應用蛋白組學技術研究殼寡糖對水稻幼苗抗寒性能的誘導機理

于宇璇,李倞霆,張晴晴,孫 珍,唐文竹

(大連工業大學生物學院,遼寧 大連 116034)

水稻作為一種單子葉植物,是熱帶和亞熱帶地區重要的糧食作物,對低溫有較高的敏感性。低溫是影響水稻生長發育的重要環境因素之一,會引發眾多生理反應,如膜僵化、營養吸收抑制、光合速率降低、生長抑制[1]、同時還會致使脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等激素水平的短暫增加[2]、膜脂組成的變化[3]、可溶性糖和脯氨酸等滲透壓物質的積累[4-6]、抗氧化劑的生成[7]和葉綠素降解[8],嚴重時甚至會導致秧苗腐爛[9]。隨著全球異常氣候的增加,低溫脅迫頻繁發生,其影響范圍正在逐漸擴大[10]。

殼寡糖作為一種重要的生物活性分子,具有抗菌、抗氧化、降低膽固醇和免疫調節等作用[11]。蛋白質的結構和功能相互關聯,將殼寡糖與蛋白質組學技術相結合,可以更全面地了解蛋白質的結構和功能,揭示其在生物體內的作用機制。

有研究表明[12-13],殼寡糖不僅可以在植物中誘導其對細菌病原體的抗性,還可以促進植物生長,誘導植物對非生物脅迫的各種生理反應。因此,近年來殼寡糖在農業上的應用受到更多關注[14-16]。蛋白質組學借助二維電泳、質譜、色譜等多種技術,探索并發現生物體內產生不同生理特征的原因。如,孫玉明等[19]采用高效液相色譜-高分辨質譜法鑒定拉薩大黃化學成分,不僅提高了拉薩大黃復雜基質中微量化合物的鑒定效率,同時實現了對拉薩大黃提取物中不同類型化合物的分析鑒別;馬悅等[20]利用高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法分析桑葚提取物中黃酮類和多酚類成分,鑒定出蘆丁、異槲皮素等多種化合物,為桑葚的藥用、食用和合理開發提供了化學基礎。蛋白質組學的意義在于分析生命體中所有表達蛋白質的組成及動態變化,包括蛋白質的定性和定量表達,蛋白與蛋白之間或蛋白與其他物質之間的反應,蛋白質在細胞各處的作用等。

本實驗選取明恢63水稻作為研究對象,通過模擬水稻幼苗從正常生長到遭遇低溫再到復性的全過程,測定水稻幼苗對應時期的生理生化指標,并采用非標記定量技術對水稻幼苗的差異蛋白進行鑒定分析,通過基因本體(GO, gene ontology)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫的富集分析,研究光合作用及淀粉和蔗糖的代謝通路,從蛋白的角度討論殼寡糖與水稻抗寒性之間的關聯,并尋找與抗寒有關聯的通路,旨為研發新型生物農藥提供思路和實驗方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Q ExactiveTM組合型四極桿Orbitrap質譜儀:美國賽默飛世爾科技公司產品;Ultimate 3000 RSLC nano System液相系統:美國戴安公司產品;GZP-450s程控光照培養箱:上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.2 主要材料與試劑

明恢63水稻(秈型常規水稻)、醋酸殼寡糖(COS):由大連工業大學微生物資源與生物催化實驗室提供;霍格蘭通用營養液、次氯酸鈉溶液、醋酸殼寡糖、丙酮、碳酸鈣、石英砂、蔗糖、蒽酮、乙酸乙酯、濃硫酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、連二亞硫酸鈉、紅四氮唑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、茚三酮、乙醇、氰化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、亮氨酸、甲硫氨酸溶液、氮藍四唑溶液、核黃素、EDTA-Na2、H2O2、愈創木酚(除霍格蘭通用營養液外,其余均為化學純,由大連工業大學微生物資源與生物催化實驗室提供)。

