不同受體激動劑誘發大鼠去內皮尾動脈環的收縮反應

鄧童，甘璐，李璐，鐘聰敏，范建輝

(1.河北大學附屬醫院麻醉科，河北 保定 071000；2.河北大學臨床醫學院，河北 保定 071000；3.保定市第一醫院老年醫學科，河北 保定 071000；4.保定市滿城區第四醫院麻醉科，河北 保定 072150)

高血壓是全球性的公共衛生問題，2018年中國高血壓患病率已達到27.5%，高血壓所導致的心血管疾病已成為中國人口死亡的首要原因[1]。由于其發病的多因性及復雜性，尤其是難治性高血壓和青少年高血壓的發病機制尚未完全闡明[2]，所以進一步探討血管張力及調節機制仍有指導意義。嘌呤能受體與腎上腺素能受體在心血管系統廣泛表達，具有調節心臟功能、血管張力、血管生成和炎癥等作用[3]。分布在血管的嘌呤受體有P1 和P2受體的多種亞型。P1受體四種亞型中A1R和 A3R 介導血管收縮，A2AR 和 A2BR 介導血管舒張[4]。P2受體對血管張力調節與其所在位置有關：分布在內皮細胞上的 P2 受體(P2Y1R、P2Y2R、P2Y4R 和 P2Y11R)介導血管舒張，而平滑肌細胞上的 P2 受體(P2X1R、P2X2R、P2X4R)介導血管收縮[5]，其中P2X1受體是介導嘌呤能信號誘發動脈平滑肌收縮反應的重要靶點[6]。

尿苷腺苷四磷酸鹽(uridine adenosine tetraphosphate，Up4A)作為一種由內皮細胞釋放的、同時含有嘌呤和嘧啶部分的內皮源性血管收縮因子，主要通過作用于嘌呤能受體發揮生物學效應[7]。青少年高血壓患者血漿Up4A濃度升高，并且與血壓呈正相關。外源性Up4A可誘發高血壓大鼠腎動脈、股動脈和基底動脈血管收縮增強，但Up4A對無預收縮的豬冠狀動脈無收縮作用[8]。文獻證實，外周阻力血管的重塑在高血壓的發生發展中起到了關鍵作用，外周阻力動脈的變化高度預測高血壓進展程度[9]；大鼠尾動脈作為主要的外周阻力血管，其P2X1受體密度明顯高于其他血管組織[6]。研究[8]指出，Up4A可以同時作用于動脈血管的內皮細胞和平滑肌細胞，介導血管的舒張和收縮，因此，為排除血管內皮細胞對血管張力的影響，選用去內皮大鼠尾動脈血管環測定去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)、Up4A和α,β-亞甲基ATP(α,β-MeATP)三種受體激動劑誘發的收縮反應，比較不同受體激動劑對外周阻力血管張力的調節，為進一步分析血管嘌呤受體在高血壓病中的相關研究提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級 Wistar大鼠12只，8周齡，體質量300～350 g。購置于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證[SCXK(京)2021-0006]。大鼠購入后，在 (22 ± 3)℃，相對濕度 45%～60%的 SPF級動物房環境下進行分籠飼養，每日提供足夠食物，自由飲水。適應性飼養一周，排除有潛在疾病的大鼠。

1.2 藥品與試劑

烏拉坦、NA、α,β-MeATP和乙酰膽堿(ACh)購于德國Sigma-Aldrich公司；Up4A購于美國Biolog Life Science Institute 公司；氯化鉀(KCl)購于天津市永大化學試劑開發中心；Krebs-Ringer緩沖液購于北京雷根生物技術有限公司。

1.3 儀器與設備

數字酸度計 (型號pHS-3C，杭州東星儀器設備廠)；ERT-884 四道生理記錄儀、張力換能器(河南開封友林電子有限公司)；電子分析天平(型號FA2004，上海良平儀器儀表有限公司)；壓力換能器(型號MLT0380/D，ADInstruments Pty Ltd)。

1.4 離體動脈環的制備

采用25%烏拉坦1.5 g/kg對大鼠進行腹腔注射麻醉，股動脈放血處死，縱向切開大鼠尾部腹側皮膚顯露尾動脈兩側筋膜，沿尾骨動脈溝縱向切開兩側的筋膜，用鑷子輕柔挑起遠心端處尾動脈，剪取尾動脈近心端1/3部位的標本。使用當日配制的K-H營養液，營養液 pH值經鹽酸調節至7.2～7.4。每個標本取出后，均放入以95%O2和5%CO2混合氣體預先飽和的4 ℃ K-H溶液中，并仔細去除標本周圍結締組織，在血管內腔中插入表面粗糙的聚乙烯管(外徑略小于血管內徑)，小心摩擦以去除內皮，并截取3～4 mm動脈血管環。兩根鎢絲環分別從血管的管腔中平行穿入，標本置于K-H液中。通過鎢絲環將動脈環的一側固定在浴槽的下端，另一側與張力換能器連接；張力換能器傳輸信號，ERT-884四道生理記錄儀記錄其收縮產生的機械能。施于0.75 g靜息張力，持續通以95% O2和5% CO2的混合氣體，在K-H液 (37 ± 0.5)℃ 中平衡1 h。平衡期間，營養液每15 分鐘更換一次。

