抗磷脂綜合征中非標準抗磷脂抗體的診斷價值和風險預測

白伊娜，孟菁菁，趙久良，李夢濤，曾小峰，胡朝軍

作者單位：100730 北京，中國醫學科學院 北京協和醫學院，北京協和醫院風濕免疫科，風濕免疫病學教育部重點實驗室，疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，國家皮膚與免疫疾病臨床醫學研究中心(白伊娜、趙久良、李夢濤、曾小峰、胡朝軍)；450000 鄭州，鄭州大學第五附屬醫院檢驗科(孟菁菁)

抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一種罕見的、復雜的自身免疫性疾病，主要以動/靜脈或微血管血栓形成和/或病態妊娠為主要臨床表現。部分患者表現為抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies，aPLs)持續陽性所導致的非血栓性臨床表現，如血小板減少癥、溶血性貧血、網狀青斑、心臟瓣膜病或神經系統病變(偏頭痛、癲癇、舞蹈癥)等[1-2]。aPLs作為APS的特征性標志物已被納入其分類診斷標準(2006年悉尼標準)，實驗室診斷指標為狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LAC)，抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibodies，aCL)IgG/M和/或抗β2糖蛋白I抗體(anti-beta 2 glycoprotein I，aβ2GPI)IgG/M，至少兩次且間隔至少12周的中高滴度陽性[3]。隨著對APS的不斷深入研究，目前的標準aPLs在診斷APS方面存在一定的局限性，如LAC檢測的影響因素較多；aCL敏感性高但特異性相對較低且易導致假陽性；aβ2GPI具有較高特異性，但敏感性較低[4]；同時也無法解釋血清陰性APS(seronegative APS，SNAPS)，即臨床表現高度提示APS，但標準aPLs持續陰性[5]。aPLs是一組異質性自身抗體，能夠與細胞(血小板、內皮細胞、單核細胞、成纖維細胞和滋養層細胞)所表達的磷脂和質膜蛋白結合，導致血栓前狀態[6-7]。盡管aPLs在APS發病機制中的作用已被廣泛接受，但aPLs持續存在與孤立的臨床不良事件之間的不一致性仍然是研究重點。非標準aPLs檢測不僅有助于提高診斷APS的能力，發現易漏診、誤診的血清學陰性或非標準表現的APS患者，還有助于了解疾病的機制、評估相關臨床表現，以及后續治療管理、疾病的預后和評估[8-10]。

目前對于非標準aPLs是否具有額外的診斷價值，以及非標準aPLs與臨床表型相關性的研究尚不完全明確。因此，本研究旨在分析抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原抗體(anti-phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT)、抗磷脂酰肌醇抗體(antiphosphatidylinositol，aPI)、抗磷脂酸抗體(antiphosphatidic acid，aPA)和抗磷脂酰乙醇胺抗體(antiphosphatidylethanolamine，aPE)在APS患者、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者和健康人群中的分布，探討非標準aPLs檢測的診斷價值以及其與臨床表現的相關性，如血栓性事件、病態妊娠、APS相關腎病和神經系統癥狀等。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究是一項單中心、前瞻性隊列研究。共納入2018年1月至2021年12月在北京協和醫院就診的146例APS患者，其中98例診斷為原發性APS(primary APS，PAPS組)，41例繼發于SLE診斷為繼發性APS(secondary APS，SAPS組)，7例診斷為血清陰性APS(SNAPS組)；并選擇同期SLE患者(SLE組)138例，健康對照者(HC組)55例。APS和SLE的診斷依據2006年悉尼修訂的分類標準和2019年EULAR/ACR標準。除aPLs血清學檢測結果外，APS組和SLE組還包括部分臨床表現，如血栓形成(動脈或靜脈)、病態妊娠、血小板減少、溶血性貧血等。HC組僅有aPLs血清學檢測結果。本研究經北京協和醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》的倫理準則。所有受試者均簽署書面知情同意。