三羥甲基氨基甲烷(Tris):中國生物工程有限公司產品;鹽酸、三氯乙酸(TCA)、丙酮:均為分析純,天津市凱信化學工業有限公司產品;二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶(trypsin):美國Sigma-Aldrich公司產品;SteadyPure植物RNA提取試劑盒:艾科瑞生物公司產品;PrimeScriptRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒:寶日醫生物技術有限公司產品;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光染料:諾唯贊公司產品。

1.3 水稻生長條件和表型分析

取適量種子,用3%次氯酸鈉溶液消毒,再用去離子水清洗,然后分別用去離子水和0.5%殼寡糖浸泡24 h。將種子(約140 粒)平鋪在網格盤上,向育苗盤內加入水,溫度28 ℃,濕度75%,覆蓋育苗紙,避光發芽。3天后發芽,去掉育苗紙,將盤內去離子水換成霍格蘭通用營養液。培養條件為:溫度28 ℃,12 h光照,12 h黑暗,濕度75%。水稻生長到一葉期時開始噴灑0.5%殼寡糖,噴灑頻率為每周2次?？瞻捉M噴灑等體積的去離子水,成長到三葉期時取樣,該組為冷處理前組。同時,在相同的光暗周期和相對濕度下,以15 ℃低溫處理模擬5天,恢復至28 ℃培養7 天,殼寡糖噴灑頻率為每周2次,若以低溫處理時刻為0時,即取樣時間為0時,低溫處理7天,復性7天,同時,在相同的光暗周期和相對濕度下,其余水稻幼苗繼續在植物恒溫光照培養箱中培養,將培養溫度降低至15 ℃,持續5天,模擬冷應激處理,然后收集部分樣品,該組為冷處理組。將其余幼苗的生長溫度恢復到28 ℃培養7天,即進行復性,并繼續收集部分樣品,該組為復性組。取樣后立即液氮速凍,放入-80 ℃冰箱,以備后續試驗。隨機測定30株水稻幼苗在取樣時間點產生明顯的表型,參數包括空白和實驗組水稻幼苗的根長(每株)、葉長(每株)、株高(每株)、鮮重(10株為1個單位)、干重(10株為1個單位),以此評估低溫對水稻生長的影響。

1.4 水稻的生化特性

取水稻幼苗在每個取樣時間點的0.2 g水稻葉片(每組實驗重復3次),用80%丙酮提取葉綠素,測定645、663 nm波長下的吸光值,并計算葉綠素含量,使用蒽酮比色法測量可溶性糖含量[21],參考文獻[21]方法測量丙二醛(MDA)含量。用紅四氮唑(TTC)測定水稻幼苗根系活力,測定485 nm波長下的吸光值,并計算根系活力,使用水和茚三酮方法提取水稻葉片總氨基酸含量[23],NBT方法測量超氧化物歧化酶(SOD)[24],參考文獻[25]方法測量過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)。

1.5 蛋白質的提取

稱取1 g水稻葉片,剪碎放入預冷的研缽中,加入10%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),在液氮中充分研磨至粉末狀。加入8 mol/L尿素、10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶解緩沖液,在冰上超聲處理30 min,以10 000 r/min離心20 min,棄去廢液,將上清液轉移至新試管中,再加入20 mL含有10%TCA、冷丙酮、10 mmol/L DTT的混合液,-20 ℃過夜沉淀,在4 ℃下以10 000 r/min離心20 min,并丟棄上清液;向試管中加入5 mL冷丙酮、10 mmol/L DTT,-20 ℃下靜置4 h,在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min,并丟棄上清液;重復此步驟直至上清液無色,然后在室內風干,得到水稻樣品總蛋白。

1.6 蛋白質的消化

取1 mg蛋白水溶液,加入100 mmol/L DTT,使DTT終濃度為20 mmol/L;在37 ℃下溫育2 h,加入100 mmol/L IAA封閉巰基,使IAA終濃度為20 mmol/L,避光反應40 min;用10 mmol/L Tris將溶液稀釋至1 mol/L,按照質量比1∶30加入1 g/L胰蛋白酶,37 ℃水浴下過夜酶解。樣品酶解后,通過C18固相微萃取柱脫鹽并蒸干,將蒸干的肽段復溶于50 μL 0.1%甲酸水溶液中,待質譜分析。