1.5 標本內皮完整性和血管收縮反應性檢測

平衡1 h后，各動脈血管環加入EC50濃度的NA，使其產生預收縮，待張力穩定后，再加入1 μmol/L ACh，以ACh不產生任何舒張反應作為完全去除內皮的指標來檢驗內皮的完整性。對血管內皮完全去除的標本，反復沖洗并休息30 min后，逐一建立NA(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol/L)累積給藥的收縮反應曲線，以檢查標本的收縮反應性。再反復沖洗并休息1 h后將血管環隨機分為三組，分別進行NA、α,β-MeATP和Up4A三種藥物誘發的收縮實驗。

NA組仍采用累積給藥的方式，測定 NA (0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol/L)的第二輪收縮反應曲線，觀察 α1受體介導的血管收縮反應。

α,β-MeATP組和Up4A組采用單個標本單個濃度的間斷給藥方法，以防止受體脫敏現象對收縮反應的影響。α,β-MeATP組和Up4A組均采用0.1、1.0、10 μmol/L三個濃度，以單個標本單個濃度間斷給藥的方法加入浴槽，測定藥物誘發的最大收縮反應，將每個濃度α,β-MeATP和Up4A誘發的最大收縮反應建立濃度-反應量效曲線。每個濃度給藥間隔都需要立即沖洗標本，使藥物充分洗脫。

各血管標本在結束上述反應后，反復沖洗并休息30 min，使血管張力恢復到基礎水平，再建立KCl (10、30、60、90、120 mmol/L)累積給藥的收縮反應曲線，記錄KCl誘發的最大收縮反應。然后取出標本，去除多余水分，稱量標本濕重。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 血管環濕重及血管反應性測定

三組大鼠尾動脈標本的濕重和KCl誘發的最大收縮反應差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1和表1。NA(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol/L)累積給藥誘發的三組大鼠去內皮尾動脈的收縮反應曲線，經雙因素方差分析差異無統計學意義 (P>0.05)，見圖2和表2。提示三組尾動脈血管的收縮反應性差異無統計學意義，可以進行第二輪血管收縮反應實驗。

表1 三組大鼠尾動脈標本濕重以及KCl誘發的最大收縮反應比較 (n=4)

表2 NA誘發的三組血管收縮反應性比較 (n=4) g·mg-1

A 標本濕重；B KCl誘發的最大收縮反應圖1 三組大鼠尾動脈標本濕重以及KCl誘發的最大收縮反應比較 (P>0.05，n=4)

圖2 NA誘發的三組血管收縮反應性比較 (P>0.05，n=4)

2.2 NA、α,β-MeATP和Up4A誘導大鼠離體去內皮尾動脈血管收縮反應比較

NA、α,β-MeATP和Up4A三種藥物均可產生濃度依賴性收縮反應。雙因素方差分析顯示，以標本濕重和KCl最大收縮反應標化后的三條收縮反應曲線差異均具有統計學意義，收縮反應強度為NA>α,β-MeATP>Up4A。與NA(0.1、1、10 μmol/L)誘發血管收縮反應的值進行比較，同濃度α,β-MeATP和Up4A誘發收縮反應差異均具有統計學意義 (均P<0.01)，見圖3、表3—4。10 μmol/L NA、α,β-MeATP和Up4A誘導尾動脈血管收縮反應的值分別為KCl最大收縮反應的(95.26±14.57)%、(62.28±6.98)%和(12.16±2.19)% (P<0.01)，10 μmol/L α,β-MeATP和Up4A誘發的尾動脈收縮反應分別占同濃度NA誘發收縮反應的65.4%和12.8%。

表3 不同濃度NA、α,β-MeATP和Up4A誘發大鼠去內皮尾動脈環的收縮反應比較(n=4) g·mg-1

表4 不同濃度NA、α,β-MeATP和Up4A誘發大鼠去內皮尾動脈環的收縮反應(血管收縮張力 /KCl最大收縮張力)比較(n=4) %

與0.1 μmol·L-1 NA比較，aP<0.01；與1 μmol·L-1 NA比較，bP<0.01；與10 μmol·L-1 NA比較，cP<0.01圖3 不同濃度NA、α,β-MeATP和Up4A誘發大鼠去內皮尾動脈環的收縮反應比較(n=4)