1.2 研究方法

采集待檢者靜脈血2 mL，以4 000 r/min離心10 min后收集血清，保存于-70 ℃備用?？剐牧字贵w(aCL)和抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(aβ2GPI)的IgG、IgM和IgA采用深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司iModules全自動免疫分析儀檢測。aPI的IgG和IgM，aPA 的IgG和IgM以及aPE的IgG、IgM和IgA采用德國AESKU診斷股份有限公司提供的AESKULISAELISA檢測試劑盒檢測。aPLs水平以[log(實驗值+2)U/mL]表示。

1.3 統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。非正態分布計量資料以中位數(P25，P75)形式表示，分類變量的比較采用卡方檢驗(理論頻數T<5時，采用Fisher精確檢驗)。采用校正年齡和性別的Logistic回歸分析抗磷脂抗體檢測結果與臨床表現的關系。APS診斷的敏感性、特異性和準確性比較采用四格表McNemar分析。在用四格表法評估診斷指標時，PAPS組、SAPS組和SNAPS組均被視為試驗組。統計顯著性水平設置為雙尾α值0.05。

2 結果

2.1 受試者基本特征

SAPS組和SLE組中女性比例略高于PAPS組(χ2分別為9.558和32.20，P分別為0.002和0)。PAPS組、SAPS組、SNAPS組與SLE組年齡無差異(P分別為0.409、1、1)，但均低于HC組(P分別為0.007、0.004、0.000、0.028)。SAPS組和SLE組中ANA陽性率和Coombs實驗陽性率顯著高于PAPS組，差異具有統計學意義(P=0.000)。在相關臨床表現中，PAPS組和SAPS組動脈血栓事件最常見(75.51%和65.85%)，SLE組未發現血栓事件；SNAPS組病態妊娠事件的比例最高(85.71%)；SAPS組中微血管病、血小板減少癥和溶血性貧血的比例顯著高于PAPS組(P分別為0、0.005和0)和SLE組(P均為0.000)。在相關實驗室檢測指標中，SAPS組的LAC和aCL的陽性率顯著高于PAPS組(P分別為0.009和0.001)，而aβ2GPI在兩組之間無差異(P=0.844)(表1)。

2.2 非標準aPLs在不同人群中的分布

APS各組間相互比較結果顯示，SAPS組IgG型aPS/PT(37.80 U/mL)、IgG型aPE(6.64 U/mL)和IgA型aPE(7.23 U/mL)水平均高于PAPS組(5.10、2.89、5.07 U/mL)，差異有統計學意義(P分別為0.000、0.016、0.023)；SAPS組IgG型aPS/PT(37.80 U/mL)、IgG型aPI(13.66 U/mL)和IgG型aPA(4.48 U/mL)水平均高于SNAPS組(5.10、2.09、0.95 U/mL)，差異有統計學意義(P分別為0.002、0.025、0.009)。與SLE組比較結果顯示，PAPS組IgM型aPS/PT(26.61 U/mL)、IgM型aPI(5.93 U/mL)、IgM型aPA(3.21 U/mL)和IgM型aPE(20.08 U/mL)高于SLE組(5.10、1.94、1.30、8.79 U/mL)，IgA型aPE(5.07 U/mL)低于SLE組(7.53 U/mL)，差異均有統計學意義(P=0)；SAPS組IgG型aPS/PT(37.80 U/mL)、IgG型aPI(13.66 U/mL)、IgG型aPA(4.48 U/mL)，IgG型aPE(6.64 U/mL)、IgM型aPS/PT(48.67 U/mL)和IgM型aPI(5.55 U/mL)高于SLE組(5.10、3.86、1.75、3.65、5.10、1.94 U/mL)，差異有統計學意義(P分別為0、0、0、0.004、0.022、0)。與HC組比較結果顯示，PAPS組aPI(IgG 5.68 U/mL，IgM 5.93 U/mL)、aPA(IgG 2.44 U/mL，IgM 3.21 U/mL)、aPE(IgG 2.89 U/mL，IgM 20.08 U/mL)和aPS/PT(IgG 5.10 U/mL)水平高于HC組(1.13、0.79、1.22、0.51、1.73、8.60、5.10 U/mL)，差異有統計學意義(P分別為0、0、0、0、0、0.006、0.002)；SAPS組aPS/PT(IgG 37.80 U/mL，IgM 48.67 U/mL)、aPI(IgG 13.66 U/mL，IgM 5.55 U/mL)、aPA(IgG 4.48 U/mL，IgM 2.14 U/mL)和aPE(IgG 6.64 U/mL，IgA 7.23 U/mL)水平高于HC組(5.10、21.12、1.13、0.79、1.22、0.51、1.73、3.62 U/mL)，差異有統計學意義(P分別為0、0.022、0、0、0、0、0、0)。SNAPS與SLE組和HC組比較差異均無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 非標準aPLs在不同人群中的分布Fig 1 Distribution of non-criteria aPLs among different patient groupsaPLs：抗磷脂抗體；APS：抗磷脂綜合征；PAPS：原發性APS；SAPS：繼發性APS；SNAPS：血清陰性APS；SLE：系統性紅斑狼瘡；HC：健康對照者；aPLs水平以[log(實驗值+2)U/mL]表示；*P<0.05，**P<0.01