1.7 實驗條件

1.7.1色譜條件 預柱:C18PepMap100(5 μm,100 ?);分析柱:Acclaim PepMapTMRSLC(75 μm×15 cm×3 μm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸水溶液和80%乙腈;流速0.3 μL/min;柱溫45 ℃;進樣量1 μL;線性洗脫程序:0～10 min(4%B),10～13 min(4%～10%B),13～90 min(10%～35%B),90～114 min(35%～55%B),114～115 min(55%～95%B),115～122 min(95%B),122～123.5 min(95%～4%B),123.5～140 min(4%B)。

1.7.2質譜條件 使用納升電噴霧(Nano ESI)進行離子化,Q ExactiveTM組合型四極桿Orbitrap質譜儀分析。正離子模式,Full MS/dd-MS2掃描方式。一級質譜條件:Orbitrap分辨率70 000,自動增益控制(AGC)3×106,最大注入時間100 ms,質量掃描范圍m/z350～1 800。二級質譜條件:Orbitrap分辨率17 500,AGC 1×105,最大注入時間110 ms,母離子個數15,碰撞能量27%。

1.7.3數據檢索條件 質譜輸出的原始RAW文件數據采用Proteome Discoverer(2.2.0.388)軟件進行搜庫。使用的數據庫為水稻總數據庫(Oryza sativa,1 303 332個序列),來源于Uniprot。胰蛋白酶為唯一裂解酶,最多有2個漏切位點。前體離子的質量偏差為1×10-5,碎片離子的質量偏差允許±0.02 u。使用非標記定量蛋白組學(label-free quantitative, LFQ)對得到的數據結果進行分析。

1.8 非標記定量蛋白組學分析

為了使結果更具統計學意義,用標準差與均值的比值(CV)<20%對LFQ結果進行篩選,得到穩定表達的蛋白質。本實驗選擇低溫脅迫/正常生長、復性/正常生長、復性/低溫脅迫3種方式研究存在的差異表達蛋白,其中,相對變化倍數≥1.2(CV<20%)為上調蛋白,相對變化倍數≤0.8(CV<20%)為下調蛋白。

1.9 GO富集分析、功能注釋及通路分析

GO富集分析(http:∥geneontology.org)將得到的差異表達蛋白按照生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)3種類別進行分析注釋。利用在線分析平臺KAAS(https:∥www.genome.jp/tools/kaas/)進行差異蛋白代謝通路分析。

1.10 實時熒光定量(RT-qPCR)分析

使用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取明恢63水稻幼苗的總RNA,PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒對明恢63水稻幼苗總RNA進行反轉錄,合成cDNA。

用于RT-qPCR的水稻基因核苷酸序列下載于國家水稻數據中心(https:∥www.ricedata.cn/),使用在線分析平臺Integrated DNA Technologies(https:∥sg.idtdna.com/pages)進行qPCR引物設計,引物列表詳見附表1(請登錄《質譜學報》官網http:∥www.jcmss.com.cn下載,以下同)。使用Light Cycler/Light Cycler480 Real Time PCR儀對基因進行RT-qPCR,以GAPDH基因作為內源性qPCR參考,反應體系列于附表2,計算各基因的相對表達量。

表2 明恢63水稻幼苗蛋白質鑒定數目Table 2 Numbers of proteins in rice seedlings of Minghui 63

1.11 統計分析

使用統計軟件SPSS(版本25.0)和Microsoft Excel(版本2007)分析所有數據(空白組與實驗組在p<0.05和p<0.01水平上的差異)。

2 結果與討論

2.1 殼寡糖對水稻幼苗抗寒的影響

2.1.1殼寡糖對水稻幼苗生理指標的影響

明恢63水稻幼苗植株整體較矮、莖粗、葉寬,示于圖1。低溫處理5天后,空白組水稻幼苗葉片邊緣發生蜷曲,這是植物遇冷的表現,復性7天后,空白組水稻莖變細,第3片葉變黃,發生蜷曲的葉片沒有得到舒展。而實驗組幼苗在遇到低溫后,仍挺拔生長且莖粗、葉寬,水稻幼苗抵御低溫脅迫的能力較強。明恢63水稻幼苗的表型參數列于表1。與空白組相比,實驗組水稻復性時根長增加了6.88%,葉長增加了9.62%,葉寬顯著增加;此外,水稻幼苗葉片鮮重、葉片干重、莖鮮重、莖干重、根鮮重、根干重分別增加了66.39%、80%、109.76%、213.64%、84.07%、61.18%。