3 討論

Up4A是第一個在生物活體中發現的同時含有嘧啶和嘌呤結構的二核苷酸，可通過激活 P1 和 P2 受體發揮血管調節作用。其嘌呤和嘧啶結構引起的反應因所研究的物種、品系和組織的不同而有很大差異，這可能由于不同部位嘌呤能受體亞型在血管平滑肌或內皮細胞的表達具有差異性所致，使Up4A在不同類型動脈中的作用難以預測。外周阻力血管的重塑在高血壓的發生發展中起關鍵作用[9]，外周阻力血管的收縮和舒張在血容量不足或休克等病理狀況下保證重要臟器血液供應方面發揮重要作用。既往研究發現，核苷酸對于血管舒縮功能的實現有內皮細胞和平滑肌細胞的 P2 受體參與，平滑肌細胞的P2受體尤其是P2X1，主要介導血管的收縮，大鼠尾動脈作為主要的外周阻力血管，其P2X1受體密度明顯高于其他血管組織[6]。另一方面，血管內皮具有分泌多種血管活性因子(NO、內皮素、前列腺素、PGI2等)的能力，內皮功能障礙分泌血管舒縮物質的比例失調也是高血壓的重要因素，所以實驗中為了排除內皮功能對血管張力的影響，選擇去內皮大鼠尾動脈血管環進行實驗，觀察不同受體激動劑對大鼠尾動脈平滑肌的收縮作用。結果顯示，NA通過腎上腺素能受體在介導去內皮大鼠尾動脈血管收縮方面仍占有絕對優勢；10 μmol/L P2X1受體特異性激動劑α,β-MeATP誘發的尾動脈收縮反應接近NA的65.4%，說明P2X1受體對維持血管張力以及血壓調節方面也具有重要意義。

本研究結果顯示，在標本濕重和血管收縮性基本相同的情況下，與NA和α,β-MeATP相比，Up4A在低濃度時未能誘發去內皮尾動脈環收縮反應，以往研究也發現低濃度(0.1 μmol/L 和1.0 μmol/L)Up4A不能誘發去氧腎上腺素預收縮的小鼠胸主動脈[10]和大鼠去內皮胸主動脈環[11]的收縮反應，本實驗和文獻結果一致。本實驗10 μmol/L Up4A誘導的大鼠去內皮尾動脈環收縮反應為同濃度NA的12.8%，以往發現10 μmol/L Up4A可使去氧腎上腺素預收縮的小鼠胸主動脈進一步收縮(19±6)%后，繼而發揮舒張作用(46±6)%[10]；可使大鼠去內皮胸主動脈環收縮(20±5)%，也可使去氧腎上腺素預收縮的內皮完整的大鼠胸主動脈環舒張25%，但對去內皮血管環則無任何舒張作用[11]，這些結果表明，Up4A在不同血管、不同血管張力情況下發揮的作用具有明顯差異，這對特殊情況下血液再分布以保障重要臟器血液供應具有重要意義。有研究[12]表明，非選擇性 P2YR 拮抗劑可減弱Up4A在無預收縮的完整內皮大鼠肺動脈的收縮反應，而非選擇性 P2XR 拮抗劑或 P2X1R 激動劑α,β-MeATP使P2X1受體預先脫敏情況下，均不能減弱Up4A的縮血管作用。此外在內皮完整的肺動脈血管環中，Up4A的縮血管作用強度大于 UTP(P2Y2R和P2Y4R的配體)和UDP(P2Y6R的配體)，而三者對去內皮肺動脈環誘發的收縮程度相當，在AngⅡ誘導型高血壓小鼠中發現血管緊張素受體1型(angiotensin type 1 receptor，AT1R)和P2X1受體蛋白質表達有所上調[13]，表明Up4A可能通過P2YR和P2XR 共同調節血管的張力參與高血壓病的發生發展，維持血壓平衡。

綜上所述，大鼠尾動脈作為主要的阻力血管，腎上腺素能受體和P2X1嘌呤受體在血管張力調節方面具有重要作用；具有嘧啶和嘌呤結構的二核苷酸Up4A在介導外周阻力血管平滑肌收縮方面效果較??；外周阻力血管平滑肌不同受體介導血管張力的不同可能對血液再分配、保障重要臟器血液供應方面具有重要意義。本課題組將進一步進行實驗，觀察不同受體激動劑對內皮完整血管的張力調節作用、Up4A對血管內皮細胞和平滑肌細胞P2Y受體和P2X受體介導血管舒張和收縮的影響。除此之外，嘌呤受體拮抗劑對正常血壓和高血壓大鼠血管張力的影響也將進一步完善，以期為分析嘌呤受體在高血壓發生發展中的作用及機制提供實驗依據。