D-塔格糖生物合成研究進展

溫鑫,劉光文,寧宇航,TESFAY Mesfin Angaw ,林建強*,任一林,林慧彬,宋欣,林建群

1(微生物技術國家重點實驗室(山東大學),山東 青島,266237) 2(青島龍鼎生物技術有限公司,山東 青島,266108)3(山東省中醫藥研究院,山東 濟南,250014)

人類的一日三餐離不開糖的攝入。食用適量的糖,不僅可以滿足人們身體機能需求,而且還可以帶來幸福感。然而,隨著生活水平的提高,人們攝入過多的糖,使得肥胖、糖尿病、齲齒、心臟病等疾病的患病率提高[1]。近些年,具有高吸收、高熱量特點的傳統食用糖(例如蔗糖、白糖、葡萄糖等)逐漸呈現出被低熱量、低吸收特點的稀有糖(例如木糖醇、赤蘚糖醇、D-阿洛酮糖等)取代的趨勢[2]。國際稀有糖協會(International Society of Rare Sugars, ISRS)定義稀有糖為自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[3]。稀有糖不僅具有甜味,而且熱量低,更重要的是具有對人體健康有益的生理功能,發展前景巨大。

稀有糖D-塔格糖,分子式為C6H12O6,分子質量為180.16,結構式如圖1所示,是D-半乳糖的同分異構體、D-山梨糖的C-3位差向異構體和D-果糖的C-4位差向異構體,外觀為白色晶體顆?；蚴前咨勰?易溶于水,微溶于乙醇,是一種天然存在的低熱量功能性甜味劑,甜度是蔗糖的92%[4],熱量是1.5 kcal/g[5]。D-塔格糖已被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)認可為一般認為安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的成分[5-7]。2014年,我國國家衛生和計劃生育委員會批準D-塔格糖為新食品原料[6]。D-塔格糖不僅具有預防齲齒和肥胖、降低血糖等作用,而且對腸道健康有益[8]。

圖1 D-塔格糖、D-半乳糖、D-山梨糖和D-果糖的結構式比較Fig.1 Structural formula comparison of D-tagatose, D-galactose, D-sorbose, and D-fructose

本文簡述了D-塔格糖的生理功能及應用,介紹了生物合成D-塔格糖所需主要的生物酶,歸納了近幾年D-塔格糖的生物合成研究進展,并對D-塔格糖的生物合成作出了展望。

1 D-塔格糖的生理功能及應用

1.1 低熱量甜味劑,可以發生美拉德反應,應用于食品

D-塔格糖的甜度是蔗糖的92%,但熱量僅為蔗糖的37.5%(蔗糖熱量為4 kcal/g)[5],是一種低熱量甜味劑。它能夠與食品中的蛋白質發生美拉德反應,從而改善食品的色澤和風味,在烘焙食品、飲料和糖果中具有重要應用。

1.2 預防肥胖,降低血糖,輔助治療Ⅱ型糖尿病

D-塔格糖是一種低熱量功能性甜味劑,可代替蔗糖等傳統甜味劑應用于食品中,可以緩解肥胖和降低血糖[9]。在醫藥保健領域,D-塔格糖可用于制備治療Ⅱ型糖尿病和肥胖的藥物[10-12]。

1.3 優異益生元,有利于人體腸道健康

D-塔格糖能夠被結腸中的腸道菌群發酵,刺激腸道內益生菌的生長,而抑制腸道內致病菌的生長[13]。另外,D-塔格糖發酵過程中能夠產生對人體腸道健康有益的短鏈脂肪酸,例如丁酸等,可促進結腸上皮細胞的生長繁殖,抑制結腸癌的發生[14]。

1.4 抗齲齒,有利于保護牙齒健康

因為D-塔格糖不能被口腔中的微生物所利用,所以有利于減少口腔中酸性物質的產生,降低牙齒腐蝕,從而有效預防牙齦炎、齲齒、口臭等牙齒疾病的發生[13]。

1.5 作為底物生產其他稀有糖醇

根據生物轉化法生產己糖策略,即Izumoring 策略[15],從D-塔格糖出發,經合適的酶催化可以得到D-山梨糖、D-塔格糖醇和半乳糖醇等具有重要生理功能的稀有糖醇(圖2)。