注:a.d.正常生長;b.e.低溫脅迫;c.f.復性圖1 明恢63水稻幼苗生長情況Fig.1 Growth of rice seedlings of Minghui 63

2.1.2殼寡糖對水稻幼苗生化指標的影響

為了闡明殼寡糖處理后導致冷脅迫耐受性的可能機制,分析了與冷脅迫相關的生理變化,如葉綠素含量,可溶性糖含量,丙二醛含量,根系活力,總氨基酸含量以及SOD、POD、CAT 3種主要抗氧化酶的活性變化,示于圖2。結果表明,實驗組幼苗在遭遇低溫后,抵御低溫脅迫的能力較強;與空白組相比,實驗組幼苗的葉綠素含量提高了近1倍、可溶性糖含量增加64.79%、總氨基酸含量增加90.13%,可溶性糖和氨基酸的積累可以抵消產生的滲透脅迫;丙二醛含量下降0.2 mg,根系活力提高1倍多,SOD、POD、CAT活性分別提高13.9%、57.5%、48.66%。殼寡糖處理后的水稻幼苗抵御寒冷相關的酶活性增強,可以顯著提高抵御冷脅迫的能力。

注:a.葉綠素含量;b.可溶性糖含量;c.丙二醛含量;d.根系活力;e.總氨基酸含量;f.SOD活性;g.POD活性;h.CAT活性;所有數據均為平均值±標準誤差(SE);*表示與空白組有統計學顯著差異(n=3,*p<0.05,**p<0.01)圖2 明恢63水稻幼苗生化指標Fig.2 Biochemical indicators of rice seedlings of Minghui 63

2.2 非標記定量蛋白組學結果分析

本實驗檢測了明恢63水稻幼苗、空白與實驗組、3個時間節點(正常情況下生長、低溫脅迫、復性),共計6組不同樣品,每組樣品檢測3次,詳細信息列于表2?？梢园l現,加入殼寡糖的實驗組蛋白鑒定數大于空白組,可能是殼寡糖增加了蛋白表達量,使一些低表達蛋白容易鑒定到,使用LFQ方法對得到的樣品數據結果進行定量蛋白組學分析。

對得到的數據進行初步篩選,重復測定結果中同一蛋白定量結果的CV值<20%,即得到穩定存在蛋白(SPs);在穩定存在蛋白中尋找差異表達蛋白(DEPs),相對變化倍數≥1.2(CV<20%)為上調蛋白(UP),相對變化倍數≤0.8(CV<20%)為下調蛋白(DOWN),詳細信息列于表3。其中,實驗組明恢63水稻低溫脅迫/正常生長(C/N)有1 120個DEPs,其中UP為881,DOWN為239;復性/正常生長(R/N)有1 148個DEPs,其中UP為293,DOWN為855;復性/低溫脅迫(R/C)有892個DEPs,其中UP為481,DOWN為441?？梢园l現,在C/N中UP居多,而在R/N中DOWN居多,表明低溫脅迫引起了水稻內部蛋白表達量的大幅變化。

表3 明恢63水稻幼苗穩定蛋白、差異表達蛋白、上調蛋白、下調蛋白數目Table 3 Numbers of stable proteins, differentially expressed proteins, up-regulated proteins, and down-regulated proteins in rice seedlings of Minghui 63

