梨矮化砧木中矮4 號組培快繁技術研究*

葉 宇，歐春青，王 斐，張艷杰，馬 力，李舒然,2，劉亞龍，姜淑苓

（1 中國農業科學院果樹研究所，農業農村部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城 125100）（2 沈陽農業大學園藝學院）

梨（PyrusL.）是世界性的重要落葉果樹，因其果實香脆多汁、酸甜可口，具有較高的營養價值和醫療保健作用，深受人們的喜愛，被譽為“百果之宗”。傳統梨園在生產上普遍采用稀植大冠或喬砧密植栽培模式，存在樹體過大、樹勢過旺、通風透光差、結果晚、果品質量差、管理困難等問題[1-2]。矮砧集約化密植栽培具有樹體矮化、早果豐產、品質優良、管理方便、經濟效益高等優點，能夠彌補傳統栽培模式的不足，是我國梨栽培發展的必然趨勢[1,3]。中矮4 號是中國農業科學院果樹研究所從錦香梨實生后代中選育而成的梨矮化砧木新品種，具有嫁接親和性好、矮化效果顯著、抗枝干腐爛病和輪紋病、抗寒性強等優點[4]，在梨矮化密植栽培中發揮著重要作用。由于中矮4 號枝條短、扦插生根困難，在生產上僅用作中間砧，苗木繁育效率低且生產成本高，尚沒有自根砧的應用，嚴重制約了其推廣速度。

采用組織培養的方法繁殖，不僅能夠保存、提純和復壯母本的優良性狀，還能消除季節因素的限制，從而顯著地提升繁殖效率，滿足短期大規模生產的需要，創造巨大的經濟價值，是果樹無性繁殖常用的方法之一[5]。目前，關于梨砧木組培快繁技術研究的報道較少，僅在杜梨[6-7]、豆梨[8]和個別矮化砧木[9-10]上有少量報道。本研究以中矮4 號帶芽莖段為試驗材料進行組織培養研究，通過對增殖繼代和生根培養基配方的篩選，為其建立簡便、高效的組培快繁技術體系，以期為中矮4 號自根苗的工廠化繁育提供技術支撐，也為其基因工程改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的試驗材料中矮4 號保存在中國農業科學院果樹研究所梨育種試驗園內，為嫁接在杜梨基砧上10 年生以上的大樹。

1.2 試驗方法

1.2.1 初代組培苗的獲得

春季于中矮4 號新梢萌發長至10 cm 左右時，采集其新梢，剪掉新梢上的葉片，保留葉柄，剪成單芽莖段，用自來水沖洗干凈，經70%乙醇處理30 s、0.1% HgCl2溶液處理10 min、無菌水清洗5 次后，接種至MS＋0.3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA＋1.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖的初代培養基上，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h 的組培室進行培養。待芽萌發長至2～3 cm 時，剪下進行繼代培養。

1.2.2 不同濃度6-BA 對組培苗增殖的影響

以MS 為基本培養基，添加0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3和30.0 g/L 蔗糖，然后分別添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的6-BA，共5 個處理，每個處理3 瓶，每瓶接種3 個外植體，3 次重復。培養條件同初代培養，30 d 后測量株高，調查組培苗增殖系數，并觀察組培苗生長狀況。

增殖系數＝培養后外植體數/初始外植體數

1.2.3 不同硅源及濃度對組培苗增殖的影響

以MS 為基本培養基，添加1.0 mg/L 6-BA、0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3以及30.0 g/L 蔗糖，然后分別附加50、100、200、400、800 mg/L 的納米二氧化硅（NS）和硅酸鉀（KS），以不添加硅源處理為對照，共11 個處理，每個處理3 瓶，每瓶接種3個外植體，3 次重復。培養條件同初代培養，30 d后測量株高，調查組培苗增殖系數，并觀察組培苗生長狀況。

1.2.4 不同生根方法對組培苗生根的影響

生根培養采用一步生根法和兩步生根法[11]。

（1）一步生根法。選取高度大于2.5 cm 且長出3 片及以上葉片的組培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖為基本培養基，分別添加0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L 的IBA，共6 個處理，每個處理5 瓶，每瓶接種3 個外植體，3 次重復。培養條件同初代培養，30 d 后調查生根指標，包括生根率、平均根數、平均根長、平均根粗。

生根率（%）＝（生根株數/接種株數）×100

（2）兩步生根法。選取高度大于2.5 cm 且長出3 片及以上葉片的組培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖為基本培養基，分別添加2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的IBA，分別暗培養3、5、7 d，然后轉移至1/2MS＋1.0 g/L 活性炭（AC）＋15.0 g/L 蔗糖的培養基中，共12 個處理，每個處理5 瓶，每瓶接種3 個外植體，3 次重復。培養條件同初代培養，培養30 d 后調查生根指標。