2 D-塔格糖的生產方法

2.1 自然提取法

自然界中的D-塔格糖主要存在于熱帶常青樹樹膠、苔蘚、地衣、熱可可、奶酪和酸奶中,含量及其微少[13,16-17]。從這些物質中直接提取D-塔格糖所需原材料用量大,成本非常高,難以實現D-塔格糖的工業化生產。

2.2 化學合成法

D-塔格糖可以由D-半乳糖通過化學合成法得到,所用化學催化劑為堿金屬鹽,其催化D-半乳糖與金屬氫氧化物發生異構化反應,生成金屬氫氧化物-D-塔格糖復合物;再經過酸中和,使得復合物釋放出D-塔格糖[13-14,18]。但是化學合成法生產D-塔格糖反應過程比較復雜,容易產生副產物,使得目的產物D-塔格糖的純度降低,給后期分離純化帶來不便,而且化學試劑的使用會造成環境負擔,不符合綠色生產理念[19]。

2.3 生物合成法

D-塔格糖的生物合成主要有兩種方式,一種是利用單酶促反應合成D-塔格糖,另一種是利用多酶促反應合成D-塔格糖。根據Izumoring 策略(圖2),選擇合適的單一的醛糖異構酶、D-塔格糖 3-差向異構酶和氧化還原酶可以分別催化D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇生成D-塔格糖。但是,D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇的價格比較高,難以真正應用于工業化生產,限制了D-塔格糖的工業化生產。當前,有研究人員選擇價格低廉的乳糖、麥芽糊精、牛奶乳清粉等作為底物,利用多酶促反應的方式合成D-塔格糖,并且取得了一定的研究成果。生物合成法生產D-塔格糖具有生產效率高、產物純度高、反應條件溫和、成本低等優點,成為D-塔格糖工業化生產的首選方法[20]。

3 單酶促反應合成D-塔格糖

3.1 L-阿拉伯糖異構酶催化D-半乳糖合成D-塔格糖

單酶法生物合成稀有糖能夠充分挖掘該酶的理化性質并應用于稀有糖的生產,具有簡便高效、酶催化劑利用率高以及生產效率高等優點。L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase,L-AI)是目前生物合成D-塔格糖研究最多的一種酶,可以催化D-半乳糖為D-塔格糖。該酶的微生物來源廣泛,包括AcidothermuscellulolyticsATCC43068[21],Bacillussubtilisstr.168[22],Lactobacillussakei23K[23],LactobacillusfermentumCGMCC2921[24],BacillusthermoglucosidasiusKCTC 1828[25],AlicyclobacillushesperidumURH17-3-68[26],BacilluscoagulansNL01[27],PseudoalteromonashaloplanktisATCC 14393[28],Geobacillusstearothermophilus[4],ClostridiumhylemonaeDSM 15053[29],LactobacillusbrevisMF 465792[30],EnterococcusfaeciumDBFIQ E36[31],BifidobacteriumadolescentisCICC 6178[32],KlebsiellapneumoniaeDSM 681[33]等。上述微生物來源的L-阿拉伯糖異構酶酶學性質如表1所示,最適反應溫度為40～75 ℃,最適反應pH值為5.0～8.0,多種金屬離子為該酶的激活劑,如Mn2+,Co2+和Mg2+。其中,大部分L-AI對L-阿拉伯糖和D-半乳糖具有底物特異性,有少部分僅對L-阿拉伯糖具有底物特異性,而對D-半乳糖無底物特異性,例如來自于Bacillussubtilisstr.168[22]和PseudoalteromonashaloplanktisATCC 14393[28]的L-AI。另外,來自于AcidothermuscellulolyticsATCC43068[21],Lactobacillussakei23K[23],LactobacillusfermentumCGMCC2921[24],BifidobacteriumadolescentisCICC 6178[32]等的L-AI酶對D-半乳糖表現出較強的底物特異性。

表1 不同微生物來源的L-AI酶學性質Table 1 Enzymatic properties of L-AI from different microbial sources

