酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯工藝優化

姚新卯　黃振波　粟暉

摘 要：以硬脂酸和乙二醇為原料，探索得到脂肪酶作催化劑、反應條件溫和、合成綠色的乙二醇硬脂酸酯合成方法。采用紅外光譜表征、拉曼光譜結合獨立分量分析（independent component analysis，ICA）分離算法對合成產物快速定性分析，判斷合成產物含有目標產物的結構特征，并測定產物的酸值，結果表明脂肪酶催化合成乙二醇單硬脂酸酯的方法可行。通過單因素及正交實驗設計對酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯的工藝進行優化，得到最優的工藝條件為：反應溫度為70 ℃，反應時間為3 h，酸醇摩爾比為2∶1，催化劑質量分數為4%，分子篩質量分數為5%；在優化條件下平行3次實驗，平均酯化率達93.68%；脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯效果較好，為乙二醇硬脂酸酯的綠色合成提供了新方法。

關鍵詞：酶催化；乙二醇硬脂酸酯；光譜定性；酯化率；工藝優化

中圖分類號：TQ 658? ?DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.04.018

0 引言

乙二醇硬脂酸酯是一種常用的珠光劑，是以硬脂酸和乙二醇為原料，在催化劑作用下發生酯化反應合成的，在紡織、涂料、造紙、化妝等[1]領域中有廣泛應用。目前常用的催化劑主要有磷酸、硫酸、對甲苯磺酸[2]、磷鎢酸[3]和氧化鋅[4]等，轉化率較高，但存在反應溫度高、副產物較多[5]、產品易被碳化[6]等缺點，且產生的廢液污染環境。因此，探索一種反應條件溫和、工藝簡單、綠色節能的乙二醇硬脂酸酯合成方法具有重要意義。脂肪酶作為水解、酯化等反應的高效生物催化劑，具有對環境友好、反應條件溫和、無毒無刺激等優點[7-8]，在聚乙二醇硬脂酸酯[9]、乙酸芳樟酯[10]、檸檬酸三乙酯[11]、衣康酸酯[12]等合成中得到應用，但脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的研究尚未見報道。

本文選用脂肪酶作催化劑合成乙二醇硬脂酸酯，采用紅外光譜、拉曼光譜結合獨立分量分析（independent component analysis，ICA）方法分析合成產物，探索脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的可行性。通過單因素及正交實驗設計，探討反應溫度、反應時間、酸醇摩爾比、分子篩質量分數等因素對酯化率的影響，對酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯的工藝進行了優化。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

廣域透射拉曼光譜儀（PERT1000，西派特（北京）有限公司），傅里葉變換紅外光譜儀（Frontier，美國PE公司），電子分析天平（CP214，奧豪斯儀器有限公司），智能磁力攪拌器（DF-101S，河南愛博特科技發展有限公司）。

1.2 實驗試劑

乙二醇（AR，西隴化工股份有限公司），硬脂酸（AR，上海麥克林生化科技有限公司），脂肪酶（Novozym 435，杭州創科生物科技有限公司），乙二醇單硬脂酸酯（單酯）（AR，上海麥克林生化科技有限公司），乙二醇雙硬脂酸酯（雙酯）（AR，山東優索化工科技有限公司），5A分子篩（AR，上海麥克林生化科技有限公司），氫氧化鉀（AR），無水乙醇（AR），鄰苯二甲酸氫鉀（AR）。

1.3 脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的可行性實驗

以0.01 mol（摩爾質量為284.48 g/mol）的硬脂酸為基準，在50 mL三口燒瓶中，依次加入硬脂酸2.50 g、乙二醇3.90 mL及分子篩0.30 g；71 ℃水浴加熱，待物料完全熔化后，加入0.02 g的脂肪酶。150 r/min磁力攪拌，反應3 h。反應結束后，用蒸餾水清洗合成產物3次以上，去除未反應的乙二醇、硬脂酸、分子篩和脂肪酶，干燥后得到6.12 g乳白色蠟狀固體，熔點為59～62 ℃，將合成產物記為M1。