1.2.5 煉苗與移栽

當組培苗生根培養30 d 后，根系長度1～2 cm時進行煉苗。將組培苗從組培室轉移到溫室，打開瓶口約1/3 煉苗3 d，然后完全打開瓶蓋煉苗2 d。清洗組培苗根部培養基，移栽至培養基質為草炭土∶珍珠巖∶蛭石＝1∶1∶1 的育苗穴盤中，澆透水，噴施50%多菌靈可濕性粉劑800～1 000 倍液，然后扣膜或加蓋保濕。移栽15 d 后，逐漸打開覆膜或蓋子繼續培養，并及時補水，移栽30 d 后統計成活率。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2020 軟件處理數據及制表，采用SAS 9.4 M5 版軟件進行數據統計分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 中矮4 號組培苗的初代培養

中矮4 號單芽莖段在初代培養基上，7 d 內有15%左右的莖段出現了不同程度的細菌或真菌污染，未污染的莖段更換新的培養基，接種培養40 d后，90%以上的未污染莖段上長出了幼嫩新梢，成功獲得了中矮4 號組培苗。

2.2 不同濃度6-BA對中矮4號組培苗增殖的影響

由表1 可以看出，不同濃度6-BA 對中矮4 號的增殖和外植體生長狀態產生明顯影響。當6-BA濃度為1.0 mg/L 時，組培苗的株高達到最高，為3.65 cm，生長健壯，隨著6-BA 濃度的升高（1.5～2.5 mg/L），組培苗的株高呈下降趨勢。組培苗的增殖系數隨著6-BA 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，在6-BA 濃度為2.0 mg/L 時，達到最大值，為3.71，但組培苗矮小?？梢娫谝欢舛确秶鷥龋?.5～2.0 mg/L），較低濃度的6-BA 有利于中矮4 號組培苗長高，而較高濃度的6-BA 則有利于中矮4 號組培苗的增殖。綜合組培苗的生長和增殖狀況可知，1.0 mg/L 為適宜中矮4 號組培苗增殖培養的較好6-BA 濃度。

2.3 不同硅源及濃度對中矮4 號組培苗增殖的影響

由表2 可以看出，不同濃度的NS 和KS 可對中矮4 號組培苗的增殖產生顯著影響。組培苗的株高和增殖系數均隨NS 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，株高、增殖系數最高的NS 濃度分別為100 mg/L 和200 mg/L，均顯著高于對照。KS 對中矮4號組培苗生長的影響與NS 略有不同，株高隨著KS濃度的升高總體呈現下降趨勢，增殖系數則與之相反，株高、增殖系數最高的KS 濃度分別為50 mg/L和400 mg/L，也均顯著高于對照，但均顯著低于NS的最佳處理。結合各處理組培苗的生長狀態可知，200 mg/L NS 處理，不僅植株生長健壯，且增殖系數高（5.67），增殖系數分別比對照和最佳KS 處理（400 mg/L）提高了62.00%和20.38%，最有利于中矮4號組培苗的增殖和生長。

表2 不同硅源及濃度對中矮4 號組培苗增殖的影響

2.4 不同生根方法對中矮4 號組培苗生根和移栽的影響

一步生根法中不同濃度的IBA 對中矮4 號組培苗生根的影響有差異（表3）。組培苗在生根培養7～8 d 后，其莖基部開始有白色物質長出，培養15～20 d 后有白色幼根生成。當IBA 為0.25、0.50 mg/L 較低濃度時，組培苗的生根率較高，以0.50 mg/L IBA 處理最高，為83%，這2 個處理間差異不顯著；隨著IBA 濃度的進一步升高，組培苗的生根率呈逐漸下降趨勢。同時，低濃度的IBA（0.25、0.50 mg/L）也有利于組培苗形成較多、較長和較粗的根系。由此可見，0.50 mg/L 是中矮4 號組培苗一步生根法的最佳IBA 濃度。

表3 一步生根法對中矮4 號組培苗生根的影響

在兩步生根法中，IBA 濃度和暗培養時間均對中矮4 號組培苗的生根效果有顯著影響（表4），各處理的生根率在29%～92%，平均單株根數為2.3～11.2 條，平均根長為1.46～3.98 cm，平均根粗為0.33～0.38 mm。其中，IBA 濃度為3.0 mg/L 時，組培苗的生根效果最好，暗培養3～7 d 處理均能使其生根率在83%以上，以暗培養5 d 效果最好，生根率為92%，平均單株根數為11.2 條。無論哪個IBA濃度處理，暗培養5、7 d 的效果均好于暗培養3 d，整體來看，暗培養5 d 的效果最好。因此，對于中矮4 號組培苗兩步生根法，最佳的處理為1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培養5 d。