2.3 非標準aPLs在不同組的陽性率

PAPS組，至少一種aPLs陽性患者占79.59%，三種及三種以上aPLs陽性的患者占40.82%，六種及六種以上aPLs陽性患者占11.22%；SPAS組，至少一種aPLs陽性患者占92.68%，三種及三種以上aPLs陽性患者占51.22%，六種及六種以上aPLs陽性患者占14.63%；SNAPS組，57.14%患者至少一種aPLs呈陽性。SLE組，60.14%的患者存在至少一種aPLs，18.84%的患者存在三種及三種以上的aPLs，僅4.35%的患者存在六種及六種以上aPLs；HC組，至少有一種aPLs陽性患者比例較高(65.45%)，三種及三種以上aPLs陽性患者比例僅為1.82%。至少包含一種aPLs陽性的患者中，PAPS組和SAPS組比例明顯高于SLE組(P=0.002和P=0)和HC組(P=0和P=0)，差異具有統計學意義。在三種及三種以上的aPLs陽性患者中，PAPS組和SAPS組比例明顯高于SLE組和HC組，差異具有統計學意義(均P=0)(圖2)。SNAP組與各組比較，差異均無明顯統計學意義(P>0.05)。57.14%的 SNAPS患者非標準aPLs陽性，且aPS/PT IgM、aPI IgG/M和aPE IgG/M/A是部分SNAPS患者中唯一可檢測到的標志物，以aPE IgM較為常見(2，28.57%)(圖3)。韋恩圖分析顯示，在APS患者中四種非標準aPLs相比較，aPS/PT IgG/M(56.20%)和aPE IgG/M/A(58.90%)是最常見的非標準aPLs(P<0.05)；aPI IgG/M是43.80%；aPA IgG/M陽性率最低，僅為29.50%，并且多伴隨其他非標準aPLs同時出現(圖4)。

圖3 SNAPS組非標準aPLs分布Fig 3 Distribution of non-criteria aPLs in the SNAPS group

圖4 APS患者非標準aPLs分布(n=146)Fig 4 Distribution of non-criteria aPLs in the APS (n=146)韋恩圖重疊區域中數字代表具有特定陽性非標準aPLs患者數量，非重疊區域中數字代表單個非標準aPLs陽性患者數量，括號中數字代表該組aPLs陽性患者總數。

