寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 群落變化規律*

王佳瑋，呂 燕，劉建利，孫欽飛，侯露露，劉 濤，王麗霞

（1 北方民族大學生物科學與工程學院，國家民委黃河流域農牧交錯區生態保護重點實驗室，寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室，銀川 750021）（2 西鄂爾多斯國家級自然保護區管理局）

寧夏枸杞（Lyciumbarbarum）是茄科枸杞屬藥用植物，也是寧夏、甘肅、內蒙古、新疆和青海等地重要的經濟林果樹種[1]。根腐病是枸杞的“癌癥”，由尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）[2-4]、腐皮鐮刀菌（F.solani）[2,4]、串珠鐮孢菌（F.moniliforme）[3]、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）[3]、三線鐮刀菌（F.tricinctum）[4]、厚垣鐮孢菌（F.chlamydosporum）[4]、鏈格孢菌（Alternariaalternate）[4]、黃色鐮刀菌（F.culmorum）[5]、木賊鐮刀菌（F.equiseti）[5]造成，主要危害3 年齡以上的枸杞植株，造成植株死亡，發病率高達72.4%[2]。近年來，越來越多的研究表明植物根部病害的發生和土壤微生態密切相關[6-8]，賈晨波等[9]報道，寧夏枸杞根腐病的發生也與土壤細菌、真菌多樣性及其物種組成的變化有密切關系。

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一種在土壤中廣泛存在，可以與90%以上陸生植物根部形成共生關系的一種有益真菌，AMF與植物共生后能提高宿主對病蟲害的抗性[10-12]。本課題組前期研究發現，寧夏枸杞根腐病植株根區土壤AMF 群落組成與健康植株具有顯著差異[13]。但在寧夏枸杞根腐病的發病過程中，植株根區土壤AMF群落的詳細變化規律仍需進一步深入研究。因此，本研究以寧夏枸杞根腐病植株不同發病時期的根區土壤為研究材料，分析在不同發病時期植株根區土壤AMF 變化規律，為后續開展應用AMF 防控根腐病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019 年8 月，在寧夏銀川西夏區蘆花臺農戶自種枸杞園（東經106°9′，北緯38°39′）采集樣品，根據表1 標準劃分4 個寧夏枸杞根腐病發病時期。先清除植株周圍地表的凋落物，在植株周圍取直徑1 cm 根系，抖落收集根系上散落的土為根區土。3株植株土壤混合為1 個樣品，每個樣品3 個生物學重復，每個時期采集3 個樣品，共采集12 個土壤樣品。將土壤樣品和根系裝入無菌自封袋中帶回實驗室。土壤樣品過2 mm 篩，部分陰干，保存于4 ℃冰箱中用于土壤理化性質的測定和AMF 分離鑒定；根系樣品保存于4 ℃冰箱中用于AMF 侵染率的測定。

表1 寧夏枸杞根腐病發病時期劃分標準[4]

1.2 試驗方法

1.2.1 AMF 分離鑒定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法[13]分離AMF 孢子，觀察記錄孢子大小、形態、顏色、表面紋飾、孢壁結構、連孢菌絲和內含物等特征，根據國際AMF保藏中心（INVAM）在http://invam.wvu.edu/和http://www.amf-phylogeny.com/上提供的最新分類描述及圖片進行種屬鑒定。

1.2.2 AMF 多樣性測定

參照呂燕等[13]和劉海躍等[14]的方法對AMF 孢子密度、多度、相對多度及物種多樣性指數進行計算。孢子密度（spore density，SD）＝10 g 土樣中孢子數量；多度（relative abundance，RA）＝（AMF 某個屬或某個種的孢子數/樣品中AMF 總孢子數）×100%；分離頻度（frequency，F）＝（AMF 某個屬或某個種出現次數/樣品數）×100%；重要值（important value，IV），樣品中AMF 某個屬或某個種分離頻度與多度之和的平均值，即IV＝（F＋RA）/2；根據重要值將AMF 優勢度劃分為4 個等級，即IV＞60%為優勢屬（種），40%＜IV≤60%為亞優勢屬（種），20%＜IV≤40%為伴生屬（種），IV≤20%為偶見屬（種）。

