密胺制品水解產物的液相色譜-質譜分析及遷移研究

熊小婷,饒 璞,陳意光,郭燕華,宋梓鋒,李慧勇,黃曉鋼,何國山

(廣州質量監督檢測研究院,國家包裝產品質量監督檢驗中心(廣州),廣東 廣州 511447)

三聚氰胺-甲醛(簡稱“密胺”)餐具具有輕巧、美觀、不易碎裂等優點,在餐飲和兒童用品行業深受歡迎,2021年密胺餐具全球市場規模已達到7.56億美元[1-4]。合格的密胺餐具在常溫非酸性條件下較穩定,但是在酸性、高溫長期使用等苛刻條件下,三聚氰胺-甲醛樹脂可發生水解,釋放出甲醛、三聚氰胺及其他化學成分,存在危害人體健康的風險[5-8]。

目前,關于密胺餐具中三聚氰胺、三聚氰胺酸轉化產物的遷移量檢測方法和遷移規律的研究已有報道,主要采用高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯四極桿質譜法[9-10],且均為特定目標物的靶向檢測。超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF MS)及其配套軟件、數據庫,可以非靶向地獲取和分析樣品中大量成分的精確分子質量、碎片離子、色譜保留時間、色譜峰形、相對含量等信息[11],廣泛用于食品非法添加、產品鑒別、食品接觸材料風險物質篩查等方面[12-14],但尚未見非靶向篩查密胺制品水解產物及其遷移情況的報道。

本工作擬采用UPLC-QTOF MS結合三聚氰胺-甲醛樹脂的合成原理、化學結構碎片分析軟件,研究食品接觸密胺制品在酸性溶液中的高溫水解產物,以及水解產物在密胺餐具酸性遷移液中的遷移情況,希望為密胺制品毒理學研究和食品安全風險監測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Aquity UPLC H-Class Plus超高效液相色譜儀:美國Waters公司產品;X500B四極桿飛行時間質譜儀:美國SCIEX公司產品,配有電噴霧離子源(ESI)及SCIEX OS集成軟件(3.0.0.3339版);Milli-Q IQ7000超純水器:美國Millipore公司產品;SECURA225D-1CN、BSA224S分析天平:德國Sartorius公司產品;25 mL水熱反應釜:內罐材質為聚四氟乙烯。

1.2 主要材料與試劑

三聚氰胺標準品(純度99.8%)、甲酸(色譜純):上海安譜實驗科技公司產品;甲醇、乙腈(色譜純):上海麥克林生化科技公司產品;濃鹽酸(優級純)、乙酸(分析純)、乙酸銨(分析純):廣州化學試劑廠產品;實驗用水為超純水。

密胺樹脂:廣東順德恒業公司產品;16批次密胺餐具:購自廣州市場。

1.3 溶液配制

準確稱取5 mg三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制500 mg/L標準儲備溶液,于-20 ℃下保存。

移取0.2 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制10 mg/L標準中間溶液,于4 ℃下保存。

移取0.2 mL標準中間液于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制200 μg/L標準中間溶液1,于4 ℃下保存。

分別移取1、0.2 mL標準中間液,2.5、0.5、0.25 mL標準中間液1于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制標準工作液,現配現用。

鹽酸溶液:移取10 mL濃鹽酸于1 L容量瓶中,用水定容、混勻。

5 mmol/L乙酸銨:稱取0.385 g乙酸銨于燒杯中,用1 L水溶解、混勻,過濾后使用。

4%乙酸溶液(體積分數):量取20.0 mL乙酸,加入480 mL水,混勻。

1.4 樣品處理

密胺制品:稱取5.00 g密胺樹脂于內襯錫紙的50 mL燒杯中,用不銹鋼片壓實,將錫紙包裹好。將燒杯置于130 ℃烘箱中,放置1 h,取出樣品冷卻至室溫。該樣品為自制密胺制品。

用于水解的密胺制品粉末的制備:用電鉆分別鉆取自制密胺制品及16批次密胺餐具,獲得密胺制品粉末。

密胺制品粉末水解溶液的制備:分別稱取0.06 g密胺制品粉末于2 mL塑料離心管中,用4.5 mL鹽酸溶液分3次洗滌,棄去洗液;再用4.5 mL鹽酸溶液將粉末全部轉移至25 mL水熱反應釜聚四氟乙烯內罐中,封罐;將水熱反應釜置于110 ℃烘箱中,放置(60±5) min;取出,冷卻至室溫,開罐,將罐中的粉末和液體全部轉移至100 mL比色管中,用水洗滌罐內壁,將洗滌液轉移至同一比色管中,用水定容到刻度,渦旋混勻;取約1 mL溶液過聚醚砜濾膜,待測。

