可降解材料生物降解率的檢測方法比較

趙 偉,李 宇,張 瑋,朱科樺,周 珂,呂 晴,劉詩嫻,葛振鳴

（1.華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室,上海 200241;2.3M 中國有限公司 中國研發中心,上海 200233）

0 引 言

塑料由于其較低的成本、高耐用性和強柔韌性且易于加工和運輸等優點,已被廣泛應用于建筑、醫療和農業等各個行業.但大量難降解的塑料制品廢棄后,由于不當處置會導致環境污染、動物誤食后死亡等嚴重后果.因此,近年來我國政府大力倡導和支持可生物降解材料的應用.因其具有良好的降解性能,且最終降解產物(CO2和H2O 等)不會對環境造成威脅,所以得到了許多科研機構及生產企業的青睞.在企業研發及生產可降解材料的過程中,檢測產品的降解性能是極為重要的一個環節,而選擇適宜的方法是進行降解率檢測的前提條件.

現行標準的塑料生物降解方式可根據氧氣條件和降解介質的不同分為淡水需氧環境(GB/T 19276.2)、海水需氧環境(ISO 22404)、土壤需氧環境(GB/T 22047)、堆肥需氧環境(GB/T 19277)、水性培養液厭氧消化環境(ISO 14853)、受控污泥厭氧消化環境(ISO 13975)等.測量方法主要包括測定降解過程中CO2的產量和密閉呼吸計中需氧量兩種,降解檢測時間最長可至24 個月.國際上的主流標準,包括美國標準ASTM D5338、歐盟標準EN 14995 和我國標準GB/T 19277,都是在有氧堆肥條件下降解材料,同時采用測定CO2產量的方法來計算降解率.然而,現行標準方法測定材料降解率的時間普遍較長(約6 個月),這不利于企業對可降解材料降解性能的快速評估,從而延遲了產品的研發和生產周期.因此,在現有的執行標準下,優化降解材料的處理方法以提高材料降解率的測定效率是十分必要的.

塑料的降解受到環境中非生物因素和生物因素的共同影響,降解方式有光降解、熱降解、機械降解和生物降解[1].在生物降解過程中,主要是由動物、植物、微生物和酶發揮作用[2],其中微生物降解得到了廣泛研究.許多微生物種群都具有塑料降解能力,如芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)微生物對聚合物有較好的降解效率[3].特定微生物主要通過在聚合物表面定殖,形成一層特殊的生物膜,并進一步分泌降解相關酶類來加速材料的降解.但在培養溫度較高及測試周期較長的情況下,微生物的活性可能會受到抑制.而嗜熱菌(thermophilic bacteria)在需氧或兼性厭氧環境下均可生長,而且會分泌降解聚合物內部結構的熱穩定性酶,高于常溫的溫度也有利于嗜熱菌在降解實驗中發揮作用[4-5].Skariyachan 等[6]研究表明,從污水處理廠和垃圾填埋場中篩選出的兩種嗜熱菌的共同作用增強了對聚乙烯(polyethylene,PE)和聚丙烯(polypropylene,PP)聚合物的降解.因此,篩選適宜的菌株進行混合培養,有利于提高產品生物降解率測定的效率[2].

本研究共采用了4 種不同的降解處理方法,包括兩種標準方法和兩種特定微生物添加方法.測試材料為生產環保膠帶所用的原紙、薄膜材料及膠帶成品.通過評估材料在不同處理下的生物降解速率,篩選出能夠更加有效和快速降解材料的方法,為企業縮短研發和生產周期等提供新的思路.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

根據中華人民共和國國家標準《受控堆肥條件下材料最終需氧生物分解能力的測定采用測定釋放的二氧化碳的方法第1部分: 通用方法》(GB/T 19277.1—2011)[7],采用色譜級微晶纖維素(上?；瘜W試劑公司)作為正控制參比材料.受測材料來自3M 中國有限公司提供的環保膠帶(鑒于商業保密協議,未給出材料型號與配方),包括原紙、PLA(polylactic acid)薄膜和膠帶成品3 種材料.試樣材料基本參數如表1 所示.