香農-威納多樣性指數計算公式如下：

式中S 為某樣品AMF 種類數，Pi為種i 所占比率。

辛普森指數計算公式如下：

式中S 為某樣品AMF 種類數，Ni為種i 的個體數，N為全部物種的個體數。

1.2.3 AMF 定殖率測定

依據呂燕等[13]和Phillings 等[15]的方法，觀察并計算AMF 定殖率，計算公式如下：

定殖率（%）＝（有AMF 侵染的根段長度/根段總長度）×100

1.2.4 土壤理化性質測定

pH 值采用電位法測定，有機質（OM）含量采用重鉻酸鉀容量法測定，全氮（TN）含量采用凱氏定氮法測定，全磷（TP）含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測定，全鉀（TK）含量采用氫氟酸高氯酸消煮法測定，銨態氮（NH4+-N）含量采用苯酚-次氯酸鹽法測定，硝態氮（NO3--N）含量采用紫外分光光度法測定[16]，速效磷（AP）含量采用鉬銻抗比色法測定，速效鉀（AK）含量采用醋酸銨-火焰光度計法測定，易提取球囊霉素相關土壤蛋白含量（Easily extractable glomalin related soil protein，EEGRSP）和總球囊霉素相關土壤蛋白含量（Total glomalin related soil protein，TGRSP）采用Braford 法測定[17]。

1.3 數據統計

利用SPSS 20.0 軟件進行統計分析；采用美吉生信云平臺工具（https://cloud.majorbio.com/）進行組間差異分析和PCoA 分析；運用R 語言（R×64 3.5.1）“vegan”包進行PERMANOVA 分析；運用微生太生科云平臺（https://www.bioincloud.tech/#/）對AMF 與土壤因子進行RDA 分析和環境因子相關性分析。

2 結果與分析

2.1 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤理化性質

寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤全氮、全鉀、速效鉀含量均存在顯著性差異，而pH 值和有機質、全磷、銨態氮、硝態氮、速效磷含量均無顯著性差異（表2）。土壤全氮含量隨著寧夏枸杞根腐病發病程度的加重呈增加趨勢，發病后期最高，為2.19 g/kg，分別為未發?。?.73 g/kg）、發病前期（1.61 g/kg）的1.27、1.36 倍；而土壤全鉀、速效鉀含量均隨著寧夏枸杞根腐病發病程度的加重呈降低趨勢，發病后期土壤全鉀含量（1.99 g/kg）比未發?。?.29 g/kg）和發病前期（4.46 g/kg）分別降低了53.61%和55.38%，發病后期土壤速效鉀含量（104.39 mg/kg）比未發?。?98.83 mg/kg）和發病前期（210.41 mg/kg）均降低了約50%。因此，根區土壤全氮含量增高和全鉀、速效鉀含量降低可能與寧夏枸杞根腐病的發生有關。

表2 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤理化性質

2.2 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF孢子密度、定殖率和球囊霉素相關土壤蛋白含量

寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF孢子密度、定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量在土壤中均有顯著差異（表3）。AMF 孢子密度隨著寧夏枸杞根腐病發病程度的加重呈先增加后降低的趨勢，發病前期（14.50 個/g）和發病中期（12.83個/g）較高，比未發?。?.77 個/g）和發病后期（9.70個/g）增加了31.32%～49.48%。AMF 定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量均隨著寧夏枸杞根腐病發病程度的加重呈增高趨勢，發病中期AMF 定殖率（21.10%）分別是未發?。?.50%）和發病前期（7.72%）的8.44、2.73 倍；發病中期EEGRSP 含量（39.62 mg/g）分別是未發?。?0.73 mg/g）和發病前期（33.49 mg/g）的1.29、1.18 倍；發病后期TGRSP 含量（72.65 mg/g）分別是未發?。?6.63 mg/g）和發病前期（63.94 mg/g）的1.10 倍左右。因此，枸杞根腐病的發生會導致根區土壤AMF 孢子密度、定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量的變化，AMF孢子密度先增加后降低，在發病前期和中期顯著增加，在發病后期又降低至和未發病時無顯著差異；AMF 定殖率、EEGRSP 含量均在發病中期達到最高值，發病后期維持相對恒定，而TGRSP 含量在發病后期達到最高值。

2.3 AMF 孢子形態

在4 組樣品中共分離6 屬16 種，包括無梗囊霉屬（Acaulospora）4 種：蜜色無梗囊霉（A.mellea）、皺壁無梗囊霉（A.rugosa）、細凹無梗囊霉（A.scrobiculata）、孢果無梗囊霉（A.sporocarpia）（圖版1-1～4）；傘房球囊霉屬（Corymbiglomus）1 種：簇孢傘房球囊霉（C.corymbiforme）（圖版1-5）；多樣孢囊霉屬（Diversispora）1 種：橙黃多樣孢囊霉（D.aurantia）（圖版1-6）；球囊霉屬（Glomus）6 種：雙網球囊霉（G.bireticulata）、寬柄球囊霉（G.magnicaule）、黑球囊霉（G.melanosporum）、多梗球囊霉（G.multicaule）、網狀球囊霉（G.reticulatum）、地表球囊霉（G.versiforme）（圖版1-7～12）；根孢囊霉屬（Rhizophagus）1 種：明根孢囊霉（R.clarus）（圖版1-13）；隔球囊霉屬（Septoglomus）3 種：縮隔球囊霉（S.constrictum）、沙荒隔球囊霉（S.deserticola）、黏質隔球囊霉（S.viscosum）（圖版1-14～16）。