明恢63水稻幼苗差異表達蛋白韋恩圖示于圖3。其中,空白組水稻幼苗3組方式中均有差異的蛋白為412個,C/N與R/N之間有差異的蛋白為561個,C/N與R/C之間有差異的蛋白為563個,R/C與R/N之間有差異的蛋白為537個;實驗組水稻幼苗3組方式中均有差異的蛋白為471個,C/N與R/N之間有差異的蛋白為595個,C/N與R/C之間有差異的蛋白為706個,R/C與R/N之間有差異的蛋白為603個。與空白組相比,實驗組在R/C與R/N階段的蛋白數目高于空白組,表明加入殼寡糖后水稻差異表達蛋白的數目更多,實驗組水稻幼苗中有更多的蛋白來抵御脅迫,這對水稻生長是非常重要的。

注:a.空白組;b.實驗組圖3 明恢63水稻幼苗差異表達蛋白韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of differentially expressed proteins in rice seedlings of Minghui 63

2.3 殼寡糖對低溫脅迫下水稻幼苗差異蛋白GO注釋分析

為了進一步確定DEPs的功能,本實驗進行了GO注釋分析,如生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF),詳見附錄2。生物過程注釋中前15個條目包括:細胞生物合成過程、細胞芳香族化合物代謝過程、細胞成分組織、細胞氮化合物代謝過程、雜環代謝過程、大分子代謝過程、多細胞生物發育、有機酸代謝過程、有機環狀化合物代謝過程、有機物生物合成過程、有機氮化合物代謝過程、有機物分解代謝過程、細胞過程的調節、對無機物的反應、對有機物的反應。其中,富集到差異蛋白數目最多的條目是有機氮化合物代謝過程。C/N有14條目,R/N有13條目,R/C有15條目對應的實驗組富集到的生物過程大于空白組。細胞組分注釋中前15個條目包括:錨定連接、質外體、細胞壁、葉綠體基質、膜的組成部分、細胞內細胞器、膜界細胞器、非膜界細胞器、細胞器包膜、細胞器腔、細胞器膜、光合作用薄膜、等離子膜、核糖體亞基、類囊體。其中,富集到差異蛋白數目最多的條目是細胞內細胞器和膜界細胞器。C/N有7條目,R/N有13條目,R/C有13條目實驗組富集到的細胞組分大于空白組。分子功能注釋中前15個條目包括:陰離子結合、陽離子結合、酶結合、糖基轉移酶活性、水解酶活性(作用于酸酐)、水解酶活性(作用于酯鍵)、水解酶活性(作用于糖基鍵)、相同蛋白結合、無機分子實體跨膜轉運蛋白活性、離子跨膜轉運蛋白活性、核酸結合、磷酸核苷結合、氧化還原酶活性(作用于供體的 CH—OH 基團)、氧化還原酶活性(作用于 NAD(P)H、肽酶活性)、蛋白質二聚化活性。其中,富集到差異蛋白最多的條目是陰離子結合、陽離子結合、核酸結合。C/N有10條目,R/N有8條目,R/C有15條目實驗組富集到的分子功能大于空白組。

從總體上看,水稻幼苗在BP、CC和MF富集到的前15條目中,加入殼寡糖會富集到更多水稻生長必需的條目,差異蛋白既能結合陰離子也能結合陽離子,推測其功能與白蛋白類似,既可以輸送不同的物質,也可以將有毒物質輸送到解毒器官,有利于水稻緩解低溫脅迫造成的傷害,證明了殼寡糖會影響水稻的生命活動,特別是R/C表達的差異蛋白,從低溫脅迫再到復性這一極度需要強大的恢復能力過程,加入殼寡糖可以調動更多的蛋白完成恢復過程。

2.4 殼寡糖對低溫脅迫下水稻幼苗差異蛋白的KEGG代謝通路研究

為了研究水稻幼苗受殼寡糖影響的途徑,本實驗用KEGG進行通路富集分析,討論光合作用途徑中蛋白的變化情況。明恢63水稻幼苗DEPs富集的前10條關鍵性通路示于圖4?？梢园l現,殼寡糖處理過的水稻在富集到的前10條關鍵通路里大多數差異表達蛋白數目大于空白組,表明殼寡糖在較大程度上影響富集到的關鍵通路里的蛋白,產生了大量的差異蛋白。