表1 受測材料基本參數Tab.1 Basic parameters of the test materials

其他實驗試劑和材料主要包括氫氧化鈉(NaOH,分析純,國藥集團)、營養瓊脂(北京陸橋技術股份有限公司)、枯草芽孢桿菌(3M 中國有限公司)、嗜熱菌(鑒于商業保密協議,未給出菌株名稱,3M 中國有限公司)、腐熟堆肥料(上海蔓香園林綠化有限公司)、蛭石(上海蔓香園林綠化有限公司).

1.2 實驗裝置與測定原理

實驗裝置簡圖如圖1 所示.氣泵和1 mol/L NaOH 用來提供無CO2的空氣,生物降解培養瓶中排放出的氣體可直接由紅外氣體分析儀進行測量.

圖1 測定材料生物降解率的裝置示意圖Fig.1 Layout of the test system adopted for measuring material biodegradation rates

受測材料與受控堆肥混合后,受測材料在需氧生物分解過程中會產生CO2、水及腐殖質等物質.在生物降解實驗過程中連續監測每日產生的CO2量,并計算CO2累積釋放量.生物降解率即為實驗周期內受測材料的CO2累積釋放量和CO2理論釋放量之間的比值.

整個測試周期所需要的儀器設備包括電熱恒溫培養箱、氣泵和紅外氣體分析儀Li-840A(美國Li-Cor 公司).

1.3 方法設計與實驗步驟

根據GB/T 19277.1—2011 的技術要求,測定材料生物分解能力可以采用堆肥和活化蛭石兩種底物作為受測材料的反應固床.本研究設計了4 種不同的處理方法,對受測材料進行生物分解實驗.

方法1: 將600 g 的腐熟肥料和100 g 的受測材料(預先進行裁切,約5 mm × 5 mm)混合均勻,放置在3 L 的培養瓶中.使用超純水將混合物的相對濕度調節至50%～ 60%.培養瓶頂端有兩個直徑為7 mm 的氣孔,用來連接氣體分析儀和放有堿溶液的洗氣瓶.記錄下頂部空間體積用于后續的計算.

方法2: 將600 g 的蛭石和100 g 的受測材料(預先進行裁切,約5 mm × 5 mm)混合均勻,放置在3 L 的培養瓶中,添加500 mL 腐熟肥料浸提液,并配置營養液[7].使用超純水將混合物的相對濕度調節至50%～ 60%.培養瓶頂端有兩個直徑為7 mm 的氣孔,用來連接氣體分析儀和放有堿溶液的洗氣瓶.記錄下頂部空間體積用于后續的計算.

方法3: 將600 g 的蛭石和100 g 的受測材料(預先進行裁切,約5 mm × 5 mm)混合均勻,放置在3 L 的培養瓶中,添加2.0 g 營養瓊脂和20 mL 枯草芽孢桿菌菌懸液(1 × 108CFU/mL),并配置營養液[7].使用超純水將混合物的相對濕度調節至50%～ 60%.培養瓶頂端有兩個直徑為7 mm 的氣孔,用來連接氣體分析儀和放有堿溶液的洗氣瓶.記錄下頂部空間體積用于后續的計算.

方法4: 將600 g 的蛭石和100 g 的受測材料(預先進行裁切,約5 mm × 5 mm)混合均勻,每個試驗容器中加入2.0 g 營養瓊脂和20 mL 嗜熱菌菌懸液(1 × 108CFU/mL),并配置營養液[7].使用超純水將混合物的相對濕度調節至50%～ 60%.培養瓶頂端有兩個直徑為7 mm 的氣孔,用來連接氣體分析儀和放有堿溶液的洗氣瓶.記錄下頂部空間體積用于后續的計算.

實驗包括空白組(不加入受測材料)、參比組(纖維素)、受測材料組,每組3 個重復.樣品混合后,使用水飽和的、不含CO2的、經1 mol/L NaOH 溶液吸收過的空氣對混合物進行曝氣處理,使用帶彈簧止水夾的乳膠管將培養瓶密封后放入恒溫培養箱,培養溫度為(58±2)℃.在實驗過程中,每周攪拌一次混合物,防止底部板結影響微生物的分解作用,隔3～ 4 d 根據實際情況補充水分,保證混合物的相對濕度.每隔約24 h 對每個培養瓶中產生的CO2進行測定,并計算材料的生物分解率.當降解率曲線處于上升期后的平穩狀態時,此時的降解率即為材料在該方法下的最終生物降解率,測試周期為60 d.