2.4 非標準aPLs與APS臨床表現的相關性

不同aPLs與臨床表現之間的相關性如森林圖所示，IgM型aPS/PT是動脈事件的危險因素(OR2.30，P=0.038)；IgA型aPE是靜脈事件的危險因素(OR3.47，P=0.032)；IgG型和IgM型 aPS/PT是血栓形成的危險因素(OR分別為2.44和2.41，P分別為0.046和0.04)。在大血管狹窄/閉塞事件中，IgM型aPI和IgM型aPA是其危險因素(OR分布為7.32和8.75，P分別為0.038，0.027)；在中風事件中，IgM型aPS/PT(OR3.95，P=0.018)和IgG型aPI(OR2.63，P=0.025)是其危險因素；APS相關腎臟疾病，IgG型aPI(OR4.20，P=0.035)和IgG型aPA(OR4.87，P=0.02)是其危險因素。在相關妊娠事件中，IgG型aPS/PT與10～28周流產呈負相關(OR0.37，P=0.044)。IgM型aPS/PT、IgG型aPI和IgG型aPA是子癇前期早產的危險因素(OR分別為4.04、2.82、4.45，P分別為0.023、0.046、0.009)。IgG型和IgM型aPS/PT、IgG型和IgM型aPA是血小板減少的危險因素(OR值分別為2.46、3.01、2.77、2.65，P分別為0.016、0.004、0.018、0.047)；IgM型aPI和IgM型aPA是溶血性貧血的危險因素(OR值分別為5.06和4.40，P分別為0.006、0.024)；IgG型aPS/PT是非中風神經系統癥狀的危險因素(OR4.34，P=0.029)(圖5)。

2.5 非標準aPLs在APS診斷中的預測價值分析

評估非標準aPLs陽性(>18 U/mL)在APS診斷中的敏感性、特異性、準確性等，結果顯示單個抗體陽性中，aPE IgM的敏感性最高(50.00%)；aPI IgG/IgM、aPA IgG/IgM和aPE IgG的特異性最高，均為100%。aPS/PT IgG陽性診斷APS的OR值最高(27.28，95%CI：3.66-203.11)。IgG型和IgM型非標準aPLs的聯合檢測中，aPS/PT與aPE診斷APS的敏感性較高(56.20%和55.50%)，但特異性僅為(60.00%和76.40%)，且兩者在敏感性、特異性和準確性上無差異(P分別為1、0.064、0.456)。aPA診斷APS的準確性較低(48.76%)。IgA型aPE聯合IgG和IgM檢測對其敏感性、特異性、準確性均無提升(P分別為0.063、1、0.219)(表2)。

表2 非標準aPLs在APS診斷中的預測價值(n=146)Table 2 Predictive value of non-criteria aPLs in APS diagnosis(n=146)

續表2

3 討論

APS是一種累積全身多器官多系統的自身免疫性疾病，其發病率僅為0.05%[11]，且女性多見[12]。臨床上常見的APS主要為：(1)產科APS(obstetric APS，OAPS)，主要以妊娠發病為特征[13]；(2)血管或血栓性APS，主要以靜脈和/或動脈血栓形成為特征[14]；(3)災難性APS(catastrophic APS，CAPS)，主要以全身性微血管病變為特征。盡管CAPS在APS中的發病率不到1%[15]，但其死亡率高達30%[16]。同時APS既可以是一種孤立的疾病(PAPS)，也可以繼發于SLE或其他自身免疫性疾病(SAPS)[17]。APS臨床表現復雜且缺乏特異性，部分APS患者僅表現為血小板減少、腎病、皮膚表現(網狀青斑等)和中樞神經系統癥狀(如認知異常和癲癇)等一些非標準臨床表現[18]；部分APS患者的血清學檢測結果為陰性。因此，臨床工作中單純檢測標準aPLs(LAC，aCL和aβ2GPI)已經不能滿足APS的診斷和研究工作的需要，增加非標準aPLs的檢測不僅能夠提高診斷APS的能力，促進疾病的早期治療干預，改善患者的臨床結局，還能夠為疾病的機制研究提供更多的血清學線索。