注:a.低溫脅迫/正常生長;b.復性/正常生長;c.復性/低溫脅迫圖4 明恢63水稻幼苗DEPs富集的前10條關鍵性通路Fig.4 Top 10 key pathways of DEPs enrichment in rice seedlings of Minghui 63

2.4.1殼寡糖對低溫脅迫下水稻幼苗光合作用的影響 由于水稻對低溫有較高的敏感性,受寒會造成巨大的農業損失,因此,從蛋白質角度分析加入殼寡糖對水稻光合作用的影響。從圖4可以看出,在空白組和實驗組中,水稻幼苗DEPs對低溫脅迫和復性的響應表現出不同的調控模式。實驗組光合作用鑒定的蛋白數目大于空白組,加入殼寡糖后會有更多的蛋白服務于光合作用,從而產生有機物。明恢63水稻幼苗在光合作用途徑中產生的共同蛋白列于附表3。明恢63水稻幼苗的空白組和實驗組共產生27個共同蛋白,正常生長時有27個蛋白表達,有16個蛋白豐度高于空白組;低溫脅迫時僅有26個共同蛋白表達,有9個蛋白豐度高于空白組;復性時僅有16個共同蛋白表達,有11個蛋白豐度高于空白組。結果表明,復性階段前,很多共同蛋白均不表達,在復性時期才開始顯現低溫脅迫帶給水稻的影響,相關蛋白顯著下調。研究發現,正常生長和復性階段的共同蛋白豐度大于空白組,說明水稻經殼寡糖處理后,一方面增強了光合作用,另一方面遏制了低溫脅迫。

水稻光合作用途徑中的差異蛋白結果列于附表4。明恢63實驗組差異蛋白共有25個,其中C/N為10個,R/N為15個。明恢63水稻幼苗實驗組C/N:光系統Ⅱ差異表達psbD、psbC、psbB,光系統I差異表達psaK,細胞色素b6f差異表達PetA;R/N:光系統Ⅱ差異表達psbC、psbB、psdD、psbE、psbF、psbS,光系統I差異表達psbC、psbE、psbH,細胞色素b6f差異表達PetA、PetC?？梢钥闯?明恢63水稻幼苗中參與光合作用的差異表達蛋白大多來自更為重要的光系統Ⅱ,且R/N中差異表達的蛋白數量更多,在經歷了低溫脅迫后,水稻恢復能力較強,仍有大量蛋白參與水稻的光合作用,而空白組光合作用的相關蛋白活性被遏制。

本實驗研究了光合作用的第二部分反應電子轉移和光合磷酸化,從KEGG富集結果上看,殼寡糖處理過的水稻可以產生更多光合作用相關的蛋白;殼寡糖可以在正常生長環境下調控水稻共同蛋白的豐度,促進光合作用;低溫脅迫會使相關蛋白不表達或者低表達,加入殼寡糖后會抵抗低溫脅迫的影響,提高表達的蛋白豐度;加入殼寡糖后的水稻更傾向于產生一些獨特的蛋白,特別是對于光系統中PSII這一關鍵復合體。

2.4.2殼寡糖對低溫脅迫下水稻幼苗淀粉和蔗糖代謝的影響 水稻籽粒中糙米90%的物質來源于淀粉,而淀粉是籽粒代謝過程中主要的積累產物,其合成過程主要包括蔗糖分解、淀粉積累。蔗糖是糖分運輸和貯存的主要形式,可降解為葡萄糖,轉化為葡萄糖供體用于生長代謝。

從圖4可以看出,水稻幼苗在加入殼寡糖后會產生更多的蛋白,用于淀粉和蔗糖的代謝作用,從而產生有機物。明恢63水稻幼苗在淀粉和蔗糖代謝途徑中產生的共同蛋白列于附表5,空白組和實驗組的蛋白相互作用通路示于圖5,可見實驗組的特異酶更多。水稻幼苗空白組與實驗組共產生14個共同蛋白,正常生長、低溫脅迫和復性時分別有3、9、3個蛋白豐度高于空白組。水稻幼苗蛋白情況的結果顯示,復性階段很多共同蛋白均不表達,水稻在復性時才開始顯現低溫脅迫帶給水稻的影響,相關蛋白顯著下調。復性階段共同蛋白的豐度大于空白組,表明殼寡糖處理后,當水稻幼苗遇到寒冷脅迫時會增強淀粉和蔗糖的代謝作用,促進水稻生長發育,抵擋冷脅迫帶來的傷害。