1.4 分解率計算和數據分析

依照標準GB/T 19277.1—2011[7],絕對分解率(DT)公式:

式(1)中:DT為生物絕對分解率(%),TCO2為測試組的CO2累積釋放量(g),BCO2為空白組的CO2累積釋放量(g),tCO2為試驗材料的CO2理論釋放量(g).

相對分解率(DR)公式:

式(2)中:DR為生物相對分解率(%),DT-M為材料的絕對分解率(%),DT-R為參比的絕對分解率(%).

最終結果表示為每個處理中3 個重復的平均值,使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)多重比較相結合,檢測在4 種不同的處理方法下,不同材料降解率的顯著變化(p＜0.05).所有數據的分析使用Microsoft Excel 2019 和SPSS 20.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)完成,并且使用Origin 2018(Origin Lab,Northampton,MA,USA)繪圖.

2 結果

2.1 材料在方法1(接種物: 腐熟堆肥料)下的降解情況

如圖2 所示,在使用方法1 時,纖維素和原紙的CO2累積釋放量的曲線具有相似的時間變化趨勢,兩種材料都在實驗開始的前8 天快速分解,在第10 天后都進入平穩階段.PLA 薄膜的分解在實驗30 d 后趨于穩定.但對于膠帶成品來說,在60 d 的實驗周期中并沒有快速降解階段,CO2的累積釋放量變化也較為平緩.在60 d 的實驗周期中,使用方法1 測得的纖維素絕對降解率為77.0%,原紙絕對降解率為66.3%,PLA 薄膜絕對降解率為62.6%,原紙和PLA 薄膜的相對降解率都超過了80%.膠帶成品的絕對降解率僅為6.4%.

圖2 方法1 處理下CO2 累積釋放量(a)和生物降解率(b)的變化(±SD)Fig.2 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 1(±SD)

2.2 材料在方法2(接種物: 蛭石+腐熟堆肥浸提液)下的降解情況

如圖3 所示,在使用方法2 時,受測材料在前10 天都有一定程度的分解,纖維素在第10～ 14 天內快速分解,第20 天后進入穩定期.PLA 薄膜在實驗第26 天,CO2累積釋放量達到高峰值后趨于穩定.原紙和膠帶成品兩種材料的降解在第9 天開始加快,一直持續到第30 天左右.在60 d 的實驗周期中,使用方法2 測得的纖維素絕對降解率為75.2%,原紙絕對降解率為67.7%,PLA 薄膜絕對降解率為70.7%,原紙和PLA 薄膜的相對降解率都超過了90%.膠帶成品的絕對降解率為20.1%.

圖3 方法2 處理下CO2 累積釋放量(a)和生物降解率(b)的變化(±SD)Fig.3 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 2(±SD)

2.3 材料在方法3(接種物: 蛭石+芽孢桿菌)下的降解情況

如圖4 所示,在使用方法3 時,纖維素和原紙在降解周期的前10 天快速分解,然后進入穩定期.PLA 薄膜的分解階段主要集中在前40 天,并且第20～ 40 天的降解速率高于第0～ 20 天的降解速率.膠帶成品的降解過程具有明顯的遲滯期,在第20 天左右快速分解,而后分解速率降低.在60 d 的實驗周期中,使用方法3 測得的纖維素絕對降解率為71.0%,原紙絕對降解率為64.3%,PLA 薄膜絕對降解率為66.3%,原紙和PLA 薄膜的相對降解率都超過了90%.膠帶成品的絕對降解率為27.7%.

圖4 方法3 處理下CO2 累積釋放量(a)和生物降解率(b)的變化(±SD)Fig.4 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 3(±SD)

2.4 材料在方法4(接種物: 蛭石+嗜熱菌)下的降解情況

在使用方法4 時,相比于其他3 種方法,膠帶成品和PLA 薄膜的CO2累計釋放量達到相對穩定狀態所用的時間更長,持續了40 d 左右(圖5).纖維素和原紙的快速分解主要集中在前8 天,沒有出現分解前的遲滯期.在60 d 的實驗周期中,使用方法4 測得的纖維素絕對降解率為71.2%,原紙絕對降解率為63.5%,PLA 薄膜絕對降解率為70.2%,原紙和PLA 薄膜的相對降解率都超過了90%.膠帶成品的絕對降解率為48.2%,相對降解率為69.7%.