密胺餐具遷移實驗:對16批次密胺餐具中的10批次進行遷移實驗,每批次樣品均按采用4%(體積分數)乙酸在100 ℃下浸泡0.5 h和4%(體積分數)乙酸在40 ℃下浸泡24 h這2個條件進行實驗?？紤]到樣品均為可重復使用,參考遷移試驗通則GB31604.1—2015《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》中的相關要求,本研究用于測試的樣品溶液均為第3次遷移液,即將樣品用新鮮模擬液按浸泡條件重復浸泡3次,取第3次浸泡液用于研究。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 月旭Ultimate HILIC amide色譜柱(100 mm×2.1 mm×5 μm);流動相:5 mmol/L乙酸銨(A)-乙腈(B);梯度洗脫:0～1.0 min(10%A),1.0～6.0 min(10%～30%A),6.0～10.0 min(30%A),10.0～11.0 min(30%～10%A),11.0～15.5 min(10%A);流速0.40 mL/min;柱溫為室溫;進樣量2 μL。

1.5.2質譜條件 電噴霧離子源正離子(ESI+)模式,信息相關掃描方式(IDA),噴霧電壓3 500 V,噴霧氣壓強414 kPa,輔助加熱氣壓強414 kPa,氣簾氣壓強276 kPa,溫度650 ℃,碰撞氣壓強48 kPa。TOF MS條件:質量掃描范圍m/z50～1 000,采集時間0.3 s, 去簇電壓(DP)60 V,碰撞能10 V。TOF MS/MS條件:質量掃描范圍m/z50～1 000,采集時間0.1 s,去簇電壓60 V,碰撞能20 V。

采用SCIEX OS軟件的Analytical模塊自動提取色譜峰,Explorer模塊手動提取色譜峰,質量提取窗口0.04 u。Explorer模塊的“Formula Finder”功能用于分子式檢索,“Fragments pane”功能用于推測離子碎片的化學結構以驗證解析結果。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的選擇

密胺制品的預期水解產物主要為含氨基、羥基的強極性成分,采用常見的C18、C8反相色譜柱會導致水解產物在色譜柱上沒有保留,均在色譜柱死時間附近出峰,無法通過保留時間、色譜峰形等條件分析化學成分,且各成分及其裂解質譜峰可能相互干擾,從而導致錯誤判斷。參考文獻[15],采用氨基柱(親水性柱、HILIC)進行色譜分離,以增強水解成分的色譜保留;在水相中添加乙酸銨,以提高方法的穩定性,改善色譜峰形。經流動相梯度洗脫條件優化后,三聚氰胺的保留良好,保留時間為2.3 min(在0.4 mL/min流速下,色譜柱的死時間約為0.6 min),且洗脫程序在較強的洗脫條件下(30%水相)保持4 min,以使保留較強的成分被洗脫,獲得盡量多的成分信息。

根據儀器的溶劑流速-氣體流速-氣體溫度推薦參數(當化合物性質穩定時,輕微改變推薦離子源參數不會對化合物的響應產生顯著影響,在非靶向篩查時,通常采用推薦離子源參數)設置質譜離子源條件。采用單去簇電壓(DP spread=0)、單碰撞能(CE spread=0)參數設置,降低1次采集循環采集的譜圖數,增加單張質譜圖的采集時間,提高質量穩定性。

參考文獻[16-18],采用鹽酸這一較為常見的氨基樹脂水解促進劑,在可預期的最嚴苛條件下對樣品進行水解,最終水解液中仍存在大量粉末,只有少部分樣品發生水解,但已經能夠反映產品在極端嚴苛條件下的水解情況。

2.2 質量誤差和三聚氰胺工作曲線

由于密胺制品的預期水解產物為含三聚氰胺結構的化學成分,因此采用三聚氰胺作為數據采集質量穩定性的質控物質。在1.5節條件下,序列中三聚氰胺準分子離子峰質荷比測量值與理論值的示值相對誤差均小于5×10-6。

2.3 水解溶液中化合物的鑒定

根據所提取色譜峰的精確相對分子質量推測分子式,根據密胺制品的合成原理推測化學結構[3,9,19],再用SCIEX OS Fragment pane(FP)功能結合化學成分的二級質譜碎片驗證化學結構的合理性。

