS (c, d)

2.3 質譜條件優化

采用MRM模式對烏雞肉中的獸藥殘留進行定性、定量分析。首先,在Full scans模式下將各標準溶液依次注入質譜中,獲得相應的母離子;然后,母離子經碰撞誘導解離(CID)獲得碎片離子,選擇其中強度最高的2個子離子分別作為定量和定性離子。優化后,被測獸藥的MRM詳細參數列于表1。

表1 UPLC-MS/MS檢測烏雞肉中35種獸藥殘留的MRM參數Table 1 MRM parameters of 35 veterinary drug residues in black chicken by UPLC-MS/MS

2.4 方法確認

本研究考察了方法的選擇性、基質效應(matrix effect, ME)、準確性、精密度、線性關系、檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果列于表2。使用優化的提取與凈化方法處理陰性對照樣品,經UPLC-MS/MS檢測后未發現存在基質干擾峰;而經基質加標后,所檢測的35種獸藥均出現相應的色譜峰,表明該方法具有良好的選擇性。使用UPLC-MS/MS檢測樣品時,待測溶液中共存的干擾基質在電噴霧離子化過程中可能對目標化合物產生離子增強或抑制作用,稱為基質效應?；|效應的計算公式為:

(1)

式中,ka表示基質匹配曲線的斜率,kb表示溶劑校正曲線的斜率。當ME在±20%以內時,基質效應不顯著;當ME超過±20%時,存在明顯的基質增強或抑制作用。從表2可知,所有被檢測藥物的基質效應均處于-19.4%～19.8%之間,表明r-GO@MeS對烏雞肉樣品具有較好的基質凈化效果。

為考察定量檢測結果的準確性,分別在低、中、高(50、100、150 μg/kg)3個加標水平下進行定量分析,所監測獸藥的回收率分別為73.0%～114.5%、78.7%～112.6%、66.6%～118.8%,均處于60%～120%之間。相比之下,在高濃度加標水平下,磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、氟羅沙星、西諾沙星、交沙霉素、柱晶白霉素等獸藥的回收率降低,這可能與基質凈化材料的弱吸附作用有關。

通過35種獸藥的日內、日間重復性實驗考察方法的精密度,其分別不超過13.8%和14.6%,表明該方法具有良好的精密度,在烏雞肉獸藥多殘留分析中有著良好的適用性。

在5～200 μg/kg濃度范圍內,以待測樣品中獸藥濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,相關系數(R2)均大于0.998,表明該方法具有良好的線性關系。分別用3倍和10倍信噪比(S/N)確定LOD和LOQ,除磺胺胍(SGD)的LOD(6 μg/kg)與LOQ(15 μg/kg)偏高外,其余34種獸藥的LOD范圍為0.1～1.8 μg/kg,LOQ范圍為0.3～5 μg/kg,表明該方法的靈敏度較高,能夠對低于最大殘留限量的獸藥目標物進行準確分析。

2.5 實際樣品檢測

利用本方法對24個市售烏雞肉樣本中的35種獸藥進行檢測分析,僅在其中1份陽性樣品中檢測出磺胺二甲基嘧啶(SM2),殘留濃度低于定量限。

3 結論

本研究建立了一種基于r-GO@MeS的改良QuEChERS方法,結合UPLC-MS/MS測定烏雞肉中35種獸藥殘留,僅需簡單的“吸附-擠壓”動態循環過程即可實現對復雜基質的高效快速凈化。方法學考察結果表明,該方法的檢出限低、靈敏度高、線性關系好,具有良好的準確性和重現性。此外,r-GO@MeS凈化材料的制備過程簡單、成本低,具有與C18、PSA、GCB商品化吸附材料同等甚至更優的基質凈化效果。作為一種新型的基質凈化材料,r-GO@MeS在復雜基質凈化領域具有良好的發展前景和應用潛力。