圖5 方法4 處理下CO2 累積釋放量(a)和生物降解率(b)的變化(±SD)Fig.5 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 4(±SD)

2.5 材料在4 種方法間降解率的比較

根據執行標準GB/T 19277.1—2011 的要求,實驗進行45 d 后,參比材料的生物分解率超過70%才為有效.因此,本實驗最終結果達到規定標準.原紙在各種方法下的降解率差異不大(表2).PLA 薄膜在方法2、3、4 下的相對降解率均顯著高于方法1(p＜0.05).膠帶成品的降解率隨著方法的優化顯著提高(p＜0.05,表2),且在使用方法4 時測得了降解率的最大值,體現出快速降解的趨勢.

表2 試樣在4 種方法處理下的材料降解率的比較Tab.2 Comparisons between the degradation rates of samples obtained using the four methods

3 討 論

本研究用于測試的材料為纖維素(參比)、原紙、PLA 薄膜和膠帶成品.纖維素按照GB/T 19277.1—2011 要求的正控參比材料,降解率范圍在71.0%～ 77.0%,這與多數研究的試驗結果一致.例如,于鏡華等[8]測試相同來源的纖維素生物降解率為73%,翁文宣等[9]的測試結果為76.9%.相對于參比材料的一致性,測試材料通常因研究而異,包括生物可降解的聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)及不同材料成分的塑料制品[8,10-11].由于受測可降解產品一般為復合材料,故測試結果也具有一定的差異.例如,本研究中在堆肥條件下測得的PLA 薄膜的降解率范圍在62.6%～ 70.7%,謝淑華等[12]對PLA 膜袋的試驗結果為64.2%,扈蓉等[13]測得PLA 膜片的生物降解率為88.4%.

有研究表明,生物可降解材料在自然環境條件下的降解效速率較慢[14],且降解率低于受控環境下降解效率.Al Hosni 等[15]在受控條件和自然環境下測試了4 種復合材料(分別是PHB(poly-βhydroxybutyrate)、PCL、PLA、PBS)的生物降解率,結果表明,在較高溫度的控制環境下,4 種聚合物都具有明顯的重量損失,而在自然環境中除了PCL 外其他材料并沒有出現明顯的變化.同樣地,Kim 等[16]也發現PBS 的降解率在受控環境下比自然條件下高得多.有些研究證明,通過添加葡萄糖等額外碳源[17]、紫外線提前處理塑料薄膜[18]、熱處理塑料薄膜[19]、接種可降解塑料的菌種[20]等方法都能夠提高傳統材料的重量損失百分比,但其測試周期長(通常時間超過90 d 甚至達到1 年),并且效果有限(重量損失小于40%,甚至低于10%).因此,在室內受控堆肥條件下進行生物分解試驗時,通過設計試驗處理方法從而加速塑料的降解效率是有必要的.

本研究結果表明,在使用方法2、3、4 進行測試時,纖維素和原紙均在前10 天快速降解,隨后降解率趨向穩定.這是因為原紙材料主要成分是植物纖維,其纖維素鏈通過氫鍵連接,植物纖維長鏈斷裂是其降解過程的初始步驟[21].微生物分泌產生的降解酶對纖維素具有高效的降解作用.比如,芽孢桿菌和假單胞菌會分泌高活性的纖維素酶,從而可將其分解成低分子量化合物(如寡糖類、多糖類物質等)[22-23].而以上兩種材料在方法2 下的降解期集中在第10～ 20 天,這可能是由于在沒有外源添加微生物的條件下,腐熟堆肥浸提液中的微生物活性略低于原始堆肥,微生物需要一段時間的生長期再作用于受測材料.PLA 是一種以乳酸單體合成的、具有良好的生物降解性能的高分子聚合物,有氧條件下會被降解為終產物CO2和H2O[24].但在PLA 膜的制備過程中,通常會加入氯仿、冰乙酸、乙酸甲酯等溶劑用于溶解PLA,這可能會影響其降解性能.因此,受測材料降解機理和材料物化性質的差異可對降解現象的不同作出解釋.