2.4 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF群落組成

寧夏枸杞根區土壤中AMF 群落優勢屬在根腐病不同發病時期有所差異。未發病和發病中期優勢屬均為球囊霉屬，多度分別為49.0%和34.9%，發病前期和發病后期優勢屬均為隔球囊霉屬，多度分別為34.5%和33.5%（圖1-A）。單因素方差分析顯示（圖1-B），隔球囊霉屬、根孢囊霉屬、球囊霉屬和無梗囊霉屬在不同發病時期多度均差異顯著（P＜0.05），所有發病時期球囊霉屬和無梗囊霉屬均比未發病時低；隔球囊霉屬剛好相反，所有發病時期均高于未發病時；根孢囊霉屬則先增高后降低。因此，根腐病發病時期改變了寧夏枸杞根區土壤中AMF 群落組成，其中隔球囊霉屬、根孢囊霉屬、球囊霉屬和無梗囊霉屬在寧夏枸杞不同發病時期多度存在顯著差異，但多度變化規律不盡相同。

圖1 屬水平寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 群落組成

根腐病發病時期改變了寧夏枸杞根區土壤中AMF 群落優勢種，未發病為蜜色無梗囊霉，發病前期和發病中期為明根孢囊霉，發病后期為縮隔球囊霉（表4）。蜜色無梗囊霉、寬柄球囊霉、黑球囊霉、地表球囊霉、明根孢囊霉、縮隔球囊霉等6 個種在所有的時期都發現，且重要值較高（表4），單因素方差分析顯示（圖2），5 個種在不同發病時期多度差異顯著（P＜0.05），黑球囊霉、寬柄球囊霉和蜜色無梗囊霉所有發病時期重要值均比未發病時降低；縮隔球囊霉剛好相反，所有發病時期均高于未發??；地表球囊霉和明根孢囊霉則是先增高后降低。而簇孢傘房球囊霉和雙網球囊霉只在發病時期出現；孢果無梗囊霉、多梗球囊霉和網狀球囊霉進入發病期后逐漸消失（表4）。

圖2 種水平寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF差異物種

表4 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 種重要值 %

2.5 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF群落α-多樣性

寧夏枸杞根區土壤中AMF 群落α-多樣性指數隨著根腐病發病時期不同有所差異，物種多度、香農-威納指數和辛普森指數均以發病前期最高，而其他時期之間差異均不顯著（表5）。因此，根腐病發生導致寧夏枸杞根區土壤中AMF 群落α-多樣性指數先升高后下降，以發病前期最高。

表5 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 群落α-多樣性

2.6 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF群落β-多樣性

基于Bray_Curtis 距離的主坐標分析（PCoA）4個發病時期寧夏枸杞根區土壤AMF 群落β-多樣性結果顯示，4 個發病時期根區土壤AMF 群落組成存在差異（R2＝0.893，P＝0.001），發病時期對AMF群落差異解釋度為50.47%（圖3）。

圖3 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 群落PCoA 圖

2.7 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF群落與土壤理化因子RDA 分析

對土壤理化因子各項指標與不同發病時期根區土壤AMF 群落進行冗余分析（RDA），速效鉀和全鉀含量是影響不同發病時期寧夏枸杞根區土壤AMF 群落的主要因子，2 個排序軸（RDA1 和RDA2）對物種變量的解釋量分別為34.46%和29.25%，累計解釋量為63.71%。速效鉀含量和全鉀含量促進未發病、發病前期AMF 群落建成，而抑制發病中期、發病后期AMF 群落建成（圖4）。