由于三聚氰胺環結構是相對穩定的共軛結構,三聚氰胺-甲醛樹脂固化后主要形成以>N—CH2—N<和>N—CH2—O—CH2—N<橋聯鍵(還可能有—NH—橋聯鍵)連接的三聚氰胺環[20-21]。理論上,酸水解反應會發生在橋聯鍵上,產生三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛衍生物,三聚氰胺-甲醛衍生物可進一步水解產生三聚氰胺,三聚氰胺上的胺基可生成羥基取代衍生物。三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片離子有m/z127.07、139.07、151.07、163.07、169.08、181.08、277.14、289.14等,示于圖1。當水解成分中含有這些特征碎片離子時,可推斷為三聚氰胺-甲醛寡聚物。通過水解成分分子式中的氮原子數可以推斷寡聚物中的三聚氰胺環數(每個三聚氰胺環含6個氮原子)。分子式中的碳原子數-3×三聚氰胺環數=結構中的亞甲基數,以此推斷三聚氰胺-甲醛寡聚物可能的化學結構。部分檢出成分可能的化學結構示于圖2。如,成分8、9為含有2個三聚氰胺環、2個亞甲基和1個氧原子的同分異構體;成分8存在m/z277.14[M+H-H2O]+碎片離子,可見結構中存在1個羥甲基;成分9只有m/z127.07、139.07碎片離子,結構中不存在羥甲基,而是2個三聚氰胺環通過醚鍵相連。

注:圖中質子加和位置和正電荷所在位置未經驗證圖1 三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片離子Fig.1 Characteristic fragment ions of melamine, melamine-formaldehyde oligomer and its fromaldehyde derivatives

圖2 部分檢出成分可能的化學結構Fig.2 Possible chemical structures of some components detected in hydrolysis solutions of melamine-formaldehyde products

三聚氰胺的特征碎片離子有m/z85.05[M+H-42]、68.02[M+H-59]、60.06、110.05[M+H-17]。成分41的準分子離子為m/z112.061[C3H5N5+H]+,特征碎片離子為m/z70.04[M+H-42]和68.02,與三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片離子,且分子式比三聚氰胺少NH,推測為2,4-二氨基-1,3,5-三嗪。成分42的分子式C3H5N5O及特征碎片離子為m/z86.04[M+H-42]、69.01[M+H-59],與文獻[9,15]相同,推測為三聚氰酸二酰胺。成分43的特征碎片離子有m/z85.05[M+H-56]、99.07[M+H-42]、82.04[M+H-59]、60.06,與三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片離子,且分子式比三聚氰胺增加CH2,推測為甲基三聚氰胺。成分44的特征碎片離子有m/z100.05[M+H-42]、86.04[M+H-56]、83.02[M+H-59],與成分42具有相似的裂解方式,且分子式增加CH2。成分45的特征碎片離子有m/z127.07[M+H-43]、153.05[M+H-17]、85.05、110.05,且分子式比三聚氰胺多CHNO。成分46的特征碎片離子有m/z153.09[M+H-18]、141.09[M+H-30]、124.06[M+H-47],與成分2具有相似的裂解方式,且分子式比成分2多CH2。成分47的分子式由2個三聚氰胺環脫去1個NH3,表明密胺樹脂固化后存在由氮原子直接橋聯2個三聚氰胺環,主要的碎片離子并未有單一的三聚氰胺環,通過氮原子直接橋聯的2個三聚氰胺環結合得更緊密。成分48的分子式為C22H44N6O9,準分子離子峰為[M+NH4]+,且存在較弱的m/z89.06、133.09、177.11、221.14、265.16等典型的聚乙二醇碎片離子。成分49～53與成分48類似,成分48～53分子式依次增加C2H4O。成分55的分子式及特征碎片離子與文獻[22]報道一致,推測為三乙醇胺。成分56的分子式為C8H19NO4,比三乙醇胺增加C2H4O,特征碎片離子為m/z150.11[M+H-C2H4O]、132.10[M+H-C2H4O-H2O]、 114.09、88.08、70.07,與三乙醇胺相同,推測為三乙醇胺單乙二醇醚。成分57的分子式為C10H23NO5,比三乙醇胺增加2個C2H4O,特征碎片離子為m/z220.155[M+H-H2O]、176.13[M+H-H2O-C2H4O]、132.10、114.09,推測為三乙醇胺雙乙二醇醚。成分54的分子式為C5H13NO2,特征碎片離子為m/z102[M-H2O]、58[M-H2O-C2H4O],與三乙醇胺類似,推測為N-甲基二乙醇胺。成分58～61未檢測到明顯的子離子碎片,推測母離子為[M+Na]+,各成分分子式依次增加C5H8O4(精確相對分子質量132.042 u),且相對分子質量最小的成分為C10H18O9,推測均為C5H10O5的脫水縮合物,屬于多糖醇,具體結構未明確,其提取離子色譜圖示于圖3。