表4 兩步生根法對中矮4 號組培苗生根的影響

綜上所述，對于中矮4 號組培苗，一步生根法和兩步生根法均能誘導組培苗生根。相比于一步生根法，兩步生根法處理的組培苗生根效果更好，其生根率、平均單株根數和平均根長均明顯優于一步生根法，但是一步生根法誘導的根系平均根粗要大于兩步生根法。通過對生根的組培苗進行煉苗移栽（圖版3），其移栽存活率均在90%以上，從生根率上看，兩步生根法優于一步生根法。

3 討論

植物生長調節劑種類及配比對梨組培苗的誘導分化、增殖和生根起到關鍵性的作用，主要包括生長素類、細胞分裂素類以及赤霉素類等[5]。細胞分裂素通常與生長素一起使用，兩者相輔相成能夠起到更好的培養效果[12-13]。一般來說，細胞分裂素與生長素的比值較高，則有利于促進不定芽形成，擴大增殖系數。另外，GA3對芽的增殖和伸長有一定的促進作用，與生長素和細胞分裂素組合使用能夠取得較好的效果[14]。本試驗在IAA 和GA3濃度固定的條件下，組培苗的增殖系數隨著6-BA 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢。過高濃度的6-BA 會導致組培苗生長狀態變差，在一定濃度范圍內，較低濃度的6-BA 有利于組培苗株高的形成，而較高濃度的6-BA 則有利于組培苗的增殖，這與王蘇珂等[15]、楊冠宇等[6]的研究結果基本一致。

硅是土壤中含量最豐富的礦物元素之一，也是大多數高等植物生長的有益元素。作為一種宏量元素，硅對植株生長狀況的改善效果極為顯著，能夠促進多種植物（包括硅非積累型植物）的生長發育、改善植株形態以及提高植株抗逆性等[16-17]。近年來，許多學者關注到硅在組織培養中的作用并進行相關試驗，研究結果表明，在培養基中加入硅可以促進愈傷組織生長、器官發生，并改善植株的形態、解剖、生理特征，從而促進組培苗的生長發育[18]。目前，硅已應用于蘋果[19]、香蕉[20]、草莓[21]、藍莓[22]等果樹組織培養中，但尚未有在梨中應用的報道。本試驗在篩出最佳的中矮4 號組培苗增殖培養配方基礎之上，研究不同濃度的納米二氧化硅（NS）和硅酸鉀（KS）對組培苗增殖的影響，證明了硅能夠提高梨組培苗的增殖效果，NS 的效果好于KS，可能是NS 更有利于組培苗的吸收利用，關于硅對梨組培苗生理代謝以及生根誘導方面的影響還有待進一步研究。

梨屬植物組培苗生根困難，生長素類物質是不定根誘導所必需的，其種類和濃度都會對組培苗的生根效果產生影響[5]，目前生產上應用最多的生根誘導劑主要是IBA。本試驗中，中矮4 號組培苗一步生根法使用0.50 mg/L IBA 的生根效果較好，濃度過高反而不利于組培苗生根，這與羅嘉亮等[23]的研究結果一致。另外，光照條件和培養方法對組培苗不定根誘導也有影響，前期的暗培養對組培苗的生根誘導具有促進作用[24]，而活性炭（AC）可吸附植株分泌的有害物質，同時提供生根的暗環境有利于根的誘導和根系生長[25]。本研究采用兩步生根法暗培養5 d 后，轉入1.0 g/L AC 的培養基中，組培苗的生根率可達92%，而暗培養時間過短則不利于組培苗生根[7]。

利用矮化砧木是實現梨矮化密植集約栽培的主要途徑，而組織培養技術是實現梨自根砧無性繁殖的有效技術之一，可在短時間內獲得大量再生植株并保留其優良性狀，同時可通過組培苗脫毒技術獲得無毒苗木，為梨產業提供大量優質苗木。本研究通過對中矮4 號的組織培養，獲得了增殖系數最大為5.67 的增殖培養基配方和生根率最高為92%的生根培養基配方，建立了簡便、高效的梨矮化砧木組培快繁技術體系，為其自根苗工廠化繁育提供了技術支撐。

4 結論

以帶芽莖段為試材，獲取梨矮化砧木中矮4 號的組培苗較為容易；組培苗在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IAA＋3.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖上增殖生長較好，增殖系數為3.29，在該培養基上再添加200 mg/L NS，增殖效率可提高72.34%，增殖系數達5.67；最佳生根培養基配方為1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培養5 d 后，轉移至1/2MS＋1.0 g/L AC＋15.0 g/L 蔗糖的培養基中，生根率達92%，平均單株根數為11.2 條。