在大腸桿菌表達系統中異源表達來自于BacilluscoagulansNL01的L-AI,在 60 ℃和 pH 7.5 的條件下進行全細胞催化,當底物D-半乳糖的質量濃度為150 g/L和250 g/L時,所得D-塔格糖的轉化率分別為32%和27%,轉化時間分別為32 h和48 h[27]。利用來自于BifidobacteriumadolescentisCICC 6178的經純化的L-AI酶催化100 mmol/LD-半乳糖(含6 mmol/L Mn2+),在 55 ℃和 pH 6.5 的條件下反應10 h,D-塔格糖轉化率為56.7%[32]。在大腸桿菌表達系統中異源表達來自于KlebsiellapneumoniaeDSM 681的L-AI,底物為100 g/LD-半乳糖(含1 mmol/L Mn2+),在 50 ℃和 pH 8.0 的條件下進行全細胞催化反應30 min,D-塔格糖的轉化率為33.5%[33]。

芽孢表面展示技術是通過將目標酶與芽孢衣殼蛋白進行融合表達,依賴于芽孢衣殼蛋白的錨定作用將目標酶展示在芽孢表面,從而實現酶的固定化,固定化酶能夠在極端環境下保持催化活性,而且克服了底物和產物穿膜障礙[10],是一種有益的酶固定化方法嘗試。LIU等[16]通過芽孢表面展示技術將來源于LactobacillusfermentumCGMCC2921的L-AI展示在Bacillussubtilis168芽孢表面,得到的重組L-AI芽孢表現出相對較高的催化活性和較強的熱穩定性,在80 ℃下保存30 min仍保留87%的酶活性。利用該重組L-AI芽孢作為生物催化劑,以100 g/LD-半乳糖為底物,在70 ℃反應24 h,D-塔格糖的轉化率約為75%。GUO等[10]同樣采用芽孢表面展示技術將來源于LactobacillusbrevisPC16的L-AI展示在BacillussubtilisDB403芽孢表面,利用重組L-AI芽孢作為生物催化劑,以125 g/LD-半乳糖(含1 mmol/L Mn2+)為底物,在 67 ℃和 pH 6.5 的條件下反應28 h,D-塔格糖的轉化率為79.7%,而且重組L-AI芽孢具有良好的重復利用性能,5次循環后,比活性仍保留87%,D-塔格糖的轉化率為40.7%。芽孢表面展示技術的缺點是芽孢產量較低,難以工業化應用。表2匯總了上述催化D-半乳糖合成D-塔格糖的文獻報道。

表2 催化D-半乳糖合成D-塔格糖Table 2 Synthesis of D-tagatose from D-galactose

因為受到熱力學平衡的限制,異構酶催化的反應具有轉化率低的特點,降低了生產效率也不利于產品的分離純化。雖然提高反應溫度可以使反應平衡偏向產物一側,但是過高的溫度不僅會降低酶的活性,而且易導致糖的褐變影響產品質量,特別是在堿性條件下。因此,研發反應溫度低、反應pH偏酸性、催化活性高、耐熱性強的酶催化劑將有益于工業化應用。

3.2 D-塔格糖 3-差向異構酶催化D-山梨糖生產D-塔格糖

D-塔格糖 3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase, DTE)或D-阿洛酮糖 3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)是生物合成D-阿洛酮糖的常用酶,它們具有廣泛的底物特異性。例如,來自于Agrobacteriumtumefaciens[34]和Arthrobacterglobiformis[35]的DPE酶和來自于Caballeroniafortuita的DTE酶[36]皆能實現D-山梨糖和D-塔格糖之間的相互轉化,其中利用來自于Caballeroniafortuita的DTE酶進行生物催化時,D-塔格糖與D-山梨糖之間的平衡比為30.7∶69.3(圖3)。但是,由于D-山梨糖價格昂貴,以其為底物生產D-塔格糖在工業生產中缺乏經濟性,因此關于催化D-山梨糖生產D-塔格糖的研究不多。

A-雷達分布圖(對D-塔格糖的比活性設為100%);B-HPLC圖譜;C-平衡化圖3 重組DTE酶底物特異性的雷達分布,D-塔格糖和D-山梨糖的異構化反應HPLC圖譜和相應的平衡比(圖片修改自文獻[36])Fig.3 The radar distribution of substrate specificity of recombinant DTE, the HPLC profiles of epimerization reactions between the D-tagatose and D-sorbose, and the corresponding equilibriumratios (Image modified from reference[36])