在不同方法下,原紙和PLA 薄膜的降解率無顯著差異,而膠帶成品在方法1 和方法2 下的降解率較低,在方法3 和方法4 下的降解率較高.這可能是因為膠帶成品在性質上屬于成分復雜的復合高分子聚合物,通常由離層型(塑料薄膜)、基材層(載體)及膠粘層(膠質)共同構成[25].在堆肥過程中,微生物需要對膠帶成品進行逐層降解,復雜的結構使其對降解接種物有更高的選擇性,降解過程中受到的影響也更為復雜.比如,較高的堆肥溫度不利于非嗜熱微生物的生長和繁殖,還可能會導致微生物死亡以及酶降解活動停止,從而會影響膠帶成品的最終降解率[26].同時,方法1 和方法2 中的營養物和能量隨著試驗時間的增加會被微生物逐漸消耗,需要加入額外的能量來源以促進微生物的生長和生物降解[17,27],而不同的培養基通?？梢蕴峁┎煌臓I養成分,包括碳源、氮源、生長因子和無機鹽等[28],這有利于微生物的生長代謝和繁殖.因此,本研究為進一步加快材料的降解速率,在方法3 中加入了枯草芽孢桿菌菌懸液.芽孢桿菌屬在塑料降解中發揮著重要作用,有研究表明,一種從塑料堆肥中提取出的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)會導致線性低密度聚乙烯(linear low density polyethylene,LLDPE)表面破碎[29];從土壤中分離得到的一種短小芽孢桿菌菌株(Bacillus pumilusstrain 1-A)對PBS 的降解率達到了90%(14 d),對聚丁二酸-己二酸丁二酯(adipic acid-1,4-butanediol-succinic acid copolymer,PBSA)樹脂更是達到了100%[30].參與塑料生物降解的微生物存在于土壤、海水、堆肥等多種自然環境中,可以通過分泌不同的酶發揮作用,利用塑料作為碳源來加快聚合物的降解[25].多項研究已證明了微生物具有優良的可降解性能,在接種假單胞菌(Pseudomonassp.)一個月后的聚苯乙烯(polystyrene,PS)上可提取到對二甲苯等多種降解副產物[31];將PCL 和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜接種在混合真菌懸液中28 d 后,薄膜出現明顯的質量損失[32].本研究結果也證實了在加入相應菌懸液后,膠帶成品的降解率有所提高.

本研究還發現,膠帶成品在方法4 下的降解速率得到了較大的提升,這表明添加嗜熱菌對塑料降解具有促進作用,且效果好于非嗜熱特性的菌株.溫度是影響塑料的生物降解過程的重要因素之一[33],但在這種特殊環境下,隨著降解時間的增加,方法3 所加入的芽孢桿菌的作用可能會受到高溫的限制.而嗜熱菌在需氧或兼性厭氧環境下均可生長,其芽孢極具耐熱性,較高的生長溫度有利于嗜熱菌在該塑料降解實驗中發揮作用.曾有研究表明,嗜熱艾登短芽孢桿菌(Brevibacillus aydinogluensis)可使得聚乙烯 醇(polyvinyl alcohol,PVA)降解率達到90%[34];棲熱菌屬(Thermusspp.)和芽孢桿菌(Bacillusspp.)在高溫下可高效降解有機污染物PAHs[35];一種新型的嗜熱脂肪地芽孢桿菌菌株(strain A-2)可對原油重烴進行降解[36].還有研究指出,褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)分泌的胞外聚酯水解酶在55℃下作用3 周,對低晶體聚對苯二甲酸乙二酯的降解率可達50%[34].此外,塑料的降解過程并不能只依賴單一菌株[37-38],混合不同的嗜熱菌用于生物降解實驗也是可以選擇的.

4 結 論

本研究通過設計不同的材料降解方法,以達到快速測定材料生物降解率的目的.結果表明,4 種方法中參比材料(纖維素)在60 d 的實驗周期內絕對分解率均超過70%,滿足了標準要求.實驗材料包括原紙和PLA 薄膜的降解率(除PLA 薄膜的相對降解率以外)在4 種處理方法下無顯著變化.測試膠帶成品時,在方法1、方法2 下其降解率上升速率較低.而使用方法3(蛭石+芽孢桿菌)和方法4(蛭石+嗜熱菌)時,膠帶成品在60 d 內降解率顯著高于前兩種方法,且在方法4 下效果最佳.因此,優化降解方法大幅縮短了材料分解到達穩定期的時間,有利于加快材料降解率測定周期,可以一定程度上提高企業的研發效率.