采用KBr壓片法采集對照品（硬脂酸、單酯、雙酯）、M1的紅外光譜（掃描范圍450～4 000 cm-1，掃描3次，分辨率4 cm-1，數據間隔0.1 cm-1），對M1進行表征 [13]。

采集對照品與M1拉曼光譜（積分時間500 ms，平滑點數0，中心波長532 nm，功率等級5，拉曼位移為200～3 442 cm-1，每個樣本采集10次），通過拉曼光譜結合獨立分量分析（ICA）分離算法 [14-15]求出分量（ICs），判斷M1是否含有目標產物。根據《化妝品用原料 乙二醇二硬脂酸酯》（GB/T 34820—2017）[16]測定M1酸值，驗證脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的可行性。

1.4 脂肪酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的單因素實驗

在酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯方法可行基礎上，通過單因素實驗，探索不同反應時間、反應溫度、酸醇摩爾比、催化劑質量分數、分子篩質量分數等因素對酯化率的影響，得到各因素的較優水平。合成步驟同1.3。

1.5 正交實驗設計優化合成工藝條件

采用[L9（34）]正交實驗設計，以酯化率為指標，選取反應時間、酸醇摩爾比、催化劑質量分數、分子篩質量分數等單因素實驗結果的最佳條件與2個鄰近點，考察不同水平因素對酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯的影響，因素水平表如表1所示。按1.3的合成步驟，固定硬脂酸的用量，依照表1的條件進行實驗，得出優化工藝條件，并對其進行驗證，平行3次。

2 結果與討論

2.1 酶催化合成乙二醇硬脂酸酯的可行性實驗結果分析

2.1.1 產物紅外光譜表征

將對照品與M1的紅外譜圖進行對比，結果如圖1（a）所示，發現在870 cm-1和1 110 cm-1處出現了很強的C—O—C基團特征吸收峰，1 704 cm-1處出現了羧基峰，2 920 cm-1和2 848 cm-1處出現了羥基伸縮振動吸收峰，1 739 cm-1處出現了酯基峰[17-18]，說明M1主要為乙二醇單硬脂酸酯，并截取4階導數譜的特征峰波段1 730～1 740 cm-1做圖，結果如圖1（b）所示。

從圖1（a）可發現在1 739 cm-1處M1出現了明顯的酯羰基伸縮振動吸收峰，含有目標產物結構特征。從圖1（b）可看出目標產物及M1有顯著的特征吸收峰，而硬脂酸未出現吸收峰，說明M1含有目標產物，表明酶法催化合成乙二醇單硬脂酸酯可行。

2.1.2 ICA判斷合成產物

各對照品和M1樣本光譜圖如圖2所示，從圖2可發現在波數為1 369 cm-1處M1有顯著的目標產物特征峰。

ICA 能夠從復雜的組分體系中獲得輸出分量與源信號一致的分離結果[19]，從未知多元混合體系中確定待測組分，實現快速定性分析。截取在181～2 200 cm-1與2 300～3 230 cm-1間的特征峰數據，采用自編算法，求取樣本光譜的4階導數后，再分離得到M1的ICs，從而求出ICA分離算法解出的合成產物M1各分量與源光譜的相關系數，其中IC1與單酯相關系數r=0.994 6，IC3與雙酯的相關系數達到0.960 4，說明酶法催化合成了目標產物。

原料硬脂酸酸值為207.69 mgKOH/g，測定M1的酸值為63.68 mgKOH/g。M1的酸值較大，說明酯化不夠成功，但M1酸值降低了近3倍，表明酶法催化合成乙二醇單硬脂酸酯是可行的。

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 反應時間對酯化率的影響

將酸醇摩爾比為1∶4、催化劑質量分數為1%、分子篩質量分數為1%等因素條件放大4倍的樣品，在攪拌轉速為150 r/min、溫度為75 ℃的水浴鍋中反應5 h，每隔1 h取約0.6 g樣品測定酸值，得出酯化率，酯化率隨時間變化如圖3所示。

隨著反應時間的增加，酯化率先增加后降低，可能與酶的活性和反應逆向移動有關，反應時間越長，脂肪酶的活性漸漸降低，反應逐漸逆向進行，當反應酯化率趨緩時，應停止反應，或添加酶用量促進反應正向移動，可抑制反應逆向進行，反應3 h的酯化率達80.04%，為最佳。