3.3 半乳糖醇脫氫酶催化半乳糖醇生產D-塔格糖

半乳糖醇2-脫氫酶(galactitol 2-dehydrogenase,GDH)能夠在輔酶NAD+存在下將多種多價脂肪醇和多元醇分別氧化成相應的酮和酮糖。JAGTAP等[37]在大腸桿菌表達系統中異源表達來自于Rhizobiumleguminosarumbv.viciae3841的GDH酶,采用His-tag親和層析技術純化GDH酶蛋白,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得酶的分子質量為28 kDa,經凝膠過濾色譜測得酶的分子質量為114 kDa,表明該酶為同四聚體,經酶學性質分析得到其最適溫度為35 ℃,最適反應pH值為9.5,當底物為半乳糖醇時動力學參數Km為8.8 mmol/L,Kcat為835 min-1,Kcat/Km為94.9 (mmol/L)-1·min-1,表明該酶對半乳糖醇具有較好的底物特異性。該GDH酶催化半乳糖醇反應30 min,D-塔格糖的轉化率高達72%,并通過旋光性的測定,驗證氧化產物為D-塔格糖。

雖然利用半乳糖醇脫氫酶催化半乳糖醇生產D-塔格糖可以獲得較高的D-塔格糖轉化率,但是該氧化反應需要添加輔酶NAD+,并且底物半乳糖醇價格高,作為工業化生產原料缺乏經濟性。

4 多酶促反應催化廉價底物合成D-塔格糖

4.1 催化乳糖生產D-塔格糖

乳糖是由一分子D-葡萄糖和一分子D-半乳糖組成的雙糖,由于其價格遠低于D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇,成為生產D-塔格糖的首選底物。ZHANG等[38]構建了Lactiplantibacillusplantarum工程菌株,敲除了半乳糖激酶基因,阻斷D-半乳糖代謝;同時表達水解乳糖為D-葡萄糖和D-半乳糖的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-GAL)以及催化D-半乳糖為D-塔格糖的L-阿拉伯糖異構酶,從而實現一鍋法由乳糖直接生物合成D-塔格糖。利用該工程菌株在65 ℃和pH 7.5條件下進行靜息細胞反應,以175 g/L乳糖為底物,反應56 h,D-塔格糖的轉化率為33%。

4.2 催化乳清粉生產D-塔格糖

乳制品工業廢棄物作為一種廉價原料被用以生產稀有糖產品[39-40]。ZHANG等[41]報道了通過連續全細胞催化和發酵技術將一種富含乳糖的乳制品副產品,即奶酪乳清粉(cheese whey powder,CWP)轉化為3種低熱量甜味劑D-塔格糖、D-阿拉伯醇和半乳糖醇(圖4)。首先,利用一株共表達β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖異構酶的大腸桿菌工程菌株水解CWP中的乳糖為D-半乳糖和葡萄糖并將D-半乳糖異構化為D-塔格糖。隨后,利用MetschnikowiapulcherrimaE1發酵D-葡萄糖和剩余的D-半乳糖為D-阿拉伯醇和半乳糖醇。最終,利用428.57 g/L CWP(含300 g/L乳糖)得到68.35 g/LD-塔格糖、60.12 g/LD-阿拉伯醇和28.26 g/L半乳糖醇。該報道同時實現了中間代謝產物D-葡萄糖和殘留D-半乳糖的充分利用,利用工業副產物生產出一系列有價值產品。

圖4 利用連續全細胞催化和發酵技術將富含乳糖的乳制品 廢棄物生物轉化生產D-塔格糖、D-阿拉伯醇和半乳糖醇[41]Fig.4 Biocatalytic conversion of a lactose-rich dairy waste into D-tagatose, D-arabitol and galactitol using sequential whole cell and fermentation technologies[41]

4.3 催化麥芽糊精生產D-塔格糖

DAI等[42]構建了一個由α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase,αGP)、磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)、葡萄糖6-磷酸異構酶(glucose 6-phosphate isomerase, PGI)、D-塔格糖1,6-二磷酸醛縮酶(D-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase,GatZ)和磷酸乙醇酸磷酸酶(phos-phoglycolate phosphatase,PGP)組成的大腸桿菌全細胞生物催化體系,進一步利用CRISPR-Cas9技術敲除了導致中間產物代謝的基因(圖5),以增加中間產物的積累,利用最終得到的大腸桿菌工程菌株作為生物催化劑,以10 g/L 麥芽糊精為底物,反應3 h得到了3.383 g/LD-塔格糖,轉化率為33.83 g/L。