圖3 成分58～61的提取離子色譜圖Fig.3 Extraction ion chromatogram of component 58-61

在17份密胺制品的水解溶液中發現61種化學成分,包括1種三聚氰胺(成分1),5種三聚氰胺-甲醛衍生物(成分2～6),33種三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物(成分8～14、16～22、24～31、33～39),7種三聚氰胺結構類似物(成分41～47),6種三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物(成分48～53),4種乙醇胺類(成分54～57),4種多糖醇類(成分58～61)。各成分的精確分子質量、分子式、二級碎片離子、保留時間等信息列于表1。

表1中,碎片離子采用相對豐度由高到低排列,大部分碎片離子可通過FP提供的裂解方式解釋。理論上,成分3應為三聚氰胺的同一氮原子二羥甲基衍生物,但FP功能無法計算解釋m/z139.073碎片離子。成分3和4的提取離子色譜圖示于圖4,質譜圖示于圖5。含羥甲基的三聚氰胺甲醛寡聚物可以同時存在[M+H]+和[M+H-H2O]+準分子離子峰,且可能[M+H-H2O]+響應更高,可檢測到的三聚氰胺-甲醛低聚物最多含有6個三聚氰胺環。

圖4 成分3和4的提取離子色譜圖Fig.4 Extraction ion chromatogram of component 3 and 4

圖5 成分3(a)和4(b)的二級質譜圖Fig.5 Mass spectra of fragment ions of component 3 (a) and 4 (b)

在一定條件下,三聚氰胺的胺基會逐步被羥基取代,生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸[9]。在本實驗條件下,只檢出三聚氰酸二酰胺(成分42)。

成分43、45、46是三聚氰胺的甲基取代衍生物及其酸解產物和羥甲基化產物,目前未見密胺制品中存在該類化合物或者以三聚氰胺的甲基取代衍生物為起始物質合成密胺-甲醛樹脂的報道。GB 9685—2016《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》未列入三聚氰胺甲基衍生物,該類成分的來源有待進一步研究。

成分48～53為三聚氰胺的聚乙二醇衍生物,推測為密胺樹脂中添加了聚乙二醇[3-4],且聚乙二醇可與羥甲基三聚氰胺成醚。

成分54～57為三乙醇胺及其相關化合物。三乙醇胺是密胺樹脂合成添加劑之一,主要用于調節體系酸堿性[18]。

2.4 密胺餐具遷移液測試結果

10批次密胺餐具的遷移測試結果列于表2。除三聚氰胺及表2中的8種成分(1種三聚氰胺-甲醛衍生物、1種三聚氰胺-甲醛寡聚物、4種三聚氰胺結構類似物、2種乙醇胺類)外,其他成分均未檢出。大部分批次樣品在高溫(100 ℃)條件下的檢出量高于長時間(24 h)條件,同一化學成分在不同檢出批次的檢出量差別可達10倍以上。

表2 密胺餐具遷移液中測得的水解成分Table 2 Hydrolyzate detected in migration solution from 10 melamine-formaldehyde tableware samples

2.5 水解成分的安全性

三乙醇胺在多種食品接觸材料中的特定遷移限量為0.05 mg/kg[22],重復攝入三乙醇胺會對生命體產生肝、腎損傷。在有機小分子生物活性數據庫網站(Pub Chem,網址:https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Toxtree平臺(網址:http:∥toxtree.sf.net/predict)檢索和預測成分2、7、41、42、43、45毒性。Pub Chem數據庫可檢索到:成分42能夠導致視網膜退化,成分43小鼠腹腔注射半數致死量為270 mg/kg,成分45存在急性毒性(Acute Tox. 4)、皮膚刺激(Skin Irrit. 2)和眼刺激(Eye Irrit. 2A)的危害,其他成分尚未有毒性數據。Toxtree平臺無法對上述6種成分進行分類和毒性預測。

Toxtree無法預測三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的毒性數據,但相關成分在胃酸條件下均可進一步水解產生甲醛和三聚氰胺,其毒性不可忽略。

3 結論

本研究在密胺制品酸性高溫水解溶液中檢出61種成分,包括三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺結構類似物、三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物、乙醇胺類、多糖醇類等。部分成分可在密胺餐具的酸性食品模擬物中遷出,且不同樣品的檢出量存在較大差異。這些可遷出成分存在潛在的食品安全風險,有待進一步研究。