2.2.2 反應溫度對酯化率的影響

將酸醇摩爾比為1∶4、催化劑質量分數為1%、分子篩質量分數為1%等因素條件的樣品，在攪拌轉速為150 r/min，溫度分別為60 、65、70、75、80 ℃的反應體系中反應3 h，反應結束清洗合成產物，測定樣品酸值，得出酯化率。但反應溫度為80 ℃的樣品酸值接近原始酸值，未發生酯化。酯化率隨反應溫度變化如圖4所示。

溫度是影響酶活性和穩定性的重要因素，脂肪酶活性溫度在25～80 ℃，超出最佳范圍，酶將失去活性。選擇60～80 ℃的溫度進行試驗，酯化率先增加后降低，反應溫度為80 ℃的樣品無酯化率，說明脂肪酶已失去活性。應控制反應溫度在硬脂酸熔點與脂肪酶活性范圍內，則有利于反應正向進行，從而可提高合成產物的酯化率。在70 ℃下，酯化率達87.19%，為最佳。

2.2.3 酸醇摩爾比對酯化率的影響

將酸醇摩爾比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，催化劑質量分數為1%、分子篩質量分數為1%的各樣品，在攪拌轉速為150 r/min、溫度為70 ℃的水浴鍋中反應3 h，反應結束后，清洗合成產物，測定樣品酸值，得出酯化率，酯化率隨酸醇摩爾比的變化如圖5所示。

隨著酸醇摩爾比中醇的比例增加，酯化率逐漸降低，可能是過量的乙二醇會使pH值變大，從而影響酶的活性，導致酯化率降低。酸醇摩爾比為2∶1時，酯化率為87.32%，達到最佳。

2.2.4 催化劑質量分數對酯化率的影響

將酸醇摩爾比為2∶1，催化劑質量分數分別為1%、2%、3%、4%、5%和6%，分子篩質量分數為1%的各樣品，在攪拌轉速為150 r/min、溫度為70 ℃的水浴鍋中反應3 h，反應結束后，清洗合成產物，測定樣品酸值，得出酯化率，酯化率隨催化劑質量分數的變化如圖6所示。

脂肪酶是促進反應的關鍵因素，脂肪酶質量分數增加，酯化率呈現上升趨勢，當酶質量分數為5%時，酯化率增加平緩，可能是酶質量分數的持續增加會限制體系中反應底物的接觸，導致酯化率增加趨緩。添加適量脂肪酶能有效促進合成反應，脂肪酶質量分數過低不利于反應正向進行，過高則增加生產成本，且對酯化率影響有限。脂肪酶質量分數為5%和6%時的酯化率分別為89.61%和89.72%，差值較小，考慮到生產成本，選取質量分數為5%的脂肪酶進行后續優化實驗。

2.2.5 分子篩質量分數對酯化率的影響

將酸醇摩爾比為2∶1，催化劑質量分數為5%，分子篩質量分數分別為0、1%、2%、3%和4%等因素條件的樣品，在攪拌轉速為150 r/min、溫度為70 ℃的水浴鍋中反應3 h，反應結束后，清洗合成產物，測定樣品酸值，得出酯化率，酯化率隨分子篩質量分數的變化如圖7所示。

加分子篩有助于去除酯化反應中生成的水分。從圖7中看出，隨著分子篩質量分數升高，酯化率呈現上升趨勢，說明質量分數升高會促進反應物充分接觸，使酯化率升高。但隨著質量分數的升高，酯化率逐漸緩慢升高，說明反應生成的水分較少，質量分數升高對合成產物酯化率影響較小。分子篩質量分數為4%時，酯化率最佳，達到了86.42%。

2.3 工藝優化結果與分析

通過單因素實驗得到各因素的較優水平，為提高酯化率，采用正交法進行工藝優化。由于硬脂酸熔點及脂肪酶活性溫度在70 ℃附近，通過單因素實驗得到最佳反應溫度為70 ℃，確認該點為最優反應溫度，又因鄰近反應溫度較難控制，不將其列為正交考察。測定各條件下合成產物的酸值，進而求得酯化率，正交實驗結果如表2所示。