圖4 寧夏枸杞根腐病不同發病時期根區土壤AMF 群落與土壤理化因子RDA 分析圖

3 討論

研究表明，植物病害的發生和相關微生物群落的失調密切相關[18]，植物病害的發生也會引起相關微生物群落發生變化，也會對根系AMF 群落組成產生影響。玉米紋枯病[19]、三七根腐病[20]、星油藤根腐病[21]、生姜姜瘟病[22]、紐荷爾臍橙根腐病[23]等研究表明，病害發生造成AMF 侵染率、根際土壤孢子密度降低。而本研究表明，AMF 定殖率隨著寧夏枸杞根腐病的發生而增高，在發病中期達到最高值，分別是未發病、發病前期的8.44、2.73 倍，發病后期維持相對恒定；孢子密度在發病前期和中期顯著增加，比未發病和發病后期增加了31.32%～49.48%，且發病后期降低至和未發病無差異。這一結果與前人的研究不同，可能是因為不同的病害類型和不同的土壤質地、宿主類型會引起AMF 的不同應答，寧夏枸杞種植園土壤偏鹽堿[1]，而與本試驗結果不一致的病害大多是南方酸性土壤發生的病害；另外，田間調查發現，寧夏枸杞根腐病在3 年齡以上的植株才開始發病[2-5]，病原菌在土壤里的潛伏周期較長，侵染過程較慢，發病時間相對來說較長，因此，宿主植物有充足的時間招募包括AMF 在內的土壤益生微生物來抵御病原菌侵染[24]，從而致使AMF 孢子密度和侵染率都較未發病時增加。

球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP）是由AMF 產生的具有良好熱穩性的特殊糖蛋白，能夠促進土壤團聚體形成，保持團聚體穩定性，增加土壤有機碳庫，提高植物抗逆能力[25]。關于植物病害的發生對AMF 釋放代謝物GRSP 的研究較少。程申等[23]研究結果表明，根腐病的發生可降低GRSP 含量，尤其是總球囊霉素相關土壤蛋白（TGRSP）含量。本研究結果表明，寧夏枸杞根區土壤中易提取球囊霉素相關土壤蛋白（EEGRSP）和總球囊霉素相關土壤蛋白（TGRSP）含量均隨著根腐病的發生而增高，EEGRSP 含量在發病中期達到最高值，TGRSP 含量在發病后期達到最高值，總體在發病后期維持相對恒定。有研究表明，土傳病害的發生和不同土壤質地有關[26]，可能是AMF 通過產生GRSP，改善土壤質地，增加通透性，從而改變整個土壤微環境，抑制病原菌繁殖。

AMF 是土壤微生物中重要的類群，土著AMF長期存在于土壤中，已適應土壤的生態條件且具備良好的生存優勢，病原入侵前植物與AMF 建立共生體可提前誘導寄主建立抗病防御體系，有助于預防土傳病害的發生[27]。本研究發現，所有根腐病發病時期寧夏枸杞根區土壤中球囊霉屬和無梗囊霉屬多度均比未發病時降低；隔球囊霉屬剛好相反，所有發病時期多度均高于未發病時；根孢囊霉屬則是先增高后降低。在未發病時，土壤中含量較高的球囊霉屬和無梗囊霉屬，可能作為后續開發防控枸杞根腐病的AMF 菌劑候選菌。其他植物病害防控研究也有報道，球囊霉屬和無梗囊霉屬AMF 具有很好的生防潛力[11-12]。

土壤是土壤微生物依存的基質，土壤理化性質會影響包括土傳病害在內的所有微生物種群增長及群落構建[28]。北蒼術根腐病[29]、石柱黃連根腐病[30]、香蕉枯萎病[31]、辣椒疫病[32]等研究發現，罹病植株土壤理化性質與健康植株有顯著差異，但差異規律在各個病害上并不完全一致?？赡芤蜓芯繕拥赝寥?、栽培農藝措施（尤其施肥量）、病原菌種類、宿主植物及其參與物質循環的根區微生物群落不同而結果不同。本研究發現，根腐病發生與寧夏枸杞根區土壤中全氮、全鉀、速效鉀含量有關，土壤全氮含量增高和全鉀、速效鉀含量降低，有可能促進寧夏枸杞根腐病的發生。氮元素過多容易造成植物生長過快，莖稈細弱，纖維素、木質素減少，組織柔嫩，體內可溶性非蛋白態氮含量過高也容易造成土壤酸化、土壤板結硬化、透氣性差，致使土壤微生物由細菌型向真菌型轉變，容易遭受病蟲害感染；而鉀元素能使植株的葉片和枝干更加強壯，提高植株抗病、抗寒、抗旱、抗倒伏、抗鹽能力[33]。因此，在寧夏枸杞種植過程中降氮增鉀有利于防控根腐病。

4 結論

（1）根腐病發生顯著影響寧夏枸杞根區土壤AMF 定殖率、孢子密度、群落組成、多樣性、球囊霉素相關土壤蛋白含量，但變化規律不一致。

（2）在寧夏枸杞根區土壤降氮增鉀，接種球囊霉屬和無梗囊霉屬AMF 可能防控根腐病的發生。