2.5 殼寡糖對低溫脅迫下水稻幼苗RT-qPCR分析

為了闡明mRNA在轉錄水平上與蛋白表達水平之間的關系,同時證明蛋白結論的可靠性,本實驗選取明恢63水稻幼苗10條關鍵性通路中富集的12種關鍵蛋白,利用RT-qPCR技術對實驗組水稻幼苗進行轉錄相對表達水平上的驗證。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,得到正常生長、低溫脅迫、復性時每個基因的相對表達量,并以正常生長時基因的表達量為基準,對所有基因的表達量進行歸一化處理,結果示于圖6。其中,有6組DEPs表達水平與mRNA水平完全一致,分別是Q0JGK4(a)、A0A0P0XNM8(b)、Q6KA00(e)、Q5JK35(g)、A0A0E0K211(j)、A0A0E0AYY8(k);有3組DEPs表達水平與mRNA水平有部分一致,分別是Q6Z8K7(c)、Q7Y1F0(i)、A2WZT1(l);有3組DEPs表達水平與mRNA水平完全相反,分別是Q7F190(d)、Q0E2K1(f)、Q75GN6(h)。真核基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔,在轉錄后,會有轉錄后翻譯、翻譯后加工及修飾等,因此,基因的轉錄水平并不總是與其相應的蛋白質水平一致。本研究結果證明了整個實驗培養條件過程中水稻基因存在一部分翻譯后修飾加工,但是大部分mRNA在轉錄水平上與蛋白表達水平一致,表明這些蛋白與mRNA轉錄水平有關。

注:N為正常生長;C-5d為低溫脅迫5天;R-7d為復性7天圖6 12個代表性明恢63水稻幼苗DEPs的LFQ和qPCR比較分析Fig.6 Comparative analysis of LFQ and qPCR of 12 representative DEPs in rice seedlings of Minghui 63

導致RNA轉錄與蛋白不一致的因素較多。通常情況下,若RNA與蛋白表達趨于一致,那么可推測蛋白沒有進行修飾,不存在這種變化;但對于真核生物而言,蛋白質可能發生翻譯后修飾,也可能發生降解,或者進一步加工剪切形成復合體等多種變化,導致RNA和蛋白的變化趨勢不一致,出現關聯性較弱,甚至是相反的情況。

3 結論

本實驗以明恢63水稻為研究對象,探究在低溫脅迫下殼寡糖對其耐寒機理的誘導。通過生理生化指標得出:殼寡糖處理后的水稻幼苗長勢優越,并能抑制低溫脅迫導致的水稻幼苗葉片蜷曲、變黃等現象。殼寡糖對水稻幼苗葉綠素、可溶性糖、總氨基酸合成均有促進作用,有效地抑制了丙二醛含量的增加,提高了水稻幼苗根系活力及SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶的活性。

基于無標記定量蛋白質組學技術分析得到,實驗組蛋白鑒定數大于空白組。差異蛋白韋恩圖表明,實驗組有更多的相同蛋白抵御脅迫。GO分析結果表明,2種水稻富集到的前15條目基本一致,這些條目與水稻的生命活動密不可分,加入殼寡糖會富集到更多水稻生長必需的條目。從KEGG富集結果看,殼寡糖影響關鍵通路中的蛋白。通過觀察光合作用中電子轉移和光合磷酸化過程,推測殼寡糖可以在正常生長環境下調控水稻共同蛋白的豐度,促進光合作用;通過提升淀粉和蔗糖代謝途徑中相關蛋白的活性,使表達的蛋白豐度提高,從而幫助水稻幼苗抵抗低溫脅迫的影響。RT-qPCR結果表明,蛋白與mRNA轉錄水平有關,同時也驗證了蛋白數據的可靠性以及必要性。