本研究主要評價aPS/PT、aPI、aPAaPE檢測在APS的診斷價值，并分析非標準aPLs與臨床癥狀的相關性。通過分析不同組患者非標準aPLs的分布，發現不同的抗體類型導致aPLs檢測水平在不同組間存在差異，同時IgG型非標準aPLs在PAPS和SAPS組顯著高于HC組，提示非標準aPLs在APS的診斷中有重要價值。本研究未觀察到非標準aPLs在 SNAPS組與SLE組或HC組之間存在差異，可能是由于SNAPS組樣本量較少(僅7例)所導致，但是有4例SNAPS患者非標準aPLs為陽性，因此對于SNAPS患者非標準aPLs的檢測仍然具有一定的診斷價值。本研究SLE組與APS組的年齡無差異，性別的差異可能是由于SLE好發于女性所致[19]。據報道大約1%～5%的健康人群aPLs為陽性[20]，10%～40%的SLE患者aPLs呈陽性[21]，而這些人群中約50%～70%會進展為APS[12]，可見本研究結果也反映了aPLs在人群中的分布特點。

盡管非標準aPLs在APS組與SLE組檢測水平差異不明顯，但是在APS組中至少一種非標準aPLs陽性和三種及三種以上非標準aPLs陽性的比例均高于SLE組和HC組，同時非標準aPLs在多數SNAP患者(57.14%)中呈陽性，這與之前的報道[5，22]類似。因此，通過對非標準aPLs的檢測不僅有助于提高APS的診斷能力，還有助于識別原本可能被遺漏的血栓形成或病態妊娠的APS患者。在本研究中，IgG/M型aPS/PT和IgG/M型aPE在APS中陽性率最高(56.20%和55.50%)。LAC的測定及其輔助確認測定在技術上要求較高[23]，且易受抗凝治療的影響，而aPS/PT可以避免這種干擾，因此aPS/PT檢測或可替代LAC的檢測。盡管aPLs主要與帶負電荷的磷脂和輔因子反應，而PE是一種中性磷脂，但是由于PE是細胞膜的主要脂質成分之一，占總磷脂的20～50%，這可能就是aPE在本研究APS隊列中陽性率較高的原因[24]。據研究報道APS患者中aPI IgM和IgG陽性率分別為25.4%和31.3%[25]，這與本研究結果類似。由于APS是一種罕見的自身免疫性疾病，因此相對于其他非標準aPLs來說，aPI是一個更平衡的生物標志物，其約登指數為0.44(敏感性和特異性分別為43.80%和100%)。雖然aPA是一種抗負電荷的磷脂抗體，但是其陽性率遠遠低于其他抗磷脂抗體，并且aPA抗體常伴隨其他非標準aPLs同時出現。這可能是由于PA是一種瞬時產生的代謝中間產物，主要由膜磷脂(包括PC和PE)分解產生[26]，是生物膜的次要成分(其含量約占磷脂的1%)[27]。

單純的抗磷脂抗體陽性并不能導致疾病的發生，當額外的觸發因素促進血栓事件的形成時，部分患者會出現臨床表現(二次命中假說)[28]。aPLs可能導致各種類型的血栓形成和產科并發癥(如流產、先兆子癇或胎盤功能不全等)，以及一些瓣膜疾病和血液系統疾病等。aPLs誘發這些病變的機制非常復雜，涉及多種細胞(如內皮細胞、血小板、單核細胞等)、補體等[29]。APS所表現的血栓事件中，以靜脈血栓最為常見；動脈血栓通常以腦血管意外為主，多以中風或短暫性腦缺血的形式出現，其次是心肌梗死[30]。本研究發現非標準aPLs與血栓事件有顯著的關聯，這與其他研究結果[31-32]類似。aPS/PT是血栓形成的危險因素；IgM型aPS/PT是動脈事件和中風發生的危險因素。Sciascia等[33]也證實aPS/PT抗體的存在增加了動脈血栓形成的風險。目前，aPS/PT已被納入全面抗磷脂綜合征評分(global antiphospholipid syndrome score，GAPSS)[34]。盡管在本研究中聯合IgA型aPE的檢測沒有提高aPE(IgG/IgM)在APS中的診斷價值，但在靜脈事件中，僅觀察到IgA型aPE是其危險因素，這與之前的報道結果[29]相同。