根據正交實驗方差分析結果做趨勢圖如圖8所示。

通過正交實驗設計優化得到最佳工藝條件為反應時間3 h、酸醇摩爾比1∶1、催化劑質量分數4%、分子篩質量分數5%。從表2及圖8結合單因素實驗結果，得到正交工藝優化的反應時間、催化劑質量分數最優條件與單因素結果相符，而分子篩質量分數與酸醇摩爾比的結果有偏差，可能是樣品雜質未徹底去除所導致的，需進一步做酸醇摩爾比實驗。分子篩質量分數達3%后酯化率增加平緩，正交分子篩質量分數為4%和5%的酯化率極差較小，繼續增加分子篩質量分數對提高酯化率可能影響較小，因此確定最佳分子篩質量分數為5%。

在正交優化條件基礎上，進一步在酸醇摩爾比分別為3∶1、5∶2、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶2的條件下做單因素實驗，酸醇摩爾比與酯化率的關系如圖9所示，酸醇摩爾比為2∶1時的酯化率達93.57%，為最佳，優于正交實驗酸醇摩爾比1∶1的酯化率，因此，確認酸醇摩爾比的最優工藝條件為2∶1。

2.4 驗證實驗

通過單因素及正交實驗得到了最優工藝條件：反應溫度70 ℃、反應時間3 h、催化劑質量分數4%、分子篩質量分數5%。在該工藝條件下進行3次平行實驗，得到的酯化率（表3）分別為93.89%、93.40%、93.75%，均值為93.68%，3組實驗均高于單因素及正交實驗各條件的酯化率。驗證了通過單因素及正交實驗探索得到的酶法催化合成乙二醇硬脂酸酯的工藝條件為優化條件。

3 結論

首先采用紅外光譜表征、拉曼光譜結合ICA分離快速定性方法，判定了酶法催化合成產物含有目標產物乙二醇單硬脂酸酯，產物酸值測定結果表明酶法催化合成乙二醇單硬脂酸酯可行。并通過單因素實驗及正交實驗設計優化得到了最優工藝條件，平均酯化率達93.68%。探索得到的工藝路線反應條件溫和、簡單、環保，為乙二醇硬脂酸酯的催化合成提供了更加綠色的方法。后續可進行酶法催化合成反應的過程分析，跟蹤過程產物的組成變化，實現單酯和雙酯可控合成，得到珠光效果較佳的乙二醇硬脂酸酯的合成工藝條件。

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Optimization of enzymatic synthesis of ethylene glycol stearate

YAO Xinmao， HUANG Zhenbo， SU Hui*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： A green synthesis method of ethylene glycol stearate was developed by reacting stearic acid and ethylene glycol catalyzed with lipase under mild reaction conditions. Infrared spectroscopy， Raman spectroscopy and independent component analysis （ICA） separation algorithm were utilized for rapid qualitative analysis of the synthesized products to judge their possession of the structural feature of the target products and gauge their acid value. The results showed that the method of catalytic synthesis of ethylene glycol monostearate by lipase was feasible. Through single factor and orthogonal experimental design， the enzymatic synthesis process of ethylene glycol stearate was optimized. The optimal process conditions were reaction temperature of 70 ℃， reaction time of 3 h， acid-alcohol molar ratio of 2∶1， catalyst mass fraction of 4%， and molecular sieve mass fraction of 5%. The average esterification rate was 93.68% through three parallel confirmation experiments under the optimized condition. The process of lipase catalyzed synthesis of ethylene glycol stearate has good esterification effect， which provides a new method for the green synthesis of ethylene glycol stearate.

Key words： enzyme catalysis; ethylene glycol stearate; qualitative spectrometric analysis; esterification rate; optimization of process

（責任編輯：于艷霞）

收稿日期：2023-01-03

基金項目：廣西自然科學基金項目（2015GXNSFAA139038）；廣西高等教育本科教學改革工程項目（2021JGB232）資助

第一作者：姚新卯，在讀碩士研究生

*通信作者：粟暉，碩士，教授，研究方向：化工過程分析技術及精細化學品開發，E-mail：suhui@gxust.edu.cn