圖5 重組大腸桿菌模塊化途徑工程促進麥芽糊精生物合成D -塔格糖[42]Fig.5 Enhanced biosynthesis of D-tagatose from maltodextrin through modular pathway engineering of recombinant Escherichia coli[42]

多酶促反應在生物合成和轉化方面具有很大的潛力。與單酶促反應相比,多酶促反應可以實現更復雜的反應,實現由低成本底物生產高附加值產品,避免中間產物分離,減少中間產物抑制,甚至改變反應平衡[5]。但是由于各種酶的比例不平衡、中間產物的代謝通量不平衡以及各種酶的最佳反應條件不同等原因使得D-塔格糖的轉化率不高。后期,可以利用合成生物學、代謝工程、蛋白質工程等技術優化酶的合成與表達、提升酶的性能,增加各種酶分子間的協同作用,提高D-塔格糖的轉化率。

5 D-塔格糖的分離純化及結晶

D-塔格糖的分離純化是至關重要的一步,影響后期D-塔格糖的結晶和產品品質。黃聞霞等[43]報道了采用Ca2+型離子交換樹脂分離D-半乳糖和D-塔格糖,分離得到的D-塔格糖的純度為98%,回收率為83%;分離得到的D-塔格糖溶液再經陰陽離子交換樹脂脫鹽脫色,脫鹽率達到93%,D-塔格糖的回收率達到87%。隨后,通過添加乙醇實現D-塔格糖的結晶。蘇齊等[44]利用模擬移動床色譜分離D-塔格糖和D-半乳糖,發現當閥門切換時間為6.43 min 時,分離得到D-塔格糖的純度達到100%,回收率達到99.93%。近些年,模擬移動床色譜因其具有分離效率高、溶劑利用率高和能耗低等優勢在稀有糖的生產過程中被廣泛應用。

目前,關于D-塔格糖結晶研究的報道很少。生物合成D-塔格糖時容易產生其他雜糖(例如D-葡萄糖、D-果糖等),且工業分離時往往不能被完全除去從而會影響D-塔格糖晶體的成核和生長,影響D-塔格糖晶體的形態、粒徑分布和純度等。WANG等[45]研究了3種雜質糖(D-麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖)對D-塔格糖晶體成核速率的影響,發現雜質糖在D-塔格糖晶體表面的吸附會阻礙D-塔格糖晶體的生長(圖6)。

圖6 不同實驗條件下D-塔格糖晶體的掃描電子顯微鏡圖像[45]Fig.6 Scanning electron microscopy images of D-tagatose crystals under different experimental conditions[45]

WANG等還通過單晶生長實驗研究了雜質糖對D-塔格糖晶體生長速率的影響,并利用分子動力學模擬揭示了D-塔格糖在分子尺度上的晶體成核和生長機理。D-塔格糖工業結晶工藝目前報道不多。

6 總結與展望

作為一種功能性天然甜味劑,D-塔格糖不僅在食品領域具有重要應用價值,而且在醫藥和保健領域也發揮著至關重要的作用。我國雖然已經批準D-塔格糖為新食品原料,但是國內D-塔格糖仍未實現大規模生產,原因主要有以下幾點:a)仍未獲得一種具有生產強度高、熱穩定性強和轉化率高的酶催化劑;b)食品級宿主菌的開發力度不強;c)底物成本高;d)產物分離純化難度高。針對以上原因,建議重點研究:a)利用蛋白質工程、酶工程等技術改造酶分子結構,得到催化活性高、轉化率高、熱穩定性高的酶分子;b)開發經GRAS認證的食品級宿主菌作為生物催化載體,包括枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等;c)充分發揮多酶促反應在生物合成和轉化方面的潛力,平衡各種酶分子的表達水平以及中間代謝通量,增加各種酶分子間的協同作用,利用低成本底物大規模生產D-塔格糖;d)優化D-塔格糖分離純化和結晶工藝。通過上述努力,構建工業化生產D-塔格糖的簡單、高效、創新性工藝路線。