認知功能障礙是APS患者較為常見的癥狀[35]，在本研究中IgG型aPS/PT是非中風神經系統(認知障礙、癲癇、舞蹈癥等)事件的危險因素。大約63%～67%的APS患者會出現APS相關腎病，表現為腎臟小血管的非炎癥性閉塞[36]。本研究表明aPI IgG和aPA IgG是APS相關腎臟疾病的危險因素，臨床上CAPS的腎臟受累是其特征性表現之一[37]，這就為是否能夠通過aPLs預測CAPS的臨床結局提供了一種設想。

據報道，APS患者流產的發生率約為34%～76%[38]。在相關妊娠事件中，本研究僅觀察到aPS/PT IgG與10～28周流產呈負相關；aPS/PT IgM、aPI IgG和aPA IgG是子癇前期早產的危險因素，這可能是由于aPLs導致的早期流產的機制和晚期妊娠丟失或胎盤梗死的機制不同[39]。有研究表明aPS和aPI在三次及以上自然流產的患者中陽性率分別為19%和20%，兩次自然流產的患者陽性率分別為25%和17%[40]，并且aPA與胎兒丟失密切相關[24]。因此推測在臨床工作中能夠通過aPLs預測不良妊娠事件的發生，從而及時干預和改善患者的臨床結局。

部分風濕性疾病患者是以血液系統表現為其首發癥狀，同時一些新型抗風濕生物制劑也可能導致血細胞減少。APS患者最常見的血液系統表現為血小板減少，約占16%～53%，這種異質性可能源于對血小板減少的定義以及針對不同的研究對象(原發、繼發或聯合人群)有關[41]。當APS繼發于SLE時，血小板減少更常見(血小板減少已經納入SLE分類標準)。有研究表明SAPS的血小板減少發生率大約是PAPS的兩倍[42]，本研究SAPS組血小板減少的陽性率也遠遠大于PAPS組。本研究還發現IgG/M型aPS/PT和IgG/M型aPA是血小板減少的危險因素，這可能是由于aPLs可以促進血小板的活化和消耗所致[30，41]。據報道溶血性貧血在SAPS中陽性率最高[43]，這與本研究結果相同。aPLs導致溶血性貧血的機制可能依賴于紅細胞表面不同的抗原性[44]，同時紅細胞壽命縮短也取決于免疫球蛋白亞類的類型，即IgG1和IgG3比IgG2和IgG4結合補體的能力更強。紅細胞膜上免疫球蛋白一旦達到臨界量，aPLs就可能激活補體，從而導致紅細胞破壞[43]。本研究僅發現IgM型aPI和IgM型aPA這兩個非標準aPLs是溶血性貧血的危險因素，這可能是由于IgM也是一種強大的補體激活劑，且其補體激活能力高于IgG1和IgG2亞型。

綜上所述，盡管非標準aPLs可以提高其在APS中的診斷價值，并對疾病的臨床表現具有一定的預測價值，但由于本研究是一項單中心、前瞻性隊列研究，樣本量有限，未考慮不同人群、地區等影響，同時由于不同的檢測方法、抗原來源、包被方式、試劑等在抗體檢測中的差異，可能會出現相互矛盾的結果[45]。本研究通過分析aPS/PT IgG/M、aPI IgG/M、aPA IgG/M和aPE IgG/M/A在APS、SLE和HC組的水平，發現非標準aPLs對APS具有一定的輔助診斷價值，尤其適用于診斷部分臨床表現不明顯或者標準aPLs反復陰性的患者。在APS相關臨床事件中，IgG型和IgM型aPS/PT是血栓事件的危險因素；IgM型aPS/PT和IgG型aPI是中風事件的危險因素；IgG型aPI和IgG型aPA與APS腎病的危險因素；IgG型aPS/PT與10～28周流產負相關；IgM型aPS/PT、IgG型aPI和IgG型aPA是子癇前期早產的危險因素。在血液系統疾病方面aPS/PT和aPA是血小板減少的危險因素；IgM型aPI和IgM型aPA是溶血性貧血的危險因素。因此，非標準aPLs的檢測將有助評估APS的發展，預測不良事件的發生，從而及時干預和改善患者的臨床結局?？傊?，本研究為評價非標準aPLs在APS的診斷價值及其與臨床表型的相關性研究提供了重要依據。